基因的分子生物學讀書筆記基因的分子生物學讀書筆記基因的分子生物學讀書筆記xxx公司基因的分子生物學讀書筆記文件編號：文件日期：修訂次數：第1.0次更改批準審核制定方案設計，管理制度分子生物學讀書筆記第1篇化學和遺傳學第1章孟德爾學派的世界觀知識點：孟德爾定律是什么？答：顯性和隱性基因都是獨立傳遞的，并且在性細胞形成過程中能夠獨立分離。這個獨立分離規律（principleofindependentsegregation）經常被稱為孟德爾第一定律。基因存在，并且每一對基因在性細胞發育過程中，都可以獨立地傳遞到配子中。這一獨立分配律（principleofindependentassortment）經常被稱為孟德爾第二定律。第2章核酸承載遺傳信息知識點：中心法則：答：1956年，Crick提出將遺傳信息的傳遞途徑稱為中心法則（centraldogma）。轉錄翻譯復制DNARNA蛋白質其中，箭頭表示遺傳信息的傳遞方向。環繞DNA的箭頭代表DNA是自我復制的模板。DNA與RNA之間的箭頭表示RNA的合成（轉錄，transcription）是以DNA為模板的。相應地，蛋白質的合成（翻譯，translation）是以RNA為模板的。更為重要的是，最后兩個箭頭表示的過程，只能單方向存在，也就是說，不能由蛋白質模板合成RNA。也難以想象由RNA模板合成DNA。蛋白質不能作為RNA的模板已經經受了時間的驗證，然而，正如我們將在第11章中要提到的，有時RNA鏈確實可以作為互補的DNA的模板。這種與正常信息流的方向相反的事例，與大量的以DNA為模板合成的RNA分子相比，是非常少見的。所以，大約50年前提出的中心法則在今天看來仍然是基本正確的。弱化學作用的重要性知識點：弱化學鍵主要有4種:答：范德華力,疏水鍵,氫鍵及離子鍵。弱化學鍵的作用：答：介導了到分子內/間的相互作用，決定了分子的形狀及功能。第4章高能鍵的重要性知識點：蛋白質與核酸的形成：答：蛋白質是氨基酸間通過肽鍵連接,核苷酸間通過磷酸二脂鍵連接而形成核酸。以上2種重要生物大分子的形成都是由高能的p~p水解提供能量,對反應前體進行活化。ATP的作用：答：ATP被稱為生物的能量貨幣,其上儲存的高能磷酸鍵可以直接為生物反應供能。第5章弱、強化學鍵決定大分子的結構知識點：強化學鍵的作用：答：核酸（DNA/RNA）和蛋白質都是由簡單的小分子通過共價鍵組成的高分子。這些小分子的排列順序決定了其遺傳學和生物化學的功能。弱化學鍵的作用：答：核酸（DNA/RNA）和蛋白質的三維空間構型及它們間的相互作用是由弱的相互作用來決定和維持。除少數特例外，對這種弱的相互作用的破壞（如加熱或去污劑），即使不破壞共價鍵，都將會破壞其所有的生物活性。蛋白質的四級結構：答：1級結構（primarystructure）：多肽鏈中氨基酸的線性順序。２級結構（secondarystructure）：鄰近的氨基酸通過弱的相互作用形成二級結構。最基本的二級結構是α螺旋和β折疊。二級結構可通過計算機做準確預測。３級結構（tertiarystructure）：多肽鏈在二級結構基礎上形成的空間結構。可用x射線晶體衍射和核磁共振術進行測定。４級結構（quaternarystructure）：多亞基蛋白所形成的結構。第2篇基因組的維持第6章DNA和RNA的結構知識點：DNA由多核苷酸鏈構成：答：通常DNA最重要的結構特征是兩條多核苷酸鏈（polynucleotidechain）以雙螺旋的形式相互纏繞。雙螺旋兩條單鏈的骨架是由糖和磷酸基團交替構成的；堿基朝向骨架的內側，通過大溝和小溝可以接近堿基。DNA通常是右手雙螺旋。大溝中有豐富的化學信息。多核苷酸鏈以磷酸二酯鍵為基礎構成了規則的不斷重復的糖-磷酸骨架，這是DNA結構的一個特點。與此相反，多核苷酸鏈中堿基的排列順序卻是無規律的，堿基排列順序的不規則性加上其長度是DNA儲存大量信息的基礎。習慣上，DNA序列由5’端（在左邊）向3’端書寫，一般5’端是磷酸基而3’端是羥基。雙螺旋的兩條鏈序列互補：答：腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）配對，鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）配對的結果是使兩條相互纏繞的鏈上的堿基序列呈互補關系并賦予DNA自我編碼的特性。堿基會從雙螺旋中翻轉出來：答：有時單個的堿基會從雙螺旋中突出，這種值得注意的現象叫做堿基翻出（baseflipping）。DNA雙鏈可以分開（變性）和復性：答：當DNA溶液溫度高于生理溫度（接近100℃）或者pH較高時，互補的兩條鏈就可分開，這個過程稱為變性（denaturation）。DNA雙鏈完全分開的變性過程是可逆的，當變性DNA的熱溶液緩慢降溫，DNA的互補鏈又可重新聚合，形成規則的雙螺旋。由于變性的DNA分子具有復性的能力，因此來源不同的兩條DNA分子鏈通過緩慢降溫也可形成人工雜交分子。在第20章里，兩條單鏈核酸形成雜交分子的能力被稱為雜交（hybridiztion）。這是分子生物學中幾項不可缺少的技術的基礎。例如，Southern印跡雜交（第20章）和DNA芯片分析（第18章，框18-1）。由于雙螺旋DNA的光吸收比單鏈DNA少40%。當DNA溶液溫度升高到接近水的沸點時，光吸收值（absorbance）在260nm處明顯增加，這種現象稱為增色效應（hyperchromicity）；而減色效應則是因為雙螺旋DNA中的堿基堆積降低了對紫外線的吸收能力。吸光度增加到最大值一半時的溫度叫做DNA的熔點（meltingpoint）。連環數由扭轉數和纏繞數共同決定：答：連環數（linkingnumber）是指要使兩條鏈完全分開時，一條鏈必須穿過另一條鏈的次數（用Lk表示）。連環數是扭轉數（twistnumber，用Tw）和纏繞數（writhenumber，用Wr表示）這兩個幾何數的總和。扭轉數僅僅是一條鏈旋繞另一條鏈的螺旋數，即一條鏈完全纏繞另一條鏈的次數。在三維空間里雙螺旋的長軸經常重復地自我交叉，這稱為纏繞數。細胞中DNA呈負超螺旋的意義：答：負超螺旋含有自由能，可以為打開雙鏈提供能量，使DNA復制和轉錄這樣的解離雙鏈的過程得以順利完成。因為Lk=Tw+Wr，負超螺旋可以讓雙螺旋扭轉數減少，負超螺旋區域因而有局部解旋傾向。因此，與松弛態DNA相比負超螺旋DNA更易于解鏈。拓撲異構酶有2種基本類型：答：拓撲異構酶（topoisomerase）可以催化DNA產生瞬時單鏈或雙鏈的斷裂而改變連環數。拓撲異構酶Ⅱ通過兩步改變DNA連環數。它們在DNA上產生一瞬時的雙鏈缺口，并在缺口閉合以前使一小段未被切割的雙螺旋DNA穿過這一缺口。拓撲異構酶Ⅱ依靠ATP水解提供的能量來催化這一反應。相反，拓撲異構酶Ⅰ一步就可以改變DNA的連環數，其作用是使DNA暫時產生單鏈切口，讓未被切割的另一單鏈在切口接合之前穿過這一切口。與拓撲異構酶Ⅱ相比，拓撲異構酶Ⅰ不需要ATP。原核生物還擁有一種特殊的拓撲異構酶Ⅱ，通稱為促旋酶，它引入而不是去除負超螺旋。RNA的結構與功能：答：RNA與DNA的3個不同之處：第一，RNA骨架含有核糖，而不是2’-脫氧核糖，也就是說在核糖的C2’的位置上帶有一個羥基。第二，RNA中尿嘧啶（uracil）取代了胸腺嘧啶，尿嘧啶有著和胸腺嘧啶相同的單環結構，但是缺乏5’甲基基團。胸腺嘧啶實際上是5’甲基-尿嘧啶。第三，RNA通常是單多聚核酸鏈。從功能上講，mRNA是從基因到蛋白質合成的媒介，tRNA作為mRNA上密碼子與氨基酸的“適配器”，同時，RNA也是核糖體的組成部分；另外，RNA還是一種調節分子，通過和mRNA互補序列的結合對翻譯過程進行調控；最后，還有一些RNA（包括組成核糖體的一種結構RNA）是在細胞中催化一些重要反應的酶。堿基對也可以發生在不相鄰的序列中，形成稱為“假結”（pseudoknot）的復雜結構。RNA具有額外的非Watson-Crick配對的堿基，如G：U堿基對，這個特征使RNA更易于形成雙螺旋結構。一些RNA可以是酶類：答：RNA酶被稱為核酶（ribozyme），具有典型酶的許多特性：催化位點、底物結合位點和輔助因子（如金屬離子）結合位點。最早被發現的核酶是RNaseP，一種核糖核酸酶，參與從大的RNA前體生成tRNA。mRNA前體、tRNA前體和rRNA前體間插序列即內含子（intron）的切除過程稱為RNA的剪接（RNAsplicing）。RNA的功能有哪些?答：（1）有些RNA本身就是一種酶,具有調節功能；（2）RNA是一種遺傳物質（主要為病毒的遺傳物質）；（3）RNA可以作為基因和蛋白質合成的中間體；（4）RNA可作識別子（如:mRNA）；（5）RNA可以作為一種調節分子主要通過序列互補結合阻止蛋白質的翻譯。染色體、染色質和核小體知識點：一些概念：答：（1）染色體（chromosome）：在細胞中DNA是和蛋白質結合存在的，每條DNA及其結合的蛋白質構成一條染色體（chromosome）。（2）核小體（nucleosome）：DNA與組蛋白結合所形成的結構稱為核小體（nucleosome）。（3）染色體是環狀或線狀的。（4）基因組密度的簡單衡量方法是每Mb基因組DNA上基因的平均數目。（5）突變基因和基因片段是由于簡單的隨機突變或在DNA重組過程中的錯誤所造成的。假基因則是因反轉錄酶（reversetranscriptase）的作用而形成。每個細胞都有特定的染色體數目：答：大多數真核細胞是二倍體（diploid），也就是說，細胞中每條染色體有兩個拷貝。同一個染色體的兩個拷貝叫做同源染色體（homolog），分別來自父本和母本。但是，一個真核生物中的所有細胞并非都是二倍體，某些細胞是單倍體或多倍體。單倍體（haploid）細胞每條染色體只有一個拷貝，并且參與有性生殖（例如，精子和卵子都是單倍體細胞）。多倍體（polyploid）細胞中每條染色體都超過兩個拷貝。基因組大小與生物體的復雜性相關：答：基因組的大小（單倍染色體中DNA的長度）在不同的生物種有相當大的變化。由于生物的復雜性越高所需的基因也就越多。因此基因組的大小與生物體的復雜性相關也就不足為奇。導致真核細胞中基因密度降低的因素：答：首先，當生物體的復雜性增加時，負責指導和調控轉錄的DNA區段——調控序列（regulatorysequence）的長度顯著增長；其次，在真核生物種編碼蛋白質的基因通常是不連續的。這些分散的非蛋白質編碼區段稱為內含子（intron）。內含子轉錄后通過RNA剪接（RNAsplicing）的過程從RNA中刪除。人的基因間隔區序列主要由重復DNA構成：答：幾乎一半的人類基因組由在基因組中重復多次的DNA序列組成。重復DNA一般有兩種：微衛星DNA和基因組范圍的重復序列。微衛星DNA（microsatelliteDNA）由非常短的（小于13bp）串聯重復序列構成。基因范圍的重復序列（genemo-widerepeat）要比微衛星大得多，盡管這些重復有許多種類，但是它們有著共同的特點，即都是轉座元件（transposableelement）。轉座元件是指能從基因組的一個位置移動到另一個位置的序列，這個過程稱為轉座（transposition）。真核染色體在細胞分裂過程中需要著絲粒、端粒和復制起始位點：答：（1）復制起始位點（originsofreplication）是DNA復制機制集合并起始復制的位點。（2）著絲粒（centromere）是DNA復制后染色體正確分離所必需的。與復制起始位點相似，著絲粒指導一個精細的蛋白質復合體的形成，此結構也稱為動粒（kinetochore）。（3）端粒（telomere）位于線性染色體的兩端。端粒通過一種特殊的DNA聚合酶——端粒酶（telomerase）來完成線性染色體末端的復制。細胞周期及有絲分裂：答：細胞完成一輪分裂所需要的過程稱為細胞周期（cellcycle）。大多數真核細胞的分裂會使子代細胞維持與父本細胞一致的染色體數目。這種分裂類型稱為細胞的有絲分裂（mitoticcelldivision）。有絲分裂的細胞周期可以分為4期：G1、S、G2和M。DNA合成發生在細胞周期的合成期或S期（synthesis或Sphase），導致每條染色體的復制。復制后配對的每條染色體叫做一條染色單體（chromatid），配對的兩條染色單體稱為姐妹染色單體（sisterchromatid）。復制后的姐妹染色單體通過一個叫做黏粒（cohesin）的分子聚在一起，這一過程稱為姐妹染色單體的聚集（sisterchromatidcohesion），這種狀態一直維持到染色體的相互分離。染色體分離發生在細胞周期的有絲分裂期或M期（mitosis，Mphase）。有絲分裂及減數分裂的具體過程：答：見書P151圖7-15和P153圖7-16。核小體是染色體的結構單位：答：在真核細胞中大多數DNA被包裝進核小體。核小體由8個組蛋白所形成的核組成，DNA纏繞在組蛋白核上。每個核小體之間的DNA（“念珠”上的“線”）叫做連接DNA（linkerDNA）。與核小體結合最緊密的DNA叫做核心DNA（coreDNA），它像纏繞線軸一樣盤繞組蛋白八聚體約1.65圈。組蛋白是帶正電荷的小分子蛋白質：答：組蛋白是目前所知的與真核DNA相關的豐度最高的蛋白質。真核細胞一般包括5種組蛋白：H1、H2A、H2B、H3和H4。在每種核心組蛋白中都存在一個保守區域，稱為組蛋白折疊域（histone-folddomain），調節這些組蛋白中間體的組裝。一個核小體的組裝涉及這些結構單位與DNA有序地結合。首先，H3·H4四聚體與DNA結合；然后兩個H2A·H2B二聚體結合到H3·H4-DNA復合體，形成最后的核小體。每個核心組蛋白有一個N端延伸，稱為“尾巴”，這是因為它沒有一個確定的結構，而且是完整的核小體中易接近的部分。許多不依賴于DNA序列的接觸介導核心組蛋白與DNA間的相互作用。組蛋白的N端尾可穩定盤繞在八聚體上的DNA。染色質的高級結構：答：組蛋白H1與核小體間的連接DNA結合。核小體束能形成更復雜的結構：30nm的纖絲。DNA的進一步壓縮涉及到核小體DNA的大環。組蛋白的變構體影響核小體功能。DNA與組蛋白八聚體的相互作用是一動態的過程。核小體重塑復合體有助于核小體的移動：答：組蛋白八聚體與DNA相互作用的穩定性受到大的蛋白復合體——核小體重塑復合體（nucleosomeremodelingcomplex）的影響。這些多蛋白復合體利用ATP水解釋放的能量，便于核小體改變位置或與DNA相互作用。這些變化有3中方式：①組蛋白八聚體沿DNA“滑動”（sliding）；②組蛋白八聚體從一個DNA分子到另一DNA分子的完全“轉移”（transfer）；③核小體“重塑”（remodeling），增加DNA的易接近性。某些核小體在體內處于特定的位置：核小體的定位：答：由于核小體與DNA的動態相互作用，大多數核小體的位置是不固定的。但在有些情況，對核小體的位置，或稱為核小體的定位（positioning），進行限制是有利的。組蛋白N端尾的修飾可改變染色質的易接近性：答：當組蛋白從細胞中分離出來，其N端尾通常被許多種小分子修飾。在尾部的賴氨酸經常被乙酰基或甲基修飾，而絲氨酸主要受磷酸化修飾。一般來說，乙酰化的核小體與染色體上轉錄活躍的區域結合，而脫乙酰化的核小體與染色質上轉錄受抑制的區域結合。與乙酰化不同，N端尾不同部位上的甲基化使核小體可以與抑制的和活化的染色質都能結合，這取決于組蛋白尾上被修飾的特定的氨基酸。DNA復制后核小體立即被組裝：答：當復制叉經過時，核小體解體為亞組裝部件。H3·H4四聚體似乎仍隨機地與兩個子代雙螺旋之一結合，并不從DNA上釋放而成為游離的成分。相反，H2A·H2B二聚體被釋放且進入局部的環境，參與新的核小體的組裝。核小體的組裝需要組蛋白“伴侶”：答：在生理鹽濃度下對核小體組裝的研究鑒定出一些能指導組蛋白在DNA上組裝的因子。這些因子是帶負電荷的蛋白質，與H3·H4四聚體或H2A·H2B二聚體形成復合體，并護送它們到核小體組裝的位點。由于這些因子可以避免組蛋白與DNA發生無效的相互作用，因此被稱為組蛋白伴侶（histonechaperone）。PCNA形成一個環繞著DNA雙螺旋的環，在DNA合成過程中將DNA聚合酶固定在DNA上。當聚合酶作用完成后，PCNA由DNA聚合酶上釋放，但仍與DNA相連。在這種情況下，PCNA能與其他蛋白質發生作用。CAF-1與釋放的PCNA結合，優先將H3·H4四聚體組裝到與PCNA結合的DNA上。簡述染色體的組裝過程。答：在DNA的復制過程中，核小體暫時解體，組蛋白H3-H4四聚體和H2A-H2B二聚體被隨機分配到任一子代分子中，在DNA復制后，核小體立即被組裝，這涉及到特定的組蛋白伴侶的功能，這些組蛋白伴侶護送H3-H4四聚體和H2A-H2B二聚體到達復制叉。隨后，在舊蛋白的“種子”作用下，發生相似修飾，一旦DNA包裝成核小體，它有能力借助組蛋白的H1來進行進一步壓縮DNA，開成染色質形式（30nm纖絲），在細胞分裂間期，染色質進一步濃縮成染色體。DNA的復制知識點：DNA合成的化學基礎：答：DNA合成需要脫氧核苷三磷酸和引物-模板接頭。DNA通過引物3’端的延伸進行合成。焦磷酸水解是DNA合成的驅動力。DNA聚合酶的作用機制：答：（1）DNA聚合酶用一個活性位點催化DNA的合成：DNA聚合酶催化核苷酸添加需要正確配對的堿基，空間位阻阻止DNA聚合酶催化反應使用rNTP。（2）DNA聚合酶像手一樣握住引物：模板接頭。聚合酶的3個結構域被稱為拇指、手指和手掌。手掌域由一個β折疊片構成，含有催化位點的基本元件，尤其是DNA聚合酶的這一區域結合2個二價金屬離子（鎂離子和鋅離子），可以改變正確剪輯配對的dNTP和引物3’-OH周圍的化學環境。除了催化作用外，手掌域還負責檢查最新加入的核苷酸堿基配對的準確性。功能：1）有兩個催化位點，一個延長鏈，別一個是把錯誤的dNTP排除掉，起校對功能； 2）聚合位點有兩個金屬離子，它們有利于催化的進行； 3）檢測配對的準確性。手指域中的幾個殘基可與引入的dNTP結合。一旦引入的dNTP與模板之間形成正確的堿基配對，手指域即發生移動，包圍住dNTP。功能：1）結合運進來的dNTP，并帶到正確的位子； 2）彎曲模板，讓模板堿基與dNTP正確配對； 3）穩定PPi的功能。拇指域與催化的關聯不緊密，而是與最新近合成的DNA相互作用。還有兩個目的：第一，維持引物以及活性部位的正確位置；第二，幫助維持DNA聚合酶與其底物之間的緊密連接。功能：不直接參與催化，但是可保持引物和活性位點處在正確的位置，還可幫助維持DNA聚合酶與其底物緊密連接，有助于添加許多dNTP的能力。（3）DNA聚合酶是一種延伸酶：DNA聚合酶的催化是快速的。DNA聚合酶能在引物鏈上每秒添加1000個核苷酸。DNA合成的速度主要取決于DNA聚合酶的延伸能力。延伸能力（processivity）是酶處理多聚體底物時的一種特性。對于DNA聚合酶，其延伸能力定義為每次酶與引物-模板接頭結合時所添加核苷酸的平均數。（4）外切核酸酶校正新合成出的DNA：DNA合成的校正是通過核酸酶去除不正確堿基配對的核苷酸實現的。最初這種類型的酶被認作是DNA聚合酶的同一類多肽，現在則稱為校正外切核酸酶（proofreadingexonuclease）。這類酶可以從DNA的3’端，即從新DNA鏈的生長端開始降解DNA。復制叉上DNA的兩條鏈同時合成：答：剛分開的模板鏈與未復制的雙鏈DNA之間的連接區稱為復制叉（replicationfork），復制叉向著未復制的DNA雙鏈區域連續運動，其身后留下指導兩個子代DNA雙鏈形成的兩條單鏈DNA模板。在此條模板鏈上，DNA聚合酶簡單地尾隨著復制叉。此模板指導下新合成的DNA鏈稱為前導鏈（leadingstrand）。另一條單鏈DNA模板指導下的新DNA鏈合成遇到的問題較多，此模板指導DNA聚合酶在與復制叉相反的方向上運動。此模板指導的新DNA鏈稱為后隨鏈（laggingstrand）。在后隨鏈上形成的新鏈DNA短片段稱為岡崎片段（Okazakifragment），其在細菌中的長度變化為1000~2000個核苷酸，在真核生物中為100~400個核苷酸。DNA新鏈的起始需要一條RNA引物：答：引物酶（primase）是一種能在單鏈DNA模板上制造短RNA引物（5~10個核苷酸長度）的特殊的RNA聚合酶。完成DNA復制必須除去RNA引物：答：為了用DNA取代RNA引物，RNA酶H（RNaseH）識別并除去各條RNA引物的大部分。最后一個核糖核苷酸是由從5’端降解RNA或DNA的外切核酸酶除去的。DNA上的“切口”被稱為DNA連接酶（DNAligase）的酶修復。DNA解旋酶在復制叉之前解開雙螺旋：答：DNA聚合酶解離雙鏈DNA的兩條堿基配對鏈的能力很差。因此，在復制叉上，由稱為DNA解旋酶（DNAhelicase）的另一組酶催化雙鏈DNA兩條鏈的分離。每個DNA解旋酶在單鏈DNA上都沿著一定的方向運動。這是所有DNA解旋酶都具有的特性，稱作極性（polarity）。復制前單鏈結合蛋白使單鏈DNA穩定：答：一個SSB的結合會促進另一個SSB與其緊鄰的單鏈DNA結合。這稱為協同結合（cooperativebinding），其發生是因為與緊鄰的單鏈DNA區域結合SSB分子之間也能夠結合。拓撲異構酶除去DNA解螺旋時在復制叉上產生的超螺旋。復制叉酶擴大了DNA聚合酶底物的范圍。細胞中DNA聚合酶為行使不同的功能而被特化：答：E.coli中至少有5種DNA聚合酶，這些酶依據其酶學特性、亞基組成和豐度而劃分。DNA聚合酶Ⅲ（DNAPolⅢ）是染色體復制中所涉及的最主要的酶。DNA聚合酶Ⅰ（DNAPolⅠ）專門用于除去起始DNA合成所需的RNA引物。E.coli中的另外3種DNA聚合酶特別用于DNA的修復，它們無校正活性。真核細胞中也有多種DNA聚合酶，通常細胞中有15種以上。其中，對于基因組的復制至關重要的有3種：DNA聚合酶δ、DNA聚合酶ε以及DNA聚合酶α/引物酶。引物酶合成RNA引物后，所產生的RNA引物-模板接頭立即與DNA聚合酶α結合以啟動DNA的合成。因為DNAPolα/引物酶的延伸能力相對較低，所以很快就被高延伸性的DNA聚合酶δ或聚合酶ε取代。聚合酶δ或聚合酶ε取代DNAPolα/引物酶的過程稱作聚合酶的切換（polymeraseswitching），這導致在真核細胞復制叉上有3種不同的DNA聚合酶在工作。如同在細菌細胞中那樣，真核細胞中其他的DNA聚合酶大多參與DNA的修復。滑動夾極大地增加了DNA聚合酶的延伸能力：答：DNA聚合酶在復制叉上具有高延伸能力的關鍵原因在于它們與被稱為滑動DNA夾（slidingDNAclamp）的蛋白質間的結合。滑動夾通過滑動夾裝載器打開并安置在DNA上：答：一類稱為滑動夾裝載器（slidingclamploader）的特殊的蛋白復合體催化滑動夾的打開并將其安放在DNA上。這些酶通過結合ATP并將其水解而將滑動夾置于DNA的引物-模板接頭上。復制叉上的DNA合成：答：E.coli中，這些聚合酶的協同作用是通過它們連接成一個巨大的多蛋白復合體而實現的。此復合體被稱為DNA聚合酶Ⅲ全酶。全酶是對一個具有核心酶并結合有增強其功能的其他元件的多蛋白復合體的總稱。當解旋酶在復制叉處解開DNA螺旋時，前導鏈被迅速地復制，同時后隨鏈以單鏈DNA的形式伸出，并被SSB迅速地結合。新RNA引物在后隨鏈模板上進行不連續的合成。當后隨鏈上的DNA聚合酶完成前面的岡崎片段時，即從模板上釋放出來。因為這個聚合酶與前導鏈上的DNA聚合酶保持著連接，所以它將與距復制叉最近的并且由后隨鏈上最新合成出的RNA引物所形成的引物-模板接頭結合。通過與此RNA引物的結合，后隨鏈上的聚合酶形成一個新的環并啟動下一輪岡崎片段的合成。這個模型被稱作“長號模型”，以比喻由后隨鏈模板所形成的DNA環狀結構大小的變化。復制叉蛋白之間的相互作用形成E.coli的復制體:答：DNA解旋酶與DNA聚合酶Ⅲ全酶之間的相互作用。這個由全酶的夾子裝載器元件介導的相互作用將解旋酶和DNA聚合酶Ⅲ全酶連到一起。DNA解旋酶與引物酶之間，在約1秒一次的間隔中，引物酶與解旋酶以及SSB覆蓋的單鏈DNA結合并合成新的RNA引物。復制叉上作用的全部蛋白質的總和稱為復制體（replisome）。DNA解旋和復制起始發生的特殊位點稱作復制起始位點（originofreplication）。復制起始的復制子模型：答：定義所有的DNA均從稱為復制子（replicon）的特定的起始位點開始復制。復制子模型提出了控制復制起始的兩個元件：復制器和起始子。復制器（replicator）是指足夠指導DNA復制起始的整套順式作用的DNA序列。復制子模型的第二個元件是起始子（initiator）蛋白。此蛋白質特異性地識別復制器中的一個DNA元件并激活復制的起始。復制器序列包括起始子結合位點和容易解旋的DNA：答：復制器的DNA序列有2個共同的特性。第一，它們含有起始子蛋白質結合位點，此位點是組裝復制起始機器的核心；第二，它們含有一段富含AT的DNA，此段DNA容易解旋但并不自發進行。結合和解旋：起始子蛋白對復制起始位點的選擇和激活：答：起始子蛋白在復制起始過程中一般執行3種不同的功能。第一，這些蛋白質與復制器中的特異DNA序列結合；第二，一旦與DNA結合，它們就扭曲或解旋其結合位點附近的DNA區域；第三，起始子蛋白與復制起始所需的其他因子相互作用，使它們聚集到復制器上。以E.coli起始子蛋白DnaA為例。DnaA與oriC中重復的9核苷酸單位元件結合并受ATP的調控。DnaA還會在復制器所形成的單鏈DNA上聚集其他的包括DNA解旋酶的復制蛋白。真核細胞中，起始子時一個被稱為起始位點識別復合體（originrecognitioncomplex，ORC）的六蛋白復合體。ORC可識別酵母復制器上稱為A元件的保守序列，以及次保守的B1元件。ORC可將其他復制蛋白全部召集到復制器上。所以，ORC具有起始子三項常見功能中的兩項：與復制子結合并將其他復制蛋白召集到復制器上。蛋白質-蛋白質和蛋白質-DNA相互作用指導起始過程：答：起始子（DnaA）結合到oriC并使13核苷酸單位的DNA解旋后，單鏈DNA和DnaA共同召集雙蛋白復合體：DNA解旋酶、DnaB以及解旋酶裝載器DnaC。解旋酶與上面所說的復制叉其他元件之間的蛋白質相互作用指導復制機器其他部分的組裝。前復制復合體的形成指導真核細胞中的復制起始：答：復制器選擇是對指導復制起始的序列進行識別的過程，發生于G1期（早于S期）。此過程導致基因組中每個復制器上都組裝一個多蛋白復合體。起始位點激活只在細胞進入S期后發生，使復制器結合的蛋白復合體啟動DNA的解旋和DNA聚合酶的募集。復制器選擇是由前復制復合體（pre-RC）的形成介導的。pre-RC被兩種蛋白激酶（Cdk和Ddk）激活，使復制得以啟動。所有的激酶都在G1期失活，只有在細胞進入S期以后才能被激活。對pre-RC形成和激活的調控使每個細胞周期中僅有一輪復制發生：答：Cdk對于pre-RC功能的調控有兩個似乎矛盾的作用：第一，它們是激活pre-RC以啟動DNA復制所必需的；第二，Cdk的活性會抑制新pre-RC的形成。在G1期內沒有有活性的Cdk，但是細胞周期的其他期內（S、G2和M期）一直存在高水平的Cdk。因此，在每個細胞周期內，pre-RC僅僅有一次形成的機會（G1期內），而且這些pre-RC被激活的機會也僅有一次（在S、G2和M期雖然實際上所有的pre-RC都被S期的復制叉激活或破壞）。子代DNA分子的分離需要拓撲異構酶Ⅱ。后隨鏈的合成不能復制線性染色體的最末端：答：所有新的DNA合成啟動都需要一條RNA引物，這使線性染色體末端的復制成為難題。這種情況被稱為末端復制問題（endreplicationproblem）。細胞解決末端復制問題有各種各樣的方法。一種解決方法是用蛋白質代替RNA作為每個染色體末端最后一個岡崎片段的引物。多數真核細胞使用完全不同的方法來復制其染色體末端。真核生物染色體的末端稱為端粒，它們通常由首尾相連的富含TG的重復DNA序列構成。這種獨特的結構可作為新的復制起始位點以彌補末端復制問題。端粒酶是一種新型的DNA聚合酶，它不需要外源模板：答：端粒酶是一種特殊的酶，它既含有蛋白質成分也含有RNA成分（所以這是一個核糖核蛋白的例子）。與其他所有DNA聚合酶相同的是，端粒酶用于延伸其DNA底物的3’端。但與大多數DNA聚合酶不同的是，端粒酶不需要外源性DNA模板來指導新dNTP的添加，而是利用其RNA成分作為模板，將端粒序列添加到染色體末端的3’端。端粒酶利用其自身的RNA作為模板，特異性地延伸特定單鏈DNA序列的3’-OH。新合成的DNA為單鏈DNA。為什么真核生物染色體在一個周期中只能復制一次？答：真核細胞分裂所需的事件發生在細胞周期的不同時期。染色體DNA復制僅發生在細胞周期的S期。在此期間，細胞中的所有DNA都必須精確地復制一次。染色體任何部分復制的不完整都可造成染色體之間不適當的連接。互聯染色體的分離會引起染色體的斷裂或缺失。DNA的重復制也會造成嚴重后果，使基因組中特殊區域的拷貝數增加。重要調控基因的拷貝數即使增加一個或兩個也會導致基因表達、細胞分裂或對環境信號應答的災難性缺陷。所以，真核細胞每分裂一次，每條染色體中每個堿基對復制且只能復制一次，使極其重要的。端粒酶如何實現端粒的復制？答：端粒酶用其RNA成分與端粒單鏈DNA區域的3`端退火，隨后用其反轉錄活性合成DNA至RNA模板末端。這時端粒酶將RNA從DNA產物上移去，并重新結合到端粒的末端，重復上面的過程。DNA的突變和修復知識點：突變的本質：答：最簡單的突變是一種堿基變成另一種堿基，有兩種類型，轉換（transition），即嘧啶到嘧啶和嘌呤到嘌呤的替換，如T到C和A到G；顛換（transversion），即嘧啶到嘌呤和嘌呤到嘧啶的替換，如T到G或A以及A到C或T。另一種簡單的突變是一個核苷酸或少量核苷酸的插入或缺失。改變單個核苷酸的突變被稱為點突變（pointmutation）。其他類型的突變引起DNA的改變較大，如大范圍的插入和缺失以及染色體結構的整體重排。有些復制錯誤能逃脫校正讀碼：答：有些錯誤插入的核苷酸逃脫檢測并在新合成的鏈與模板鏈之間形成錯誤配對。錯配修復能將逃脫校正讀碼的錯誤去除：答：保證DNA復制忠實性的最后負責由錯配修復系統（mismatchrepairsystem）承擔，它將DNA合成精確性又提高了2~3個數量級。在大腸桿菌中，錯配是由錯配修復蛋白MutS的二聚體來檢測的。MutS掃描DNA，從錯配引起DNA骨架的扭曲變形上識別出它們。E.coli的Dam甲基化酶（DAMmethylase）使兩條鏈上的5’-GATC-3’序列中的A殘基都甲基化。當復制叉經過兩條鏈的GATC都甲基化（全甲基化）的DNA時，產生的子代DNA雙鏈就是半甲基化的（只有母鏈是甲基化的）。甲基化使在復制發生錯誤的時候，使E.coli修復系統能夠從母鏈上找回正確序列的“記憶”設備。真核細胞也能修復錯誤配對，它們使用MutS（MutS類似物稱為MSH蛋白）和MutL（MutL類似物稱為MLH的PMS）的類似物完成這一功能。DNA的水解和脫氨基作用可自發產生損傷：答：最頻繁和最重要類型的水解損傷時胞嘧啶堿基的脫氨基。胞嘧啶可自發進行脫氨基作用，從而產生非天然的（在DNA中）堿基尿嘧啶。腺嘌呤和鳥嘌呤也易于自發脫氨基，脫氨基將腺嘌呤轉變成次黃嘌呤，鳥嘌呤轉變為黃嘌呤。DNA還通過N-糖苷鍵的自發水解進行去嘌呤化（depurination），并在DNA中形成脫堿基位點（即脫氧核糖上沒有堿基）。5’-甲基胞嘧啶脫氨基產生胸腺嘧啶，不能明顯被識別為異常堿基。DNA的烷化反應、氧化反應和輻射損害：答：DNA易于受烷化反應、氧化反應和輻射損害。在烷化反應中，甲基或乙基基團被轉移到堿基的反應位點以及DNA骨架的磷酸上。DNA還易受到活性氧簇的攻擊（如O2-、H2O2和OH·）。這些強烈的氧化劑由致電離輻射和產生自由基的化學試劑產生。另一種堿基損傷時紫外線造成的。260nm左右波長的輻射被堿基強烈吸收，其后果之一是在同一多核苷酸鏈相鄰位置上的兩個嘧啶之間發生光化學融合。γ輻射和X射線（電離輻射）有很高的危險性，因為它們可使DNA雙鏈斷裂，這很難被修復。某些抗癌藥物，如爭光霉素也能引起DNA的斷裂。電離輻射和像爭光霉素那樣的試劑，因能導致DNA斷裂，所以被認為具有誘裂性（clastogenic）。突變還可由堿基類似物和嵌入劑引起：答：突變還可由可替換正常堿基的化合物（堿基類似物，baseanalog）或能插入堿基間的化合物（嵌入劑，intercalatingagent）導致復制錯誤而引起。DNA損傷的修復：答：如我們所看到的那樣，DNA的損傷有兩種后果。有些類型的損傷，如胸腺嘧啶二聚體或DNA骨架的切口和斷裂，使得復制或者轉錄受阻。其他類型的損傷產生改變了的堿基，在復制上沒有立即產生結構性后果，但是引起了錯配，這可在復制之后導致DNA序列上永久性的改變。DNA損傷修復的系統。這些系統最直接的方式是（指真正的修復）修復酶簡單地將損傷逆轉（撤銷）。一個更精致的步驟涉及剪切修復系統（excisionrepairsystem），此處受損的核苷酸沒有被修復，而是從DNA上被除去。有兩種剪切修復，一種僅僅將受損的核苷酸去除，另一種將包含損傷的一小段單鏈DNA去除。但是，更精致的系統是重組修復（recombinationalrepair），當DNA兩條鏈都受損（斷裂）時采用這種修復。在重組修復[也叫雙鏈斷裂修復（double-strandbreakrepair）]中，序列信息從染色體第二條未受損的拷貝上找回。最后，當DNA聚合酶的復制進程被受損堿基阻礙的時候，一個特殊的移損（translesion）聚合酶以一種不依靠模板和新合成DNA鏈之間堿基配對的方式經過受損位點進行拷貝。因為移損合成不可避免地具有很高的錯誤易發性（誘變性），所以細胞在迫不得已的情況下才采用此機制。DNA損傷的直接逆轉：答：損傷簡單逆轉修復的一個例子是光復活作用（photoreactivation），光復活作用直接逆轉紫外輻射造成的嘧啶二聚體結構。直接逆轉的另一個例子是甲基化堿基O6-甲基鳥嘌呤上的甲基被去除。堿基切除修復酶通過堿基彈出機制除去受損堿基：答：DNA清除受損堿基最普遍的方法是通過修復系統將已變化的堿基除去并替換掉。兩種主要的修復系統是堿基切除修復（baseexcisionrepair）和核苷酸切除修復（nucleotideexcisionrepair）。在堿基切除修復中，一種稱為糖基化酶（glycosylate）的酶識別并通過水解糖苷鍵除去受損堿基。在隨后的核酸內切步驟中，產生的脫堿基戊糖從DNA骨架上去除。在傾向于和A發生錯配的oxoG例子中存在一種防故障機制。一種專門的糖基化酶可識別模板鏈上oxoG配對位置錯誤摻入A產生的oxoG：A堿基對。然而在這種情況下，糖基化酶會除去A。因此，修復酶把與oxoG配對的A認作突變，并除去雖沒有受損但是卻不正確的堿基A。另一個防故障系統的例子是除去與G配對的T的糖基化酶。核苷酸切除修復酶在損傷兩側切割受損的DNA：答：與堿基切除修復不同，核苷酸切除修復酶不能區分各種不同的損傷，而是識別雙螺旋形狀上的扭曲。這種扭曲引發一連串的事件，導致含有損傷的一小段單鏈片段（或小區）被去除。去除修復在DNA上產生的單鏈缺口由DNA聚合酶用未受損的鏈為模板進行填補，從而恢復原始的核苷酸序列。核苷酸切除修復不僅能修復整個基因組中的損傷，而且當RNA聚合酶的轉錄過程被某個基因中發生的轉錄（模板）鏈的損傷所終止時，它還能拯救RNA聚合酶。此現象叫做轉錄偶聯修復（transcription-coupledrepair），包括將核苷酸切除修復蛋白募集到受阻的RNA聚合酶上。重組修復通過從未受損DNA中找回序列信息來修復DNA斷裂：答：切除修復用未受損的DNA鏈作為模板來代替另一條鏈上已受損的DNA片段。細胞如何修復DNA中雙螺旋兩條鏈都斷裂的雙鏈斷裂呢？這是由雙鏈斷裂修復（DSB）途徑[double-strandbreak（DSB）repairpathway]進行的。此途徑從姐妹染色體中取回序列信息。DNA重組還幫助修復DNA復制中的錯誤。異源末端連接（NHEJ）的防故障系統發揮作用。NHEJ不涉及同源重組。取而代之的是，通過斷裂末端突出的單鏈之間錯排配對，斷裂DNA的兩個末端直接相互連接。此錯排配對是通過小段（可以短至一個堿基對）互補堿基之間的匹配完成的。移損DNA合成使復制通過DNA損傷繼續進行：答：細胞不能修復損傷，也有防故障機制使復制機器繞過受損的部位。這種機制就叫做移損合成（translesionsynthesis）。移損合成時被一類特化的DNA聚合酶催化的，此酶越過損傷部位直接合成DNA。這些聚合酶一個重要的性質就是，雖然它們是模板依賴性的，但是它們摻入核苷酸的方式不依賴于堿基配對。分子水平上的同源重組知識點：同源重組的“模式”都包括以下幾個關鍵步驟：答：①同源DNA分子的聯會。②引入DNA斷裂。③在兩條重組DNA分子之間，形成堿基互補的短片段起始區。當來自于親本分子的DNA分子單鏈區域與同源雙鏈DNA分子互補鏈配對結合時，發生該配對過程，稱為鏈侵入（strandinvasion）。鏈侵入的結果是，兩個DNA分子被相互交叉的DNA鏈聯系在一起。這個交叉結構被稱為Holliday聯結體（Hollidayjunction）。④Holliday聯結體的剪切。在Holliday聯結體處切斷DNA重新生成兩個分開的雙螺旋DNA，從而完成遺傳物質的交換過程。這個過程叫做拆分（resolution）。Holliday模型揭示了同源重組的關鍵步驟：答：Holliday模型很好地解釋了DNA鏈侵入、分支移位和Holliday聯結體拆分等同源重組的核心過程。雙鏈斷裂修復模型更加準確地描繪了許多重組事件：答：同源重組經常因DNA雙鏈斷裂而啟動。描述這種遺傳交換反應的常用模型是雙鏈斷裂修復途徑（double-strandedbreak-repairpathway）。始發事件是兩條DNA分子中的一條發生了雙鏈斷裂（double-strandedbreak，DSB），而另外一條保持完整。在雙鏈斷裂模式下，這種單向的遺傳物質交流有時會留下一個遺傳標記——引發基因轉換（geneconversion）事件。DNA雙鏈斷裂來自于多事件并啟動同源重組：答：同源重組除了能修復染色體DNA雙鏈斷裂外，還能促進細菌間的遺傳物質交換。同源重組是真核細胞中修復DNA斷裂和復制叉停滯的關鍵步驟。RecBCD解旋酶/核酸酶加工用于重組的DNA分子斷端：答：RecBCD酶作用于斷裂的DNA分子以產生單鏈DNA區域，RecBCD也可協助鏈交換蛋白質RecA結合到單鏈DNA末端。另外，RecBCD所擁有的多種酶活性提供給細胞一種“選擇”，或是與進入細胞的DNA分子發生重組，或是降解它。RecBCD蛋白的激活受控于一段特殊的chi（cross-overhotspotinstigator）DNA序列。遇到chi位點后，RecBCD的核酸酶活性發生變化。隨著RecBCD移入chi位點之外的遠端序列，它不再依3’→5’方向剪切DNA，而是以更高的頻率剪切另一條5’→3’方向的DNA鏈。這種變化的結果使一條雙螺旋DNA變成有一條凸出的，chi位點位于3’端單鏈的DNA。這種結構適于RecA蛋白的組裝，并引發鏈交換。為了讓RecA而不是SSB結合到DNA上，RecBCD直接與RecA結合以利于該蛋白質的組裝。RecA蛋白在單鏈DNA上組裝并促進鏈侵入。在RecA蛋白絲的基礎上建立新的配對DNA：答：RecA催化鏈交換過程可以分為不同階段。首先RecA蛋白絲必須組裝在其中一個參與的DNA分子上，組裝發生在具有單鏈DNA區域（如單鏈DNA末端）的DNA分子上。RecA可促進尋找同源序列，這是因為蛋白絲結構具有兩個不同的DNA結合部位：主要位點（結合第一個DNA分子）與次要位點。當一個堿基互補的區域被定位后，RecA促進這兩個DNA分子形成一個穩定的復合體。這個與RecA結合的三鏈結構被稱為連接分子（jointmolecule），通常包含雜交數百個堿基對的DNA，實際的鏈交換就發生在連接分子內。RuvAB復合體特異性地識別Holliday聯結體并促進分支移位。RuvC剪切位于Holliday聯結體的特定DNA鏈從而結束重組：答：盡管RuvC靠識別結構而非特定序列以行使其功能，但RuvC剪切DNA還是有一定程度的序列特異性。真核細胞的同源重組具有額外的功能：答：在減數分裂過程中，同源重組確保染色體正確配對，從而保持基因組的完整性。染色體的不恰當分離，被稱之為不分離（nondisjunction）。這種在減數分裂過程中發生的同源重組被稱為減數分裂重組（meioticrecombination）。減數分裂中程序化生成的DNA雙鏈斷裂：答：Spo11蛋白可以在很多染色體位置上切斷DNA，它對序列沒什么選擇性，但卻必須發生在減數分裂的一特定時期。MRX蛋白作用于被切開的DNA末端，以組裝類RecA的鏈交換蛋白：答：3’端DNA鏈不被降解，所以此DNA處理反應稱之為5’→3’端切除。MRX正是通過5’→3’的反應，從而生成長3’端單鏈DNA，通常可達1kb或更長。MRX酶復合物還被認為能去除與DNA相連的Spo11。Dmc是專一在減數分裂重組中行使功能的類RecA蛋白：答：真核生物編碼兩種被充分闡明的、與細菌RecA蛋白同源的蛋白質：Rad51和Dmc1。多種蛋白質共同促進減數分裂重組：答：Rad52是另外一個與Rad51相互作用的必要重組蛋白。Rad52啟動Rad51DNA蛋白絲（Rad51的活性形態）的組裝。在真核生物中高度保守的Mus81蛋白，也為減數分裂所必需，或許具有Holliday聯結體拆分酶的作用。交配型轉換始于特定位點的雙鏈DNA的斷裂：答：交配型轉換始于MAT基因座的雙鏈斷裂，這個反應由特異的DNA切割酶——HO內切核酸酶（HOendonuclease）來完成。HO引起的斷裂，其5’→3’的DNA切除反應與減數分裂重組的機制一樣。所以，切除依賴于MRX蛋白復合體，并對5’端的DNA鏈具有特異性，而3’端DNA鏈保持穩定。一旦生成長3’單鏈DNA尾巴，它們就結合Rad51和Rad52蛋白（和其他幫助組裝重組蛋白-DNA復合體的蛋白質）交配型的轉換是單向性的，即序列信息（盡管并不是真正的DNA片段）從HMR和HML移動到MAT基因座，但是絕對不會從反方向進行。交配型轉換是一種基因轉變事件，與交換無關：答：為解釋缺少交換事件的基因轉變的機制，提出了一種新的重組模型，稱之為依賴合成的鏈退火（synthesis-dependentstrandannealing，SDSA）。首先在重組位點引入DSB，經過鏈侵入之后，侵入的3’端作為引物啟動新的DNA合成。值得注意的是，與DSB修復途徑所不同的是，一個完整的復制叉在該處形成。前導鏈和后隨鏈可同時進行DNA復制，但是與普通的DNA復制不同，新合成的鏈自模板上置換下來，其結果是新的雙鏈DNA片段被合成，再連接到最初被HO內切酶切斷的DNA位點上，并被MRX切除。新合成的DNA——其親本DNA分子信息的完全拷貝，替代原有的DNA信息。重組大致上獨立于序列的事實導致一個結論，即任何兩個基因間的重組頻率和這些基因間的距離成正比。重組時被修復的DNA可產生基因轉變。位點特異性重組和DNA轉座知識點：DNA重排的原因：答：很多重要的DNA重排都是由兩類重要的遺傳重組造成的：保守性位點特異性重組（conservativesite-specificrecombination，CSSR）和轉座重組（一般稱作轉座）（transpositionalrecombination）。發生在靶DNA上特定DNA序列的位點特異性重組：答：保守重組的一個關鍵特性使發生移動的DNA片段都帶有短而特殊的序列因子，叫做重組位點（recombinationsite），在這里可發生DNA交換。CSSR能夠產生3中不同類型的DNA重排：①一個DNA片段在特定位點的插入（如λ噬菌體DNA插入細菌染色體）；②DNA片段的丟失；③DNA片段的到位。每個重組位點由一對對稱排列的重組酶識別序列（recombinaserecognitionsequence）構成，識別序列中間所包圍的是一個短的不對稱序列，稱為交換區（crossoverregion），DNA的斷裂和重新連接就是在這里發生。由于交換區是不對稱的，所以每個重組位點都帶有特定的極性。單個DNA分子上的兩個位點所呈現的方向相關性為兩者以反向重復（invertedrepeat）或同向重復（directrepeat）的方式排列。在一對反向位點間的重組將使這兩個位點間的DNA發生倒位；相反，以同樣的機制發生在由兩個同向重復位點間的重組將會去掉這兩個位點間的DNA片段；最后，插入的情況特異性發生在當兩個不同分子的重組位點在一起時所發生的DNA交換情況下。在對重組酶進行一個大概地討論后，將介紹這3中重排類型的幾個實例。位點特異性重組酶通過一個蛋白質－DNA的共價中間體對DNA進行切斷和重新連接：答：保守的位點特異性重組酶共有兩個家族：絲氨酸重組酶（serinerecombinase）和酪氨酸重組酶（tyrosinerecombinase）。保守性位點特異性重組（CSSR）名稱中“保守”的意義：被稱為“保守”是因為反應中被斷開的每個DNA鍵都被重組酶重新連接起來，而DNA在被重組酶斷開并重新連接的過程中不需要其他的能量，如ATP水解的能量。絲氨酸重組酶誘導DNA雙鏈斷裂及鏈交換，促成重組。酪氨酸重組酶每次斷裂和結合一對DNA單鏈。Cre的功能與應用：答：Cre是P1噬菌體編碼的一種酶，其功能是在浸染過程中環化線性的噬菌體基因組。Cre作用于DNA上的重組位點叫lox，Cre-lox是一個由酪氨酸重組酶家族催化重組的簡單例子，整個重組僅需Cre蛋白和lox位點。Cre也是在遺傳工程中被廣泛使用的一個工具。位點特異性重組的生物學作用：答：很多噬菌體的感染就是使用這種重組機制將自己的DNA插入到宿主染色體中。還有些時候，位點特異性重組被用來改變基因的表達。所有反應的關鍵是重組酶與DNA的結合，即使兩個重組位點聚合在一起。對于一些重組反應來說，這個結合過程很簡單，僅需要重組酶和它的DNA識別序列，這與Cre的情況一樣。與此相反，另外一些重組反應則需要輔助蛋白。這些輔助蛋白包括一些所謂的構筑蛋白（architecturalprotein），它們結合到特定DNA序列上并使其彎曲，使之成為有利于重組過程進行的特異形狀。λ整合酶催化病毒基因組在宿主細胞染色體上的整合和切除：答：當λ噬菌體侵染宿主細菌時，一系列的調節活動或者導致形成靜止的溶原狀態（lysogenicstate），或者導致噬菌體的增殖，即進入裂解性生長（lyticgrowth）過程。為實現整合，整合酶蛋白（λInt）在兩個特定位點之間催化重組的進行，這兩個位點叫做att位點，或者附著位點。attP位點在噬菌體上（P代表噬菌體），attB位點在細菌染色體上（B代表細菌）。λInt是一個酪氨酸重組酶，所催化的單鏈交換機制遵循前面介紹的Cre蛋白的催化過程。然而，與Cre重組不同的是，λ整合需要輔助蛋白的幫助來組裝所需的蛋白質－DNA復合體。整合過程要求attB、attP、λInt，以及一個叫做整合宿主因子（integrationhostfactor，IHF）的構筑蛋白的參與。λ噬菌體的切除需要一個新的折疊DNA蛋白質：答：一個由噬菌體編碼的構筑蛋白對切除重組至關重要，這個蛋白質叫做Xis（即切除），它結合到特定的DNA序列上并造成DNA的彎曲。除了促進切除過程（attL和attR之間的重組）以外，Xis結合到DNA上也抑制了整合過程（attP和attB之間的重組）。Hin重組酶顛倒一段DNA片段，使得特定基因開始表達：答：Hin重組是一類重組反應的代表，這些重組在細菌中是相當普遍的，被稱為程序性重排。它的功能通常是讓一部分細菌能夠對周圍環境的突然變化獲得“預適應”。Hin重組過程需要一個DNA增強子：答：Hin重組過程除了需要hix位點外，還需要一段序列。這截短短的序列（約60bp）是一個增強子，它能將重組率提高1000倍左右。增強子-Fis蛋白的復合體激活了重組的催化步驟。Hin可以在沒有Fis-增強子復合體存在的情況下與hix重組位點結合、配對，形成聯合復合體。重組酶將多聚環形DNA分子轉換成單體：答：位點特異性重組對細胞中環狀DNA分子的維護起到關鍵作用。Xer重組酶催化了細菌染色體以及很多細菌質粒的單體化過程。Xer是酪氨酸重組酶家族的一個成員，它的重組機制與前面講過的Cre蛋白很相似。Xer是一個異源四聚體，包含兩個XerC蛋白亞基和兩個XerD蛋白亞基。Xer催化的重組位點必須要包含這兩種識別序列。該位點在細菌染色體上叫做dif位點。當FtsK蛋白存在并與XerCD復合體發生相互作用后，復合體的構象發生改變，XerD蛋白被激活。這時，XerD催化第一對單鏈的重組，產生Holliday聯結體；反應完成后，XerC催化第二對單鏈的交換反應，產生重組后的DNA產物。FtsK是一個膜結合蛋白，它被定位于細胞中發生細胞分裂的地方，其作用是在細胞分裂前將DNA從細胞中央移開，使細胞可以正常分裂。轉座：答：轉座是一種特殊的遺傳重組，它是將特定的遺傳因子從DNA上的一個地方移位到另一個地方。這些可以移動的遺傳因子叫做轉座因子（transposableelement）或轉座子（transposon）。三類基本的轉座因子：根據轉座子的結構及其轉座機制，可將其分為以下3個家族：DNA轉座子。類病毒反轉錄轉座子，包括反轉錄病毒。這些因子又稱為LTR反轉錄轉座子。聚腺苷酸（poly-A）反轉錄轉座子。這類因子又稱為非病毒反轉錄轉座子。DNA轉座子上帶有一個轉座酶基因，兩端是重組位點：答：轉座因子兩端的重組位點以反向重復序列排布，這些末端反向重復序列的長度從25到幾百堿基對不等。催化轉座的重組酶通常叫做轉座酶（transposase）[有時也叫整合酶（integrase）]。DNA轉座子帶有編碼自己的轉座酶的基因，也可能會攜帶一些其他基因，這些基因編碼的蛋白質可能調節轉座，也可能為轉座因子或宿主細胞提供一些有益的功能。轉座子包括自主轉座子和非自主轉座子：答：帶有一對末端反向重復序列和一個轉座酶基因的DNA轉座子，本身具備了催化自身轉座的所有條件，這類因子叫做自主轉座因子（autonomoustransposon）。然而，在基因組上還有很多比較簡單的可移位DNA片段，叫做非自主轉座子（nonautonomoustransposon），它們僅有末端反向重復序列，即轉座所需的cis-acting序列。細胞中自主轉座子表達的轉座酶會識別這些末端反向重復序列，從而幫助非自主轉座因子發生移位。類病毒反轉錄轉座子和反轉錄病毒帶有末端重復序列和兩個對重組很重要的基因：答：類病毒反轉錄轉座子和反轉錄病毒也帶有反向末端重復序列，它們是重組酶結合和作用的位點。類病毒反轉錄轉座編碼聯眾移位所需的蛋白質：整合酶（轉座酶）和反轉錄酶。像基因的聚腺苷酸反轉錄轉座子：答：聚腺苷酸反轉錄轉座子沒有其他轉座子所帶的末端反向重復序列，反而，它的兩端含有完全不同的序列成分。一端稱為5’UTR（非翻譯區），另一端是3’UTR，它帶有一串叫做聚腺苷酸序列（poly-Asequence）的A-T堿基對。反轉錄轉座子帶有兩個基因，ORF1和ORF2。DNA轉座的剪切－粘貼機制：答：DNA轉座子非復制性移位的機制。這個重組過程包括轉座子從DNA上初始位置的切除以及將這個切下來的轉座子整合到一個新的DNA位點，因此把這個機制叫做剪切－粘貼轉座（cut-and-pastetransposition）。一旦轉座酶識別了這些序列，它就將這兩端聚集在一起形成一個穩定的蛋白質-DNA復合體，這個復合體被稱為聯合復合體（synapticcomplex）或轉座體（transpososome）。下一步是將轉座子DNA從基因組的原始位置上切除。轉座子上的轉座酶亞基先斷裂轉座子兩端的一條單鏈。轉座酶切斷DNA后，轉座因子DNA末端帶有游離的3’羥基基團。兩端的另一條DNA單鏈也需要被切斷，而不同的轉座子斷裂這第二條單鏈的機制各不相同。轉座子被切除后，被轉座酶首先釋放的3’端羥基對新插入位點的DNA磷酸二酯鍵進行攻擊，被攻擊的DNA片段叫靶DNA（targetDNA）。剪切－粘貼轉座中的中間體由缺口修復來完成。不同的轉座子催化第二條單鏈斷裂反應的機制這里介紹3種方法：非轉座酶可用來斷裂非轉移單鏈。斷裂非轉移鏈的其他方法由轉座酶自身完成，它用一種不常見的DNA酯基轉移機制，其過程與DNA單鏈轉移相似。例如，在Tn5和Tn10轉座子斷裂非轉移鏈時就產生一個“DNA發卡”結構。然后發卡DNA的末端被轉座酶斷裂（打開），產生一個標準的雙鏈DNA斷裂，打開反應在轉座子DNA兩端同時進行。轉座子兩端DNA的斷裂也可以通過一個酯基轉移反應完成，這是轉座子斷裂非轉移鏈的第三種機制。在這種斷裂中，一個斷裂的3’端攻擊轉座因子上同一單鏈的另一端，產生的DNA中間體進一步反應得到切除的轉座子。DNA的復制性轉座：答：復制性轉座的第一步是轉座酶蛋白和轉座子DNA兩端裝配成一個轉座體。第二步是轉座子末端DNA的斷裂。然后，轉座子DNA的3’－OH末端通過DNA單鏈的轉移反應被連接到靶DNA位點上。但是，這里產生的中間體是雙交叉的DNA分子。在此中間體中，轉座子的3’端被共價連接到新的靶位點，而5’端仍連在原處。中間產物的兩個DNA交叉成為一個復制叉結構。以斷開的靶DNA3’端為引物進行DNA合成，復制過程一直進行到第二個交叉處，此復制反應產生2個拷貝的轉座子DNA，復制產物兩端是短小的正向排列靶位點重復序列。復制性轉座常常會造成染色體的倒位和丟失。類病毒反轉錄轉座子和反轉錄病毒通過一個RNA中間體實現移位：答：類病毒反轉錄轉座子和反轉錄病毒插入到宿主細胞基因組的新位點，所用的DNA斷裂及DNA單鏈轉移步驟與前面講的DNA轉座相同。但不同的地方時，這些反轉錄因子的重組需要一個RNA中間體的參與。轉座周期開始于反轉錄轉座子（或反轉錄病毒）DNA序列在細胞內的RNA聚合酶的催化下轉錄得到RNA。轉錄起始于LTR中的一個啟動子序列，一直穿過整個因子得到轉座因子的一個幾乎全長的RNA拷貝，然后RNA反轉錄成一個雙鏈DNA分子，這個DNA分子叫做cDNA（復制的DNA），它游離于宿主DNA序列之外。這個cDNA能夠被整合酶（與DNA因子的轉座酶高度相關的一種蛋白質，下面將會看到）識別并被重組到一個新的靶DNA位點。整合酶結合到cDNA的一端，然后從每條單鏈的3’端切下幾個核苷酸，這個斷裂反應與DNA轉座子的DNA斷裂步驟相同。DNA轉座酶和反轉錄整合酶同屬于一個蛋白超家族。聚腺苷酸（poly-A）反轉錄轉座子通過一種“反向剪切”機制進行移位：答：聚腺苷酸反轉錄轉座子，如人的LINE因子的移位需要一個RNA中間體，但其轉座機制與類病毒轉座因子有所不同，它的機制叫做靶位點引導反轉錄（targetsiteprimedreversetranscription）。首先是細胞內RNA聚合酶對整合因子的轉錄。盡管啟動子在5’UTR內，這是它能指導RNA合成起始于轉座因子序列的第一個核苷酸。新合成的RNA被轉運到細胞質中翻譯成ORF1和ORF2兩個蛋白質。這些蛋白質保持與編碼它們的RNA相結合。這個蛋白質-RNA復合體重新進入核內并與細胞DNA結合。轉座子及其調節的實例：答：IS4家族的緊密型轉座因子通過多種機制實現對拷貝數的控制。Tn10的轉座伴隨著細胞DNA的復制。Mu噬菌體通過靶位點免疫來避免其轉座到自身DNA上。Tc1/mariner因子是真核細胞中極其成功的DNA轉座因子。酵母Ty因子轉座到基因組的安全港。LINE因子能夠推動自身轉座，還能轉座細胞RNA。V（D）J重組中的早期活動是通過一種類似于轉座子切除的機制實現的。第3篇基因組的表達轉錄機制知識點：轉錄機制與復制機制的區別：答：（1）轉錄得到的新鏈是由核糖核苷酸組成的，而不是脫氧核糖核苷酸。（2）RNA聚合酶（RNApolymerase，催化RNA合成的酶）不需要引物，它能夠從頭起始轉錄（盡管，如我們將要討論的，細胞內的轉錄必須在特定的序列上才能起始）。（3）RNA產物不與模板DNA鏈的堿基保持互補狀態。（4）轉錄盡管是非常精確的（每添加10000個核苷酸會發生一次錯誤），但還是不如復制更為精確（每10000000個核苷酸發生一次錯誤）。（5）轉錄僅是有選擇性地復制基因組的特定部分，并從任何特定的部分產生一個到幾百個，或者甚至上千個拷貝。（6）轉錄區域的選擇并不是隨機的；每個轉錄區域通常包括一個或多個基因，而且在每個轉錄區域的首端和尾端都存在特定的DNA序列指導轉錄的起始和終止。RNA聚合酶具有不同形式：答：細菌只有一種RNA聚合酶，而真核細胞中則有3中：RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。聚合酶Ⅱ（PolⅡ）是負責轉錄大多數基因的酶——實際上，是轉錄幾乎所有蛋白質編碼基因的酶。聚合酶Ⅰ（PolⅠ）和聚合酶Ⅲ（PolⅢ）分別參與轉錄專門的RNA編碼基因。具體來說，PolⅠ轉錄的是大核糖體RNA前體基因，而PolⅢ轉錄的是tRNA的基因、一些小的核RNA的基因和5SrRNA的基因。為轉錄一個基因，RNA聚合酶要進行一系列定義明確的步驟，這些步驟分為3個階段（phase）：答：（1）起始（initiation）：啟動子（promoter）是最初結合RNA聚合酶的DNA序列（在很多情況下是與轉錄起始因子一起結合的）。啟動子-聚合酶復合體一旦形成就發生結構改變，以使起始過程繼續進行。（2）延伸（elongation）：一旦RNA聚合酶已經合成了一小段RNA（10個堿基左右），轉錄便進入了延伸階段。這一轉變需要聚合酶構象的進一步改變，以使其能夠更牢固地與模板結合。在延伸階段，RNA聚合酶除催化RNA的合成外，還執行著多項重要任務。它解開前方的DNA，又使后方的DNA重新復性；在移動的同時，逐步分開正在延長的RNA鏈與模板的配對；而且還執行校正的功能。（3）終止（termination）：一旦RNA聚合酶轉錄了整個基因（或整組基因），它必須停下來并釋放RNA產物。這一步驟稱為終止。在某些細胞中，存在著特定的、已研究清楚的引發終止的序列；而在其他一些細胞中，是什么使聚合酶停止轉錄并從模板上分離，還不十分清楚。轉錄起始包括三個定義明確的步驟：答：轉錄周期（transcriptioncycle）的第一個階段——起始又可以分為一系列定義明確的步驟。第一步是聚合酶與啟動子初步結合形成所謂的閉合式復合體（closedcomplex），這時DNA還保持著雙鏈狀態，聚合酶結合在螺旋的一個面上。第二步是閉合式復合體經過轉變而成為開放式復合體（opencomplex），DNA雙鏈在起始位點周圍大約14bp的距離內分開以形成轉錄泡。第三步，最初的大約10個左右的核糖核苷酸的結合是一個效率相當低的過程，在這一階段，聚合酶經常釋放出很短的轉錄物（每一個都短于10個左右的核苷酸），然后再重新開始合成。一旦某個聚合酶超過了10bp，就可以說它逃離了啟動子。這時，它已經形成了一個穩定的三重復合體（stableternarycomplex），包括酶、DNA和RNA。細菌的啟動子在強度和序列上是多樣的，但是具有某些明確的特征：答：一個稱為σ的起始因子的添加，使得核心酶轉變為只在啟動子處起始轉錄的形式。該酶的這種形式稱為RNA聚合酶的全酶（holoenzyme）。在大腸桿菌中，最常見的σ因子稱為σ70。含有σ70的聚合酶識別的啟動子具有以下共同的特征性結構：兩段6個核苷酸長的保守序列，被長為17~19個核苷酸的非特異序列所分割。這兩段序列稱為﹣35和﹣10區域（region）或元件（element）。具有與共有序列更近似的序列的啟動子通常要比那些匹配較差的啟動子“更強”。所謂啟動子的強度，我們是指一個啟動子在一定的時間內可以起始多少個轉錄物。在一些較強的啟動子中，如在指導核糖體RNA（rRNA）基因表達的啟動子中，發現了一個額外的與RNA聚合酶結合的DNA元件，稱為UP元件（UP-element）。它可以通過提供額外的特異性相互作用而增強聚合酶與DNA的結合。另一類型的σ70啟動子缺乏﹣35區域，而是由一個所謂的“延長的﹣10區域”元件。σ因子介導聚合酶與啟動子的結合：答：σ70因子可以分為4個區域，稱為σ區域1~σ區域4。區域4內的兩個螺旋形成一個常見的DNA結合基序，稱為螺旋-轉角-螺旋（helix-turn-helix）。其中一個螺旋插入到﹣35區域的大溝（majorgroove）中并與該區的堿基相互作用；另一個則從大溝的頂部橫過，與DNA骨架接觸。﹣10區域也被一個α螺旋所識別。但是其相互作用尚未徹底研究清楚而且更為復雜。延長的﹣10元件，如果存在的話，被σ區域3中的一個α螺旋所識別，此螺旋與組成這一元件的兩個特異性的堿基對接觸。與啟動子內的其他元件不同，UP元件并不被σ因子所識別，而是由α亞基的羧基末端域（αCTD）來識別。向開放式復合體的轉變過程涉及RNA聚合酶和啟動子DNA的結構變化：答：從閉合式復合體到開放式復合體的轉變過程涉及聚合酶的結構變化，以及DNA雙鏈的打開，從而暴露出模板鏈和非模板鏈。相對于轉錄起始位點而言，這一“融化”發生在﹣11和﹢3之間的區域。對于含有σ70因子的細菌聚合酶，這一轉變常被稱為異構化作用（isomerization）。首先，位于聚合酶前部的鉗子牢固地鉗壓在下游DNA上；第二，σ的N端區域（區域1.1）的位置有一個重要的移動，在未結合DNA時，σ區域1.1處于全酶的活性中心裂隙內部，阻斷著開放式復合體中模板DNA鏈經過的路線。在開放式復合體中，區域1.1移動了大約50?的距離，出現在酶的外部，使得DNA可以進到裂隙中。轉錄由RNA聚合酶起始，不需要引物：答：聚合酶必須與起始核苷酸建立特異性的相互作用，嚴格控制其處于正確的方向，使其可以對引入的核苷三磷酸開始進行化學反應。此相互作用對A是特異的，因而只有以A開始的鏈才能以適于高效起始的方式固定。RNA聚合酶在進入延伸階段之前會先合成幾段短的RNA：答：一旦核苷酸進入了活性中心裂隙并且RNA開始合成，接下來就進入了稱為流產性起始（abortiveinitiation）的時期。在這一階段，聚合酶會合成一些長度小于10個核苷酸的RNA分子。σ因子的一個區域再一次作為一個分子模擬物參與了此過程。這一次是區域3.2，模擬的是RNA。σ的這一區域位于開放式復合體的RNA出口通道的中部，為了使合成長度超過大約10個核苷酸的RNA鏈，σ的這一區域必須從此位置上被逐出，這個過程需要聚合酶嘗試幾次才能成功。延伸聚合酶是一個邊合成邊校對RNA的向前行進的機器：答：DNA通過延伸酶的形式與通過開放式復合體相似，雙鏈DNA在兩個鉗子之間進入酶的前部。在催化裂隙的開口處，兩條鏈分別沿著不同的路徑穿過酶，然后從各自的通道離開酶，并在延伸聚合酶（elongationpolymerase）的后面重新形成雙螺旋結構。核苷酸通過其固定的通道進入活性位點，并在模板DNA鏈的引導下添加到增