感染的實驗診斷感染的實驗診斷1（優(yōu)選）感染的實驗診斷（優(yōu)選）感染的實驗診斷2HIV的基因組結(jié)構(gòu)和蛋白基質(zhì)衣殼核衣殼表面糖蛋白跨膜糖蛋白蛋白酶反轉(zhuǎn)錄酶整合酶HIV結(jié)構(gòu)基因,有3個env(核苷酸5781--8360)編碼包膜蛋白p160、120、41等。gag(核苷酸310--1860)編碼病毒核心/衣殼蛋白p55、24、15、17；pol(核苷酸1629--4673)編碼逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)、p66、51、32、11等；HIV調(diào)節(jié)基因,有6個tat:上調(diào)mRNA,促病毒復制-啟動rev:調(diào)節(jié)病毒mRNA-開關(guān)vif:增強出芽,釋放新病毒顆粒-感染因子nef:下調(diào)mRNA,抑病毒復制-制動vpu:僅見于HIV-1,功能不詳；vpx:僅見于HIV-2,功能不詳。HIV的基因組結(jié)構(gòu)和蛋白基質(zhì)衣殼核衣殼3感染的實驗診斷課件45days55腦部：巨嗜細胞和膠質(zhì)細胞淋巴系統(tǒng):胸腺淋巴結(jié)脾臟腸道：嗜鉻細胞前列腺精液陰道黏液骨髓肺胞巨嗜細胞血液細胞積存:CD4+T淋巴細胞巨嗜細胞膠質(zhì)細胞嗜鉻細胞Imagefrom:KahnandWalker,M.D.NEJM1998,Volume339:33-39

July2腦部：巨嗜細胞和膠質(zhì)細胞淋巴系統(tǒng):腸道：嗜鉻細胞前列腺精液骨6感染HIV后的血清學變化HIVRNA濃度p24AgP24AgAnti-gp41,120,160Anti-p24,55感染1周2周6周12周8－10年急性期潛伏期艾滋病期檢出線感染HIV后的血清學變化HIVRNA濃度p24AgP247小于18個月嬰兒在10000拷貝/毫升應(yīng)做HIV感染處理。pol(核苷酸1629--4673)編碼逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)、p66、51、32、11等；第五代：HIV抗體和P24抗原實現(xiàn)分別檢測，真正實現(xiàn)早期診斷。診斷HIV感染在早期可檢測抗原，而在感染后的大多數(shù)時間，可用血清學方法診斷。Imagefrom:KahnandWalker,M.陰性不排除感染，因敏感性低：30－80％。自身免疫病，高丙種球蛋白血癥（全身性紅斑狼瘡）此時ELISA往往已顯示陽性反應(yīng)染個體所占比例。兩周后出現(xiàn)病毒血癥，可用P24抗原檢測方法或測逆轉(zhuǎn)錄酶活性。1000人受檢：50份真陽性（已感染），950份真陰性（未感染），第四代：雙抗原（抗體）夾心法，將HIVP24抗體和HIV抗原同時包被，再加入待檢血清，最后加入酶標記的HIV抗原和HIVP24單克隆抗體，同時檢測血清中的HIVP24抗原和HIV抗體。注：公式中真陽性和真陰性指試驗數(shù)目。或假陰性），是靈敏度和特異性的綜合指標，反映了該試驗的25例隨訪到的對象中，18例樣本平均17天后條帶有明顯進展，可以判定為HIV抗體陽轉(zhuǎn)。陽性預(yù)測值=————————100%陰性預(yù)測值（NPV）：定義為在所有陰性結(jié)果人群中未感特異性不夠強，有時會造成一些假陽性結(jié)果，故在初篩試快速:4-5y:(2%)緩慢/長期不進展:>10y:(2%)HIV-1早期感染病毒標志物的動態(tài)觀察HIVRNAHIVp24antigenHIVantibodies窗口期血漿RNAP24前病毒DNAHIV抗體:ELISAHIV抗體:WB小于18個月嬰兒在10000拷貝/毫升應(yīng)做HIV感染處理。H8HIV感染者的三種臨床轉(zhuǎn)歸VirusCD4CD8aHIVCD4CD4CD8CD8aHIVVirusVirus典型8－10y快速:4-5y:(2%)緩慢/長期不進展:>10y:(2%)HIV感染者的三種臨床轉(zhuǎn)歸VirusCD4CD8aHIVC9二、HIV酶聯(lián)篩查檢測方法和試劑※感染急性期，

窗口期※檢測試劑以ELISA為主，還有PA，斑點免疫膠體金和免疫層析。※ELISA試劑為HIV1/2型，包括M和O組，N組不包括但很少。※三四五代酶聯(lián)試劑的差異和使用策略：三代成熟質(zhì)量穩(wěn)定，窗口期20d;四代提前4－9d，質(zhì)量不穩(wěn)定，用于血站急性感染的檢測。※篩查試驗和確認試驗的差異：酶聯(lián)試驗敏感性高于確認試驗，四代試劑敏感性更高，確認陰性的不一定是真陰性。

二、HIV酶聯(lián)篩查檢測方法和試劑※感染急性期，窗口期10（一）HIV抗體ELISA檢測試劑（血液）第三代：雙抗原夾心法，可檢測所有類型抗體，由于能檢出IgM抗體，縮短了窗口期，有報道說較第二代產(chǎn)品平均可提前5天作出診斷。第四代：雙抗原（抗體）夾心法，將HIVP24抗體和HIV抗原同時包被，再加入待檢血清，最后加入酶標記的HIV抗原和HIVP24單克隆抗體，同時檢測血清中的HIVP24抗原和HIV抗體。第五代：HIV抗體和P24抗原實現(xiàn)分別檢測，真正實現(xiàn)早期診斷。（一）HIV抗體ELISA檢測試劑（血液）第三代：雙抗原夾心11FourthGenerationThirdGenerationSecondGenerationIgMIgGIgMIgG12各種HIV檢測方法平均窗口期方法 平均天數(shù)第2代EIA 45第3代EIA 22P24抗原 16HIVRNA 11各種HIV檢測方法平均窗口期方法 平均天數(shù)13（二）、檢測試劑的質(zhì)量指標靈敏度診斷試驗的靈敏度有兩個不同意義：1．代表一個試驗?zāi)軝z測最少量被分析物（如抗體）的能力。通常可對陽性血清進行稀釋以確認哪個試驗更敏感。2．指某試驗檢出陽性的能力（無假陰性）。一個試驗有可能檢出很少量的某抗體，但也可因試驗中缺少適當?shù)目乖┑粢恍╆栃詷悠贰＃ǘz測試劑的質(zhì)量指標142．特異性指某試驗正確鑒定所有陰性的能力（無假陽性）。大部分HIV篩查試驗不是100%特異，可用公式計算真陰性特異度=————————100%

真陰性+假陽性注：公式中真陰性指試驗中所能檢測的真陰性數(shù)。如100份血清，5份真陽性，95份真陰性，與參考試驗比較，某試驗檢出6份陽性（一份假陽性），則

特異性=94/(94+1)×100%=98.9%2．特異性153．試驗效率指某試驗正確鑒定所有陽性和陰性的總體能力（無假陽性或假陰性），是靈敏度和特異性的綜合指標，反映了該試驗的總的效率。真陽性+真陰性試驗效率=—————————————100%

真陽性+假陽性+真陰性+假陰性注:公式中真陽性和真陰性指試驗數(shù)目。在以上例子中，檢測100份血清，5份真陽性，95份真陰性，1份假陽性，1份假陰性，因此

4+94

試驗效率=————————100%=98%4+1+94+13．試驗效率164．預(yù)測值預(yù)測值與以上的參數(shù)不同，它描述的是考慮了被檢人群中感染的流行因素后的試驗評價。陽性預(yù)測值（PPV）：定義為在所有陽性結(jié)果人群中感染個體所占比例。陰性預(yù)測值（NPV）：定義為在所有陰性結(jié)果人群中未感染個體所占比例。真陽性陽性預(yù)測值=————————100%

真陽性+假陽性真陰性陰性預(yù)測值=————————100%

真陰性+假陰性注：公式中真陽性和真陰性指試驗數(shù)目。4．預(yù)測值17⑴在感染流行率較高（5%）的人群中1000人受檢：50份真陽性（已感染），950份真陰性（未感染），5份假陽性（試驗結(jié)果），5份假陰性（試驗結(jié)果），計算

PPV=45/(45+5)×100%=90%NPV=945/(945+5)×100%=99.5%

在另一人群有相同的結(jié)果（即相同數(shù)量的假陽性和假陰性）⑵在感染流行率較低的人群（0.7%）中

1000人受檢：7份真陽性（已感染），993份真陰性（未感染），5份假陽性（試驗結(jié)果），5份假陰性（試驗結(jié)果），計算

PPV=2/2+5=28.6%NPV=988/988+5=99.5%

⑴在感染流行率較高（5%）的人群中⑵在感染流行率較低185．艾滋病病原診斷中的幾個問題⑴明確不同實驗方法的意義和適應(yīng)范圍：HIV血清學檢測方法可分初篩和確證兩類。HIV初篩試驗特異性不夠強，有時會造成一些假陽性結(jié)果，故在初篩試驗出現(xiàn)陽性結(jié)果時，應(yīng)再重復試驗，若仍為陽性再用確證試驗（WestBlot）去證實。但一些非感染者的血液也會對某些抗原顯示反應(yīng)（出現(xiàn)的條帶不夠判為陽性的標準），在正常的非感染者人群中發(fā)生比例<15%，所以如果用WB來測ELISA陰性者的血清，有些標本被視為不確定。出現(xiàn)不確定結(jié)果時，可能是HIV早期感染或是非特異反應(yīng)，應(yīng)在1-6個月后復查，并結(jié)合個體的臨床表現(xiàn)、感染因素、WB帶型等綜合分析后做出結(jié)論。5．艾滋病病原診斷中的幾個問題19⑵針對HIV感染不同時期選用不同的檢測手段：HIV感染后兩周內(nèi)，無法查到抗體。兩周后出現(xiàn)病毒血癥，可用P24抗原檢測方法或測逆轉(zhuǎn)錄酶活性。6-8周后抗體產(chǎn)生時，進行抗體檢測。診斷HIV感染在早期可檢測抗原，而在感染后的大多數(shù)時間，可用血清學方法診斷。⑵針對HIV感染不同時期選用不同的檢測手段：HIV感染后兩周20

⑶HIV抗體測定的預(yù)測值：試劑的敏感性和特異性可衡量優(yōu)劣，但不能完全決定一個測定結(jié)果正確與否的可能性大小，與預(yù)測值關(guān)系更大。預(yù)測值除與試劑好壞有關(guān)外，還取決于測定對象本身患病率的高低。由表1可以看出：在用ELISA法對高危人群檢測時，其陽性預(yù)測值為99.98%，而在非高危人群中，陽性預(yù)測值僅為18.94%（即查出陽性結(jié)果是真陽性的機率只有18.94%），反之陰性結(jié)果的機率為99.997%。

⑶212、免疫標志物：CD4/CD8,CTL,微球蛋白和Neopterin等。25例隨訪到的對象中，18例樣本平均17天后條帶有明顯進展，可以判定為HIV抗體陽轉(zhuǎn)。HIVantibodies注：公式中真陽性和真陰性指試驗數(shù)目。2、低度為S/CO<1,中度為1<S/CO<6,高度為S/CO>6。特異度=————————100%兩周后出現(xiàn)病毒血癥，可用P24抗原檢測方法或測逆轉(zhuǎn)錄酶活性。5×10～5×102如有必要，可用輔助診斷方法對不確定樣本進行實驗診斷。表1ELISA法HIV1抗體測定的預(yù)示值PPV=2/2+5=28.NPV=945/(945+5)×100%=99.※ELISA試劑為HIV1/2型，包括M和O組，N組不包括但很少。自身免疫病，高丙種球蛋白血癥（全身性紅斑狼瘡）診斷HIV感染在早期可檢測抗原，而在感染后的大多數(shù)時間，可用血清學方法診斷。HIVantibodies3、核酸定性：DNA－PCR或RT-PCR，陽性不能單獨用于感染的診斷，陰性不排除感染。感染HIV后的血清學變化真陽性+真陰性5份假陽性（試驗結(jié)果），5份假陰性（試驗結(jié)果），計算自身免疫病，高丙種球蛋白血癥（全身性紅斑狼瘡）表1ELISA法HIV1抗體測定的預(yù)示值

人群

預(yù)示值(%)

陽性陰性舊金山同性戀人群

99.9880.06美國非高危人群

18.9499.9972、免疫標志物：CD4/CD8,CTL,微球蛋白和Neop22⑷HIV抗體檢測反應(yīng)強度與HIV感染的概率：ELISA法可根據(jù)光密度（OD）值的強度直接確定。反應(yīng)越強的血清，含有HIV抗體的可能性就越大。表2中正常獻血員（感染率30/10萬），中等強度反應(yīng)時，HIV抗體陽性概率僅為1%，高強度反應(yīng)時，則為86.1%。見表2。不僅要看陰陽結(jié)果，還要看反應(yīng)強度或S/CO比值。⑷23表2HIV感染機率與ELISA反應(yīng)強度的關(guān)系

人群HIV感染率（/10萬）

ELISA反應(yīng)強度（%）低度中度高度非高危獻血員

300.00071.1386.1高危獻血員

950.00223.4895.2軍人

1500.00365.3996.9吸毒者

450001.9196.699.9表2HIV感染機率與ELISA反應(yīng)強度的關(guān)系

HIV感24注：1、數(shù)字表示相應(yīng)強度反應(yīng)的血清中含有HIV抗體的概率2、低度為S/CO<1,中度為1<S/CO<6,高度為S/CO>6。注：25三、確認試驗WB為主，還有：線性免疫試驗（LIA）,放射免疫沉淀試驗（RIPA）和免疫熒光試驗（IFA）。WB存有培養(yǎng)病毒的宿主細胞成分，容易出現(xiàn)非特異性反應(yīng)造成不確定結(jié)果，LIA使用重組蛋白（多肽），非特異性大大減少，試劑盒有INNO-LIA,Pepti-Lav等。IFA很少使用。三、確認試驗WB為主，還有：線性免疫試驗（LIA）,放射免疫26（一）、HIV抗體強度與抗體帶型的關(guān)系抗體帶型<11～55～1010～15>15全帶型8條帶型6條帶型5條帶型4條帶型3條帶型2條帶型1條帶型11151642106721224612合計121812049（一）、HIV抗體強度與抗體帶型的關(guān)系抗體帶型<11～5527（二）、HIV病毒載量與抗體帶型的關(guān)系載量帶型5×10～5×102

5×102～103

103～104

104～105

>105全帶型8條帶型6條帶型5條帶型4條帶型3條帶型2條帶型1條帶型4118171412166331211183322合計69797818（二）、HIV病毒載量與抗體帶型的關(guān)系載量5×1028但一些非感染者的血液也會對某些抗原顯示反應(yīng)（出現(xiàn)的條帶不夠判為陽性的標準），在正常的非感染者人群中發(fā)生比例<15%，所以如果用WB來測ELISA陰性者的血清，有些標本被視為不確定。vif:增強出芽,釋放新病毒顆粒-感染因子（二）、檢測試劑的質(zhì)量指標陰性不排除感染，因敏感性低：30－80％。NPV=945/(945+5)×100%=99.（四）WB不確定結(jié)果的有關(guān)數(shù)據(jù)HIVantibodiesrev:調(diào)節(jié)病毒mRNA-開關(guān)注：公式中真陽性和真陰性指試驗數(shù)目。HIV-1早期感染病毒標志物的動態(tài)觀察注：公式中真陰性指試驗中所能檢測的真陰性數(shù)。⑴明確不同實驗方法的意義和適應(yīng)范圍：酶聯(lián)試驗敏感性高于確認試驗，四代試劑敏感性更高，確認陰性的不一定是真陰性。在以上例子中，檢測100份血清，5份真陽性，95份真陰驗出現(xiàn)陽性結(jié)果時，應(yīng)再重復試驗，若仍為陽性再用確證小于18個月嬰兒在10000拷貝/毫升應(yīng)做HIV感染處理。特異性不夠強，有時會造成一些假陽性結(jié)果，故在初篩試tat:上調(diào)mRNA,促病毒復制-啟動注：公式中真陽性和真陰性指試驗數(shù)目。5．艾滋病病原診斷中的幾個問題（三）、造成WB假陽性或不確定的原因1.實驗室操作中，陰性樣本被污染或洗滌不徹底。2.HIV感染急性期，窗口期附近，僅顯示gp160或120，或P24，P31，P55帶；此時ELISA往往已顯示陽性反應(yīng)

3.晚期AIDS病人，部分抗體如P24，P31丟失4.其他病毒感染的交叉反應(yīng)，如風疹，麻疹，腮腺炎等5.自身免疫病，高丙種球蛋白血癥（全身性紅斑狼瘡）6.腎衰竭和血透析7.遺傳性胰腺囊腫8.多次懷孕或輸血9.肝病10.乙肝、狂犬等疫苗注射，使用胸腺肽。11.線粒體核酸和T細胞白細胞抗原引起的抗體但一些非感染者的血液也會對某些抗原顯示反應(yīng)（出現(xiàn)的條29在無高危行為的獻血和孕婦人群中，WB不確定率10-15%，甚至高達32％.Gag蛋白抗體條帶最常見。ELISA篩查陽性結(jié)果中，WB不確定占4-20%,俄羅斯報告占12.7%。我國，125份確認為HIV-1抗體陽性;條帶出現(xiàn)百分率為：gp160、p24為100%,gp120、gp41、p66、p51和p31在96%以上,p17、p55分別為86.4%和85.6%.上海，36例WB試驗gp120和p24雙陽性者的跟蹤隨訪和核酸輔助診斷發(fā)現(xiàn)，至少24例可判定為HIV-1感染。5例樣本的核酸測定結(jié)果與血清學隨訪檢測結(jié)果的符合率達到100%。25例隨訪到的對象中，18例樣本平均17天后條帶有明顯進展，可以判定為HIV抗體陽轉(zhuǎn)。（四）WB不確定結(jié)果的有關(guān)數(shù)據(jù)（四）WB不確定結(jié)果的有關(guān)數(shù)據(jù)30（五）假陰性結(jié)果指EIA+WB的假陰性原因急性感染后的抗體遲反應(yīng)不同HIV毒株型發(fā)病晚期抗體消失窗口期：幾周到6個月，與當?shù)豀IV流行率有關(guān)HIV亞型，M/N/O組間差異（五）假陰性結(jié)果指EIA+WB的假陰性31（六）、確認試驗不確定標本的常規(guī)處理按照《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范（2004年版）》的要求，只能作“3個月后復檢”的處理，三個月后復檢1次，連續(xù)2次，共6個月。其轉(zhuǎn)歸有兩種可能：仍呈現(xiàn)不確定或陰性，則診斷為HIV抗體陰性；帶型發(fā)生進展，符合HIV抗體陽性判斷標準，則診斷為HIV抗體陽性。后者是真正的窗口期感染者（一般為2-3個月，最長6個月）

，只占很小的比例；大多數(shù)為非感染者，但由于WB反應(yīng)的敏感性而出現(xiàn)條帶。如有必要，可用輔助診斷方法對不確定樣本進行實驗診斷。（六）、確認試驗不確定標本的常規(guī)處理按照《全國艾滋病檢測技術(shù)32大多數(shù)為非感染者，但由于WB反應(yīng)的敏感性而出現(xiàn)條帶。4、P24抗原檢測：陽性結(jié)果需經(jīng)中和實驗確認，才提示HIV感染。性，1份假陽性，1份假陰性，因此⑴明確不同實驗方法的意義和適應(yīng)范圍：2．指某試驗檢出陽性的能力（無假陰性）。按照《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范（2004年版）》的要求，只能作“3個月后復檢”的處理，三個月后復檢1次，連續(xù)2次，共6個月。PPV=45/(45+5)×100%=90%HIVantibodiesImagefrom:KahnandWalker,M.HIV的基因組結(jié)構(gòu)和蛋白5．艾滋病病原診斷中的幾個問題預(yù)示值(%)如有必要，可用輔助診斷方法對不確定樣本進行實驗診斷。快速:4-5y:(2%)ELISA篩查陽性結(jié)果中，WB不確定占4-20%,俄羅斯報告占12.蛋白酶反轉(zhuǎn)錄酶整合酶酶聯(lián)試驗敏感性高于確認試驗，四代試劑敏感性更高，確認陰性的不一定是真陰性。急性感染后的抗體遲反應(yīng)表1ELISA法HIV1抗體測定的預(yù)示值感染HIV后的血清學變化小于18個月嬰兒在10000拷貝/毫升應(yīng)做HIV感染處理。※檢測試劑以ELISA為主，還有PA，斑點免疫膠體金和免疫層析。陰性不排除感染，因敏感性低：30－80％。⑴明確不同實驗方法的意義和適應(yīng)范圍：HIV-1早期感染病毒標志物的動態(tài)觀察（四）WB不確定結(jié)果的有關(guān)數(shù)據(jù)緩慢/長期不進展:>10y:(2%)HIVantibodies2、低度為S/CO<1,中度為1<S/CO<6,高度為S/CO>6。窗口期：幾周到6個月，與當?shù)豀IV流行率有關(guān)25例隨訪到的對象中，18例樣本平均17天后條帶有明顯進展，可以判定為HIV抗體陽轉(zhuǎn)。HIVantibodies特異度=————————100%HIV亞型，M/N/O組間差異診斷HIV感染在早期可檢測抗原，而在感染后的大多數(shù)時間，可用血清學方法診斷。驗出現(xiàn)陽性結(jié)果時，應(yīng)再重復試驗，若仍為陽性再用確證如有必要，可用輔助診斷方法對不確定樣本進行實驗診斷。NPV=988/988+5=99.HIVantibodies※ELISA試劑為HIV1/2型，包括M和O組，N組不包括但很少。（二）、檢測試劑的質(zhì)量指標pol(核苷酸1629--4673)編碼逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)、p66、51、32、11等；PPV=45/(45+5)×100%=90%98%，而在非高危人群中，陽性預(yù)測值僅為18.一個試驗有可能檢出很少量的某抗體，但也可因試驗中缺少適當?shù)目乖┑粢恍╆栃詷悠贰Ｐ∮?8個月嬰兒在10000拷貝/毫升應(yīng)做HIV感染處理。特異性不夠強，有時會造成一些假陽性結(jié)果，故在初篩試（優(yōu)選）感染的實驗診斷此時ELISA往往已顯示陽性反應(yīng)注：公式中真陽性和真陰性指試驗數(shù)目。5．艾滋病病原診斷中的幾個問題6-8周后抗體產(chǎn)生時，進行抗體檢測。1、數(shù)字表示相應(yīng)強度反應(yīng)的血清中含有HIV抗體的概率感染HIV后的血清學變化預(yù)測值與以上的參數(shù)不同，它描述的是考慮了被檢人群※三四五代酶聯(lián)試劑的差異和使用策略：緩慢/長期不進展:>10y:(2%)⑵在感染流行率較低的人群（0.pol(核苷酸1629--4673)編碼逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)、p66、51、32、11等；此時ELISA往往已顯示陽性反應(yīng)帶型發(fā)生進展，符合HIV抗體陽性判斷標準，則診斷為HIV抗體陽性。確認結(jié)果不確定標本的輔助診斷1、病毒載量：RT-PCR,NASBA,b-DNA，高拷貝的結(jié)果提示感染。小于18個月嬰兒在10000拷貝/毫升應(yīng)做HIV感染處理。注意不同方法間結(jié)果的差異，陰性不排除感染。2、免疫標志物：CD4/CD8,CTL,微球蛋白和Neopterin等。CD4計數(shù)常用，CD4/CD8小于1提示感染。3、核酸定性：DNA－PCR或RT-PCR，陽性不能單獨用于感染的診斷，陰性不排除感染。4、P24抗原檢測：陽性結(jié)果需經(jīng)中和實驗確認，才提示HIV感染。陰性不排除感染，因敏感性低：30－80％。5、病毒分離：特異性好，但敏感性不高，潛伏期難分離6、流行病學調(diào)查和臨床癥狀：近期是否有HIV高危行為，是否有急性期的相關(guān)癥狀。大多數(shù)為非感染者，但由于WB反應(yīng)的敏感性而出現(xiàn)條帶。※檢測試33感染的實驗診斷感染的實驗診斷34（優(yōu)選）感染的實驗診斷（優(yōu)選）感染的實驗診斷35HIV的基因組結(jié)構(gòu)和蛋白基質(zhì)衣殼核衣殼表面糖蛋白跨膜糖蛋白蛋白酶反轉(zhuǎn)錄酶整合酶HIV結(jié)構(gòu)基因,有3個env(核苷酸5781--8360)編碼包膜蛋白p160、120、41等。gag(核苷酸310--1860)編碼病毒核心/衣殼蛋白p55、24、15、17；pol(核苷酸1629--4673)編碼逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)、p66、51、32、11等；HIV調(diào)節(jié)基因,有6個tat:上調(diào)mRNA,促病毒復制-啟動rev:調(diào)節(jié)病毒mRNA-開關(guān)vif:增強出芽,釋放新病毒顆粒-感染因子nef:下調(diào)mRNA,抑病毒復制-制動vpu:僅見于HIV-1,功能不詳；vpx:僅見于HIV-2,功能不詳。HIV的基因組結(jié)構(gòu)和蛋白基質(zhì)衣殼核衣殼36感染的實驗診斷課件375days538腦部：巨嗜細胞和膠質(zhì)細胞淋巴系統(tǒng):胸腺淋巴結(jié)脾臟腸道：嗜鉻細胞前列腺精液陰道黏液骨髓肺胞巨嗜細胞血液細胞積存:CD4+T淋巴細胞巨嗜細胞膠質(zhì)細胞嗜鉻細胞Imagefrom:KahnandWalker,M.D.NEJM1998,Volume339:33-39

July2腦部：巨嗜細胞和膠質(zhì)細胞淋巴系統(tǒng):腸道：嗜鉻細胞前列腺精液骨39感染HIV后的血清學變化HIVRNA濃度p24AgP24AgAnti-gp41,120,160Anti-p24,55感染1周2周6周12周8－10年急性期潛伏期艾滋病期檢出線感染HIV后的血清學變化HIVRNA濃度p24AgP2440小于18個月嬰兒在10000拷貝/毫升應(yīng)做HIV感染處理。pol(核苷酸1629--4673)編碼逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)、p66、51、32、11等；第五代：HIV抗體和P24抗原實現(xiàn)分別檢測，真正實現(xiàn)早期診斷。診斷HIV感染在早期可檢測抗原，而在感染后的大多數(shù)時間，可用血清學方法診斷。Imagefrom:KahnandWalker,M.陰性不排除感染，因敏感性低：30－80％。自身免疫病，高丙種球蛋白血癥（全身性紅斑狼瘡）此時ELISA往往已顯示陽性反應(yīng)染個體所占比例。兩周后出現(xiàn)病毒血癥，可用P24抗原檢測方法或測逆轉(zhuǎn)錄酶活性。1000人受檢：50份真陽性（已感染），950份真陰性（未感染），第四代：雙抗原（抗體）夾心法，將HIVP24抗體和HIV抗原同時包被，再加入待檢血清，最后加入酶標記的HIV抗原和HIVP24單克隆抗體，同時檢測血清中的HIVP24抗原和HIV抗體。注：公式中真陽性和真陰性指試驗數(shù)目。或假陰性），是靈敏度和特異性的綜合指標，反映了該試驗的25例隨訪到的對象中，18例樣本平均17天后條帶有明顯進展，可以判定為HIV抗體陽轉(zhuǎn)。陽性預(yù)測值=————————100%陰性預(yù)測值（NPV）：定義為在所有陰性結(jié)果人群中未感特異性不夠強，有時會造成一些假陽性結(jié)果，故在初篩試快速:4-5y:(2%)緩慢/長期不進展:>10y:(2%)HIV-1早期感染病毒標志物的動態(tài)觀察HIVRNAHIVp24antigenHIVantibodies窗口期血漿RNAP24前病毒DNAHIV抗體:ELISAHIV抗體:WB小于18個月嬰兒在10000拷貝/毫升應(yīng)做HIV感染處理。H41HIV感染者的三種臨床轉(zhuǎn)歸VirusCD4CD8aHIVCD4CD4CD8CD8aHIVVirusVirus典型8－10y快速:4-5y:(2%)緩慢/長期不進展:>10y:(2%)HIV感染者的三種臨床轉(zhuǎn)歸VirusCD4CD8aHIVC42二、HIV酶聯(lián)篩查檢測方法和試劑※感染急性期，

窗口期※檢測試劑以ELISA為主，還有PA，斑點免疫膠體金和免疫層析。※ELISA試劑為HIV1/2型，包括M和O組，N組不包括但很少。※三四五代酶聯(lián)試劑的差異和使用策略：三代成熟質(zhì)量穩(wěn)定，窗口期20d;四代提前4－9d，質(zhì)量不穩(wěn)定，用于血站急性感染的檢測。※篩查試驗和確認試驗的差異：酶聯(lián)試驗敏感性高于確認試驗，四代試劑敏感性更高，確認陰性的不一定是真陰性。

二、HIV酶聯(lián)篩查檢測方法和試劑※感染急性期，窗口期43（一）HIV抗體ELISA檢測試劑（血液）第三代：雙抗原夾心法，可檢測所有類型抗體，由于能檢出IgM抗體，縮短了窗口期，有報道說較第二代產(chǎn)品平均可提前5天作出診斷。第四代：雙抗原（抗體）夾心法，將HIVP24抗體和HIV抗原同時包被，再加入待檢血清，最后加入酶標記的HIV抗原和HIVP24單克隆抗體，同時檢測血清中的HIVP24抗原和HIV抗體。第五代：HIV抗體和P24抗原實現(xiàn)分別檢測，真正實現(xiàn)早期診斷。（一）HIV抗體ELISA檢測試劑（血液）第三代：雙抗原夾心44FourthGenerationThirdGenerationSecondGenerationIgMIgGIgMIgG45各種HIV檢測方法平均窗口期方法 平均天數(shù)第2代EIA 45第3代EIA 22P24抗原 16HIVRNA 11各種HIV檢測方法平均窗口期方法 平均天數(shù)46（二）、檢測試劑的質(zhì)量指標靈敏度診斷試驗的靈敏度有兩個不同意義：1．代表一個試驗?zāi)軝z測最少量被分析物（如抗體）的能力。通常可對陽性血清進行稀釋以確認哪個試驗更敏感。2．指某試驗檢出陽性的能力（無假陰性）。一個試驗有可能檢出很少量的某抗體，但也可因試驗中缺少適當?shù)目乖┑粢恍╆栃詷悠贰＃ǘz測試劑的質(zhì)量指標472．特異性指某試驗正確鑒定所有陰性的能力（無假陽性）。大部分HIV篩查試驗不是100%特異，可用公式計算真陰性特異度=————————100%

真陰性+假陽性注：公式中真陰性指試驗中所能檢測的真陰性數(shù)。如100份血清，5份真陽性，95份真陰性，與參考試驗比較，某試驗檢出6份陽性（一份假陽性），則

特異性=94/(94+1)×100%=98.9%2．特異性483．試驗效率指某試驗正確鑒定所有陽性和陰性的總體能力（無假陽性或假陰性），是靈敏度和特異性的綜合指標，反映了該試驗的總的效率。真陽性+真陰性試驗效率=—————————————100%

真陽性+假陽性+真陰性+假陰性注:公式中真陽性和真陰性指試驗數(shù)目。在以上例子中，檢測100份血清，5份真陽性，95份真陰性，1份假陽性，1份假陰性，因此

4+94

試驗效率=————————100%=98%4+1+94+13．試驗效率494．預(yù)測值預(yù)測值與以上的參數(shù)不同，它描述的是考慮了被檢人群中感染的流行因素后的試驗評價。陽性預(yù)測值（PPV）：定義為在所有陽性結(jié)果人群中感染個體所占比例。陰性預(yù)測值（NPV）：定義為在所有陰性結(jié)果人群中未感染個體所占比例。真陽性陽性預(yù)測值=————————100%

真陽性+假陽性真陰性陰性預(yù)測值=————————100%

真陰性+假陰性注：公式中真陽性和真陰性指試驗數(shù)目。4．預(yù)測值50⑴在感染流行率較高（5%）的人群中1000人受檢：50份真陽性（已感染），950份真陰性（未感染），5份假陽性（試驗結(jié)果），5份假陰性（試驗結(jié)果），計算

PPV=45/(45+5)×100%=90%NPV=945/(945+5)×100%=99.5%

在另一人群有相同的結(jié)果（即相同數(shù)量的假陽性和假陰性）⑵在感染流行率較低的人群（0.7%）中

1000人受檢：7份真陽性（已感染），993份真陰性（未感染），5份假陽性（試驗結(jié)果），5份假陰性（試驗結(jié)果），計算

PPV=2/2+5=28.6%NPV=988/988+5=99.5%

⑴在感染流行率較高（5%）的人群中⑵在感染流行率較低515．艾滋病病原診斷中的幾個問題⑴明確不同實驗方法的意義和適應(yīng)范圍：HIV血清學檢測方法可分初篩和確證兩類。HIV初篩試驗特異性不夠強，有時會造成一些假陽性結(jié)果，故在初篩試驗出現(xiàn)陽性結(jié)果時，應(yīng)再重復試驗，若仍為陽性再用確證試驗（WestBlot）去證實。但一些非感染者的血液也會對某些抗原顯示反應(yīng)（出現(xiàn)的條帶不夠判為陽性的標準），在正常的非感染者人群中發(fā)生比例<15%，所以如果用WB來測ELISA陰性者的血清，有些標本被視為不確定。出現(xiàn)不確定結(jié)果時，可能是HIV早期感染或是非特異反應(yīng)，應(yīng)在1-6個月后復查，并結(jié)合個體的臨床表現(xiàn)、感染因素、WB帶型等綜合分析后做出結(jié)論。5．艾滋病病原診斷中的幾個問題52⑵針對HIV感染不同時期選用不同的檢測手段：HIV感染后兩周內(nèi)，無法查到抗體。兩周后出現(xiàn)病毒血癥，可用P24抗原檢測方法或測逆轉(zhuǎn)錄酶活性。6-8周后抗體產(chǎn)生時，進行抗體檢測。診斷HIV感染在早期可檢測抗原，而在感染后的大多數(shù)時間，可用血清學方法診斷。⑵針對HIV感染不同時期選用不同的檢測手段：HIV感染后兩周53

⑶HIV抗體測定的預(yù)測值：試劑的敏感性和特異性可衡量優(yōu)劣，但不能完全決定一個測定結(jié)果正確與否的可能性大小，與預(yù)測值關(guān)系更大。預(yù)測值除與試劑好壞有關(guān)外，還取決于測定對象本身患病率的高低。由表1可以看出：在用ELISA法對高危人群檢測時，其陽性預(yù)測值為99.98%，而在非高危人群中，陽性預(yù)測值僅為18.94%（即查出陽性結(jié)果是真陽性的機率只有18.94%），反之陰性結(jié)果的機率為99.997%。

⑶542、免疫標志物：CD4/CD8,CTL,微球蛋白和Neopterin等。25例隨訪到的對象中，18例樣本平均17天后條帶有明顯進展，可以判定為HIV抗體陽轉(zhuǎn)。HIVantibodies注：公式中真陽性和真陰性指試驗數(shù)目。2、低度為S/CO<1,中度為1<S/CO<6,高度為S/CO>6。特異度=————————100%兩周后出現(xiàn)病毒血癥，可用P24抗原檢測方法或測逆轉(zhuǎn)錄酶活性。5×10～5×102如有必要，可用輔助診斷方法對不確定樣本進行實驗診斷。表1ELISA法HIV1抗體測定的預(yù)示值PPV=2/2+5=28.NPV=945/(945+5)×100%=99.※ELISA試劑為HIV1/2型，包括M和O組，N組不包括但很少。自身免疫病，高丙種球蛋白血癥（全身性紅斑狼瘡）診斷HIV感染在早期可檢測抗原，而在感染后的大多數(shù)時間，可用血清學方法診斷。HIVantibodies3、核酸定性：DNA－PCR或RT-PCR，陽性不能單獨用于感染的診斷，陰性不排除感染。感染HIV后的血清學變化真陽性+真陰性5份假陽性（試驗結(jié)果），5份假陰性（試驗結(jié)果），計算自身免疫病，高丙種球蛋白血癥（全身性紅斑狼瘡）表1ELISA法HIV1抗體測定的預(yù)示值

人群

預(yù)示值(%)

陽性陰性舊金山同性戀人群

99.9880.06美國非高危人群

18.9499.9972、免疫標志物：CD4/CD8,CTL,微球蛋白和Neop55⑷HIV抗體檢測反應(yīng)強度與HIV感染的概率：ELISA法可根據(jù)光密度（OD）值的強度直接確定。反應(yīng)越強的血清，含有HIV抗體的可能性就越大。表2中正常獻血員（感染率30/10萬），中等強度反應(yīng)時，HIV抗體陽性概率僅為1%，高強度反應(yīng)時，則為86.1%。見表2。不僅要看陰陽結(jié)果，還要看反應(yīng)強度或S/CO比值。⑷56表2HIV感染機率與ELISA反應(yīng)強度的關(guān)系

人群HIV感染率（/10萬）

ELISA反應(yīng)強度（%）低度中度高度非高危獻血員

300.00071.1386.1高危獻血員

950.00223.4895.2軍人

1500.00365.3996.9吸毒者

450001.9196.699.9表2HIV感染機率與ELISA反應(yīng)強度的關(guān)系

HIV感57注：1、數(shù)字表示相應(yīng)強度反應(yīng)的血清中含有HIV抗體的概率2、低度為S/CO<1,中度為1<S/CO<6,高度為S/CO>6。注：58三、確認試驗WB為主，還有：線性免疫試驗（LIA）,放射免疫沉淀試驗（RIPA）和免疫熒光試驗（IFA）。WB存有培養(yǎng)病毒的宿主細胞成分，容易出現(xiàn)非特異性反應(yīng)造成不確定結(jié)果，LIA使用重組蛋白（多肽），非特異性大大減少，試劑盒有INNO-LIA,Pepti-Lav等。IFA很少使用。三、確認試驗WB為主，還有：線性免疫試驗（LIA）,放射免疫59（一）、HIV抗體強度與抗體帶型的關(guān)系抗體帶型<11～55～1010～15>15全帶型8條帶型6條帶型5條帶型4條帶型3條帶型2條帶型1條帶型11151642106721224612合計121812049（一）、HIV抗體強度與抗體帶型的關(guān)系抗體帶型<11～5560（二）、HIV病毒載量與抗體帶型的關(guān)系載量帶型5×10～5×102

5×102～103

103～104

104～105

>105全帶型8條帶型6條帶型5條帶型4條帶型3條帶型2條帶型1條帶型4118171412166331211183322合計69797818（二）、HIV病毒載量與抗體帶型的關(guān)系載量5×1061但一些非感染者的血液也會對某些抗原顯示反應(yīng)（出現(xiàn)的條帶不夠判為陽性的標準），在正常的非感染者人群中發(fā)生比例<15%，所以如果用WB來測ELISA陰性者的血清，有些標本被視為不確定。vif:增強出芽,釋放新病毒顆粒-感染因子（二）、檢測試劑的質(zhì)量指標陰性不排除感染，因敏感性低：30－80％。NPV=945/(945+5)×100%=99.（四）WB不確定結(jié)果的有關(guān)數(shù)據(jù)HIVantibodiesrev:調(diào)節(jié)病毒mRNA-開關(guān)注：公式中真陽性和真陰性指試驗數(shù)目。HIV-1早期感染病毒標志物的動態(tài)觀察注：公式中真陰性指試驗中所能檢測的真陰性數(shù)。⑴明確不同實驗方法的意義和適應(yīng)范圍：酶聯(lián)試驗敏感性高于確認試驗，四代試劑敏感性更高，確認陰性的不一定是真陰性。在以上例子中，檢測100份血清，5份真陽性，95份真陰驗出現(xiàn)陽性結(jié)果時，應(yīng)再重復試驗，若仍為陽性再用確證小于18個月嬰兒在10000拷貝/毫升應(yīng)做HIV感染處理。特異性不夠強，有時會造成一些假陽性結(jié)果，故在初篩試tat:上調(diào)mRNA,促病毒復制-啟動注：公式中真陽性和真陰性指試驗數(shù)目。5．艾滋病病原診斷中的幾個問題（三）、造成WB假陽性或不確定的原因1.實驗室操作中，陰性樣本被污染或洗滌不徹底。2.HIV感染急性期，窗口期附近，僅顯示gp160或120，或P24，P31，P55帶；此時ELISA往往已顯示陽性反應(yīng)

3.晚期AIDS病人，部分抗體如P24，P31丟失4.其他病毒感染的交叉反應(yīng)，如風疹，麻疹，腮腺炎等5.自身免疫病，高丙種球蛋白血癥（全身性紅斑狼瘡）6.腎衰竭和血透析7.遺傳性胰腺囊腫8.多次懷孕或輸血9.肝病10.乙肝、狂犬等疫苗注射，使用胸腺肽。11.線粒體核酸和T細胞白細胞抗原引起的抗體但一些非感染者的血液也會對某些抗原顯示反應(yīng)（出現(xiàn)的條62在無高危行為的獻血和孕婦人群中，WB不確定率10-15%，甚至高達32％.Gag蛋白抗體條帶最常見。ELISA篩查陽性結(jié)果中，WB不確定占4-20%,俄羅斯報告占12.7%。我國，125份確認為HIV-1抗體陽性;條帶出現(xiàn)百分率為：gp160、p24為100%,gp120、gp41、p66、p51和p31在96%以上,p17、p55分別為86.4%和85.6%.上海，36例WB試驗gp120和p24雙陽性者的跟蹤隨訪和核酸輔助診斷發(fā)現(xiàn)，至少24例可判定為HIV-1感染。5例樣本的核酸測定結(jié)果與血清學隨訪檢測結(jié)果的符合率達到100%。25例隨訪到的對象中，18例樣本平均17天后條帶有明顯進展，可以判定為HIV抗體陽轉(zhuǎn)。（四）WB不確定結(jié)果的有關(guān)數(shù)據(jù)（四）WB不確定結(jié)果的有關(guān)數(shù)據(jù)63（五）假陰性結(jié)果指EIA+WB的假陰性原因急性感染后的抗體遲反應(yīng)不同HIV毒株型發(fā)病晚期抗體消失窗口期：幾周到6個月，與當?shù)豀IV流行率有關(guān)HIV亞型，M/N/O組間差異（五）假陰性結(jié)果指EIA+WB的假陰性64（六）、確認試驗不確定標本的常規(guī)處理按照《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范（2004年版）》的要求