慢性乙肝診斷與治療中的分子指標楊志軍乙型肝炎病毒感染的現狀全球約有3.5億人感染乙型肝炎病毒，中國有1.2億人感染，其中每年約有1-2%會出現肝硬化或肝癌而死亡HBV病毒顆粒感染肝細胞及DNA復制過程慢性乙肝的診斷HBsAg持續陽性6個月以上HBV-DNA高于105拷貝/毫升ALT持續升高或反復升高慢性乙肝的分類HBeAg陽性乙肝：HBsAg、HBeAg陽性；HBV-DNA高于105拷貝/毫升；ALT持續升高或反復升高HBeAg陰性乙肝：HBsAg、anti-HBe陽性；HBV-DNA高于104拷貝/毫升；ALT持續升高或反復升高診斷慢性乙肝的指標生化指標：ALT免疫學指標：HBsAg（攜帶指標）、HBeAg（活動指標）病毒學指標：HBV-DNAHBeAg陰性乙肝缺乏病毒活動的免疫學指標，前S1可以彌補這一缺憾，提供HBeAg陰性乙肝患者病毒活動的免疫學指標HBV-DNA檢測的基本要求雖然國內HBV-DNA檢測都用實時熒光PCR法，但不同廠家的產品定量標準的賦值有差異，從而導致定量結果的差異，而準確的定量結果直接影響到對病人的診斷以及治療方案的選擇復星HBV-DNA試劑是國內唯一一個經過標準品溯源的產品，標準品直接用國家標準定標，從而保證定量結果的準確可靠，能夠為慢性乙肝患者的診斷和治療提供更為客觀的依據慢性乙肝治療的長期目標防止發展成為肝硬化或肝細胞癌在臨床上，往往以比較現實的短期目標來代替長期目標慢性乙肝治療的短期目標病毒抑制：表現為HBeAg血清轉換和HBV-DNA陰轉肝損傷程度降低：表現為轉氨酶恢復正常完全清除病毒：表現為HBsAg消失，HBsAb出現，血清和肝細胞中檢測不到HBV-DNA從目前水平來看，不可能完全清除病毒治療慢性乙肝的藥物免疫調節劑：干擾素、PEG干擾素、胸腺肽核苷類似物：拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋等拉米夫定治治療與轉氨氨酶濃度拉米夫定治治療一年后后的HBeAg陰轉轉率和HBV-DNA陰轉率率：ALT濃度度低于2倍倍正常值高高限：5%ALT濃度度介于2-5倍正常常值高限：：26%ALT濃度度高于5倍倍正常值高高限：64%HBV-DNA定量量檢測的臨臨床應用慢性乙肝診診斷治療監測和和療效評價價跟蹤隨訪預后判斷HBV-DNA定量量—慢慢性乙肝的的診斷HBsAg陽性六個個月以上ALT持續續升高或反反復升高HBV-DNA大于于105拷貝/毫升升（HBeAg陽性性）或104拷貝/毫升升（HBeAg陰性性）HBV-DNA定量量—抗抗病毒治療療的條件ALT高于于2×ULN（正常常值上限））HBV-DNA大于于105拷貝/毫升升（HBeAg陽性性）或104拷貝/毫升升（HBeAg陰性性）ATL持續續正常的患患者可暫不不進行治療療，每隔3-6個月月隨訪肝功功能、血清清病毒學標標志物和進進行肝細胞胞肝癌監測測ALT水平平在1-2倍ULN之間，需需根據具體體情況(如如肝活檢結結果等)，，在告知知患者治療療的利與弊弊、了解患患者配合程程度的前提提下，決定定是否實施施治療。無無論治療與與否均應密密切隨訪，，為治療提提供更為科科學的根據據HBV-DNA定量量—慢慢性乙肝的的治療監測測治療前檢測測患者的基基線水平（（ALT、、HBV-DNA））治療開始后后前三個月月每月一次次、以后每每三個月一一次檢測ALT、HBV-DNA，對對于HBeAg陽性性患者，還還需檢測HBeAg如果治療期期間HBV-DNA水平降低低兩個數量量級，可以以認為治療療有效HBV-DNA定量量—療療效評價（（1）生化學應答答：完全應應答：2次次監測ALT均復常常(間隔1個月)；；無應答：：ALT未未恢復正常常。值得注注意的是評評價生化學學應答時應應排除其他他藥物或疾疾病對ALT升高或或下降的影影響HBV-DNA定量量—療療效評價（（2）病毒學應答答：完全應應答按所采采用的HBVDNA檢測方方法說明書書上提供的的實驗敏感感性和檢測測范圍確定定，臨床上上一般認為為采用國際際公認的檢檢測方法或或敏感性相相當的檢測測方法檢測測HBVDNA定定量<105拷貝/毫升升或斑點雜雜交法陰性性為完全應應答；部分分應答為未未達完全應應答標準但但HBVDNA載載量下降大大于2個對對數級；無無應答為未未達上述標標準HBV-DNA定量量—療療效評價（（3）血清免疫學學應答：完完全應答為為HBeAg/抗HBe血清清轉換；部部分應答為為HBeAg陰轉但但未出現抗抗HBe；；無應答為為未達上述述標準。HBV-DNA定量量—綜綜合療效評評價（1））完全應答為為療程結束束時，生化化學、病毒毒學和血清清免疫學所所有指標均均達到完全全應答HBV-DNA定量量—綜綜合療效評評價（2））部分應答為為療程結束束時，生化化學、病毒毒學和血清清免疫學指指標介于完完全應答和和無應答之之間HBV-DNA定量量—綜綜合療效評評價（3））無應答為療療程結束時時，生化學學、病毒學學和血清免免疫學指標標均為無應應答HBeAg陰性伴HBVDNA活躍躍復制的慢慢性乙型肝肝炎患者不不進行血清清免疫學應應答評價，，但應進行行生化學和和病毒學指指標的療效效評價HBV-DNA定量量—何何時可以停停藥（1））治療前HBeAg陽陽性的患者者，治療1年時綜合合療效達到到完全應答答者建議至至少繼續用用藥6個月月，期間每每3個月1次復查ALT、HBVDNA、HBeAg/抗HBe，仍持續續完全應答答者可停藥藥觀察HBV-DNA定量量—何何時可以停停藥（2））治療前HBeAg陽陽性的患者者，治療1年時綜合合療效達到到部分應答答者建議繼繼續用藥直直至達到完完全應答后后，再繼續續用藥至少少6個月，，期間每3個月1次次復查ALT、HBVDNA、HBeAg/抗HBe，仍持續續完全應答答者可停藥藥觀察HBV-DNA定量量—何何時可以停停藥（3））治療前HBeAg陽陽性患者治治療1年時時綜合療效效仍無應答答可停藥觀觀察，或改改用其他有有效的抗病病毒藥治療療。對于有有肝臟組織織學檢查等等其它臨床床指征顯示示病情進展展合并肝功功能失代償償或肝硬化化的病人，，不宜輕易易停藥，并并應加強對對癥保肝治治療HBV-DNA定量量—何何時可以停停藥（4））HBeAg陰性伴HBVDNA活躍躍復制的慢慢性乙型肝肝炎患者，，綜合療效效完全應答答者療程至至少2年；；對于完成成1年治療療仍無應答答者可改用用或加用其其他有效治治療方案案HBV-DNA定量量—治治療后的隨隨訪無論有否治治療應答，，都應對患患者定期隨隨訪。建議議停藥后的的前3個月月每月1次次、以后每每3～6個個月1次檢檢測ALT、AST、HBV血清標志志物和HBVDNA，以及及臨床表現現和不良反反應。隨訪訪至少6-12個月月。如病情情有變化，，可隨時隨隨訪。HBV拉米米夫定耐藥藥雖然拉米夫夫定治療慢慢性乙肝療療效顯著，，但長期使使用拉米夫夫定會出現現耐藥現象象使用一年、、二年、三三年、四年年的耐藥比比率為：15-32%、38%、56%、67%一旦出現拉拉米夫定耐耐藥突變（（YMDD變異），，大多數患患者會在2-4個月月之內出現現HBV-DNA和和ALT反反彈YMDD變變異檢測采用實時熒熒光定量PCR方法法，不僅能能夠檢測出出現的突變變類型（YVDD或或YIDD），而且且能夠確定定突變株所所占比例，，對及時調調整治療方方案具有非非常重要的的意義能夠準確穩穩定的檢測測到1%的的突變株，，能夠更早早發現耐藥藥突變，盡盡早調整治治療方案HBV拉拉米夫定耐藥藥突變檢測測試劑原理理PrimerFPrimer

FPrimer

FProbeProbeProbePrimer

HBVPrimer

YIDDPrimer

YVDDHBV檢測測I突變檢測測V突變檢測測YMDD的的定量檢測測采用選擇性性引物，基基于TaqMan實實時PCR技術，在在三個平行行反應中分分別擴增總總HBV(C管）、、YIDD（I管））、YVDD（V管管），根據據管間Ct值差異計計算突變毒毒株在病毒毒群體中的的比例YMDD的的定量檢測測YMDD的的定量檢測測YMDD的的定量檢測測YMDD的的定量檢測測YMDD的的定量檢測測與其它方法法的比較Comparisonofresultsobtainedbysequencing,pyrosequencingandreal-timePCRTypes Sequencingpyrosequencingreal-timePCRrtM204 25(36%)24(35%)23(33%)rtM204I26(38%)24(35%) 21(30%)rtM204V18(26%)19(27%) 20(29%)rtM204I+rtM204V 02(3%)5(8%)YMDD變變異定性判判斷的臨界界值定性判斷：：ΔCt<3.5，此時病毒毒群體中突突變株比例例大于10%與測序法比比較，15例標本結結果完全符符合YMDD變變異定性判判斷的臨界界值Wangetal,WJG,12:1308-1311什么時候開開始檢測YMDD變變異拉米夫定治治療過程中中YMDD變異情況況治療時間HBVDNA大于104copies/ml例數YMDD變異例數數*<6個月月 61（（17%））6~12個個月2614（54%）12~24個月3826（（68%））24~36個月3838（（100%）*各組之之間兩兩比比較均有顯顯著差異（（P<0.05）。。YMDD變變異株的動動態變化YMDD變變異株的動動態變化YMDD檢檢測試劑——應用方法法對接受拉米米夫定治療療的慢性乙乙肝患者進進行耐藥監監測治療前檢測測一次（約約有10-20%的的人在治療療前就有YMDD變變異）治療療開開始始后后第第七七個個月月開開始始，，每每三三個個月月檢檢測測一一次次慢性性乙乙肝肝的的基基因因分分型型乙肝肝病病毒毒分分八八個個基基因因型型：：根根據據基基因因組組序序列列的的差差異異可可以以分分為為A～～H八八種種亞亞型型，，我我國國以以B型型（（41%））和和C型型（（53%））為為主主不同同基基因因型型病病毒毒感感染染的的病病程程和和后后果果不不同同：：C型型對對肝肝的的損損傷傷比比B型型嚴嚴重重，，基基因因型型C比比基基因因型型B更更容容易易發發展展成成為為肝肝硬硬化化不同同的的基基因因型型對對藥藥物物的的應應答答也也不不一一樣樣：：基基因因型型B比比基基因因型型C對對干干擾擾素素治治療療的的應應答答率率高高HBV基基因因分分型型PCR檢檢測測試試劑劑運用用多多重重、、多多色色實實時時PCR技術術，，分分別別對對乙乙肝肝病病毒毒（（HBV））各各種種基基因因型型序序列列進進行行分分析析根據據國國內內HBV基因因型型的的特特點點，，設設計計能能檢檢測測HBVA~D四種種基基因因型型特特異異性性引引物物及及探探針針研制制開開發發具具有有自自主主知知識識產產權權的的乙乙肝肝病病毒毒（（HBV））基基因因分分型型多多重重、、多多色色實實時時PCR檢檢測測試試劑劑盒盒HBV基基因因分分型型——結結果果判判斷斷方方法法B管（Ct<36）B管（Ct≥36）C管（Ct<36）B型、C型HBV復合感染2C型HBVC管（Ct≥36）B型HBV非B非C型，或HBV（-）HBV基基因因分分型型——分分型型識識別別率率分型型識識別別率率＝＝（（12+22））/35＝＝97％％樣本數百分比B型1234%C型2263%未檢出13%總計35100%HBV基基因因分分型型——分分型型靈靈敏敏度度（（1））HBVB型型血血清清樣樣本本靈敏敏度度約約在在2××103IU/mlHBV基基因因分分型型——分分型型靈靈敏敏度度（（2））HBVC型型血血清清樣樣本本靈敏敏度度約約在在1××103IU/ml共價價閉閉合合環環狀狀DNA(cccDNA)檢檢測測HBVcccDNA是乙乙肝肝病病毒毒前前基基因因組組RNA復制制的的原原始始模模板板只有有徹徹底底清清除除了了cccDNA，，乙乙肝肝的的治治療療才才能能算算真真正正有有效效HBVcccDNA可可作作為為評評價價抗抗病病毒毒治治療療效效果果新新的的有有效效指指標標HBVcccDNAPCR檢檢測測試試劑劑運用用實實時時PCR技技術術，，根根據據乙乙肝肝病病毒毒共共價價閉閉合合環環狀狀DNA（（cccDNA））和和雙雙鏈鏈松松弛弛環環狀狀DNA（（rcDNA））分分子子結結構構上上的的差差異異，，即即rcDNA負負鏈鏈上上的的缺缺口口和和正正鏈鏈的的不不完完整整性性，，設設計計一一對對特特異異性性cccDNA的的引引物物，，分分別別雜雜交交于于1500和和2100鄰鄰近近區區域域(以以EcoRI切切點點為為物物理理起起始始原原點點)，，同同時時設設計計一一條條雜雜交交于于負負鏈鏈3’’端端近近缺缺口口處處檢檢測測探探針針，，研研制制開開發發具具有有自自主主知知識識產產權權的的HBVcccDNA實實時時PCR檢檢測測試試劑劑盒盒。。HBVcccDNA檢檢測測試試劑劑原原理理rcDNA不能能被被擴擴增增無熒熒光光信信號號cccDNA能能被被擴擴增增檢測到到熒光光信號號P118201590+3200（1）EcoRIP2－EcoRI5‘+P23200(1)5‘3‘15903‘1820－P1阿德福福韋治治療乙乙型肝肝炎阿德福福韋為為5’-單磷磷酸脫脫氧阿阿糖腺腺苷類類似物物，可可明顯顯抑制制HBVDNA復復制HBeAg陽性性慢性性乙型型肝炎炎患者者，1、2、3年時時的耐耐藥發發生率率分別別為0%、、1.6%、3.1%HBeAg陰性性者1、2、3年的的耐藥藥發生生率分分別為為0%、3.0%、、5.9%~11%阿德福福韋耐耐藥突突變位位點rtN236T、rtA181V恩替卡卡韋治治療乙乙型肝肝炎拉米夫夫定耐耐藥的的病毒毒株對對恩替替卡韋韋敏感感性降降低8至30倍倍；發生YMDD變變異患患者治治療1年年時對對恩替替卡韋韋耐藥藥發生生率為為5.8%，并并出現現相關關的位位點變變異。。恩替卡卡韋耐耐