最好的沉淀整理1、免疫標(biāo)記法及其分類 1）熒光免疫法：

原理是應(yīng)用一對單克隆抗體的夾心法。底物用磷酸甲基傘形酮，檢測產(chǎn)物發(fā)出的熒光，熒光強(qiáng)度與Mb濃度呈正比，可在8min內(nèi)得出結(jié)果。結(jié)果以Mb每小時(shí)釋放的速率表示△Mb)表示。該法重復(fù)性好，線性范圍寬，具有快速、敏感、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

以雙抗夾心法為例，首先將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體。除去未結(jié)合抗體，然后加受檢標(biāo)本，使其中的蛋白抗原與固相抗體形成抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去未結(jié)合物，接著加入熒光標(biāo)記的抗體，使之與抗原特異性結(jié)合，形成抗體—抗原—最后根據(jù)熒光強(qiáng)度，即可對蛋白抗原進(jìn)行定量。

傳統(tǒng)的熒光免疫法受本底熒光的干擾較大，時(shí)間分辨熒光免疫測定法是以具有特長壽

命的稀土金屬如銪，作為標(biāo)記物，加入正常液后激發(fā)測定，能有效去除短壽命本底熒光的干擾。 2）放射免疫法 放射免疫法是以過量的未標(biāo)記抗原與放射性物質(zhì)標(biāo)記的抗原，競爭性地與抗體結(jié)合，形成有放射性的抗原—抗體復(fù)合物與無放射性的抗原—抗體復(fù)合物，并有過剩未標(biāo)記的抗原。然后通過離心沉淀等方法，將抗原—抗體復(fù)合物與游離抗原分離，分別測其放射性強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，即可對未標(biāo)記的待測抗原進(jìn)行定量。RIA法測定血清蛋白靈敏度高、特異性強(qiáng)，可準(zhǔn)確定量到ng／ml水平。但早期的方法麻煩，耗時(shí)長，且有放射性污染。近年來，隨著單克隆抗體的應(yīng)用，RIA的靈敏度又有大提高，且操作大為簡化，并已有商品試劑盒供應(yīng)，使用方便。 3）酶聯(lián)免疫法(ELISA)

ELISA法有競爭法和夾心法兩種。競爭法是基于標(biāo)準(zhǔn)或血清Mb和微孑L板上包被的

Mb競爭性地與單克隆抗體相結(jié)合的原理而建立，該法的最低檢測限為10μg／L，線性范圍達(dá)／L。夾心ELISA法與A具有良好的相關(guān)性＝。ELISA法具有靈敏度高特異性強(qiáng)，精密度好，操作簡單，適用于多份標(biāo)本的檢測，不需特殊儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，易于推廣普及。但不適合急診的快速檢測。

以雙抗法為例。首先包被抗原，然后加入一抗，使一抗與包被抗原形成抗原—抗體復(fù)合物。接著加入酶標(biāo)二抗，形成抗原—抗體—抗體復(fù)合物。最后加入底物，由酶催化底物生成產(chǎn)物。通過產(chǎn)物的生成量即可對蛋白抗原進(jìn)行定量。

4）偶聯(lián)生物素—親和素系統(tǒng)的酶免法

利用了一個(gè)親和素分子可以與4個(gè)生物素分子結(jié)合的特性，使傳統(tǒng)的靈敏度較高的酶

免法的靈敏度又有明顯的放大作用。 5）時(shí)間分辨熒光免疫分析 時(shí)間分辨熒光免疫分析（，TRFIA）是一種非同位素免疫分析技術(shù)，它用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點(diǎn)，用時(shí)間辨技術(shù)測量熒光，同時(shí)檢測波長和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號分辨，可有效地排除非干擾，極大地提高了分析靈敏度。 6）解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻治?/p>

解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻治觯―ELFIA）是時(shí)間分辨熒光免疫分析中的一種。它用具有雙功能基團(tuán)結(jié)構(gòu)的螯合劑，使其一端與銪（Eu）連接，另一端與抗體抗原分子上的自由氨基連接，形成EU標(biāo)記的抗體

種增強(qiáng)劑，使Eu3從復(fù)合物上解離下來，自由Eu3這種分析方法使用了解離增強(qiáng)步驟，因此稱為解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻治觥?、熒光抗體染色方法及其分類 1）直接染色法

將標(biāo)記的特異熒光抗體直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定溫度和時(shí)間的染色，洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，在熒光顯微鏡下便可見到被檢抗原與熒光抗體形成的特異性結(jié)合物而發(fā)出的熒光。直接染色法的優(yōu)點(diǎn)是：特異性高，操作簡便，比較快速。缺點(diǎn)是：一種標(biāo)記抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。直接法應(yīng)設(shè)陰、陽性標(biāo)本對照，抑制試驗(yàn)對照。

2）間接染色法

如果檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（第一抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，作用一定時(shí)間后，洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體即抗球蛋白抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，如果第一步中的抗原抗體互相發(fā)生了反應(yīng)，則抗體被固定或與熒光素標(biāo)記的抗抗體結(jié)合，形成抗原抗體抗抗體復(fù)合物，再洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗抗體，在熒光顯微鏡下可見熒光。在間接染色法中，第一步使用的未用熒光素標(biāo)記的抗體起著雙重作用，對抗原來說起抗體的作用，對第二步的抗抗體又起抗原作用。如果檢查未知抗體則抗原標(biāo)本為已知的待檢血清為第一抗體，基他步驟和檢查抗原相同。

由于免疫球蛋白有種屬特異性，因此標(biāo)記的抗球蛋白抗體必須用第一抗體同種的動物血清球蛋白免疫其他動物來制備。

間接染色法的優(yōu)點(diǎn)是既能檢查未知抗原，也能檢查求知抗體；用一種標(biāo)記的抗球蛋白抗體，能與在種屬上相同的所有動物的抗體結(jié)合，檢查各種未知抗原或抗體，敏感性高。缺點(diǎn)是：由于參加反應(yīng)的因素較多，受干擾的可能性也較大，判定結(jié)果有時(shí)較難，操作繁瑣對照較多，時(shí)間長。間接法應(yīng)設(shè)陰、陽性標(biāo)本對照，還應(yīng)設(shè)有中間層對照（即中間層加陰性血清代替陽性血清）。 3）抗補(bǔ)體染色法

抗補(bǔ)體染色法簡稱補(bǔ)體法，是間接染色法的一種改良法，首先由r等建立。

本法利用補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)的原理，用熒光素標(biāo)記抗補(bǔ)體抗體，鑒定未知抗原或未知抗體（待檢血清）。染色程序也分二步：先將未標(biāo)記的抗體和補(bǔ)體加在抗原標(biāo)本上，使其發(fā)生反應(yīng)，水洗，然后再加標(biāo)記的抗補(bǔ)體抗體。如果第一步中抗原抗體發(fā)生反應(yīng)，形成復(fù)合物，則補(bǔ)體便被抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，第二步加入的熒光素標(biāo)記的抗補(bǔ)體抗體便與補(bǔ)使之形成抗原抗體補(bǔ)體抗補(bǔ)體抗體復(fù)合物，發(fā)出熒光。

抗補(bǔ)體染色法具有和間接法相同的優(yōu)點(diǎn)，此外，還有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：即只需要一種標(biāo)記

抗補(bǔ)體抗體，便能檢測各種抗原抗體系統(tǒng)。因?yàn)檠a(bǔ)體的作用沒有特異性，它可以與任何哺乳動物的抗原抗體系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)。它的缺點(diǎn)是參與反應(yīng)的成分多，染色程序較復(fù)雜，比較麻煩。

除上述三種方法外，還有在此基礎(chǔ)上演變出的一些方法，如雙層法、夾心法、混合法、

三層法、抗體抗補(bǔ)體法等等。3、熒光抗體的制備 1）免疫血清的制備及免疫球蛋白的提純

制備高效價(jià)的特異性抗血清是免疫熒光技術(shù)成功的前提。為此，用于免疫的抗原必須

高度提純，盡可能不含其他非特異性的抗抗原物質(zhì)，血清的效價(jià)與特異性是矛盾的，通常高效價(jià)的免疫血清為好，因?yàn)橛眠@種血清制備熒光抗體，即使其中含有少量非特異抗體，

可以通過稀釋法將其除去。為提高血清效價(jià)，在制備免疫原時(shí)，通常采用大劑量加佐劑，長程免疫，其中以弗氏不完全佐劑最常用。即按抗原1份，無水羊毛脂1份，液體石蠟2份混需提純后使用，這樣不但可以提高抗體的效價(jià)，而且還可以排除γ鍵一環(huán)。在免疫熒光技術(shù)中所應(yīng)用的特異性抗體，主要是飽和硫酸銨鹽析法比較簡便，也可用分子篩層析法（即葡聚糖凝膠過濾），以析法等，或先用鹽析法精提，然后再經(jīng)過層析柱進(jìn)一步純化。、鏡檢標(biāo)本片的制備

熒光抗體染色是顯微鏡標(biāo)本上的抗原—抗體反應(yīng)。采集病料以后，必須制成鏡檢標(biāo)本。

作為檢測抗原目的標(biāo)本片，細(xì)菌檢樣如血液、膿汁、糞便、分泌物等可進(jìn)行涂片；病毒檢樣可將組織進(jìn)行冰凍切片或石蠟封片，或?qū)⒉《静牧辖臃N細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，作成單層蓋片。如為檢測抗體的標(biāo)本片，可直接作標(biāo)準(zhǔn)菌株涂片或用標(biāo)準(zhǔn)毒株接種細(xì)胞培養(yǎng)，作成單層蓋片。

1）制片 涂片和壓印片是診斷工作中最常用的方法。涂片方法按常規(guī)進(jìn)行。壓印片是將被檢組織塊切開，用濾紙吸干切面的血液之后，以載玻片在切面上輕壓，使之粘上1—2層細(xì)胞。

冰凍切片： 將感染的動物組織切成約3mm2的小塊，置冷臺上，以6％明膠液作支持物，迅速冷

凍至℃——℃后壓片。切片厚8μm，用載玻片貼片，丙酮固定，準(zhǔn)備染色。

石蠟切片： 將病理組織切成3mm2的小塊，浸入95％酒精1h，再分別通過無水酒精4缸各10min，

通過二甲苯3缸各10min，通過56—58度融蠟包埋各16min隨后制片，漂浮于40度水中，立即用載玻片撈出（不超過1min）。室溫或37度干燥后，通過二甲苯3缸各3min，順序通過95％、80％、60％、40％酒精各1min去二甲苯，再以PH值S蘸浸3次各3min，干燥后染色。 組織培養(yǎng)單層細(xì)胞：

將蓋玻片切成寬4—5mm的小玻片，裝入小培養(yǎng)瓶內(nèi)，按常規(guī)方法培養(yǎng)接種病毒的敏

感細(xì)胞。待細(xì)胞在玻片上長成單層后，即可接種病料，經(jīng)不同時(shí)間后（隨病毒種類而異），

取出被感染的細(xì)胞玻片，在PBS液中涮洗，干燥，置丙酮中固定后，準(zhǔn)備染色。

2）熒光色素的標(biāo)記

能夠產(chǎn)生明顯熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物稱為熒光色素或熒光染料。用于標(biāo)記抗體的熒光色素，必須具有化學(xué)上的活性基因，能與蛋白質(zhì)穩(wěn)定結(jié)合，且不影響標(biāo)記抗體的生物活性及抗原抗體的特異性結(jié)合。適于標(biāo)記蛋白的熒光色素主要有異硫氰酸熒光黃

（，F(xiàn)ITC），四乙基羅達(dá)明（，RB200）和四甲基異硫氰基羅達(dá)明，TMRITC)。實(shí)際上目前應(yīng)用最多的只有異

硫氰酸熒光黃一種。 C標(biāo)記 C為黃色結(jié)晶形粉末，分子量為389，易溶于水和酒精等溶劑中，溶解后呈黃綠色熒光，最大吸收光譜490-495nm，的溶液不穩(wěn)定，易因水解或迭聚而變質(zhì)，故配好后2h內(nèi)應(yīng)用。C含有異硫氰基，在堿性條件下能與G的自由氨基（主要是賴氨酸的ε氨基）結(jié)合，形成熒光抗體結(jié)合物。一個(gè)分子的G有86個(gè)賴氨酸殘基，但一般最多只能標(biāo)記0個(gè)

①直接標(biāo)記法

取抗體球蛋白溶液10ml，碳酸鹽緩沖液3ml，生理鹽水17ml，混合，在4℃電磁攪拌

下加FITC3mg（先溶解在3ml緩沖液中），在4℃繼續(xù)攪拌，將結(jié)合物通過已平衡好的5柱，以除去未結(jié)合的游離熒光素。 ②透析標(biāo)記法 將抗體球蛋白溶液用碳酸鹽緩沖液（，0調(diào)動1%(W/V，并裝入透析袋中，按蛋白質(zhì)量的0稱取C溶于10沒于C液中，于4℃攪拌h取出透析袋于，pH7.2PBS中透析4h物通過已平衡好的5柱，去除游離熒光素。 (2)RB200標(biāo)記 本品為無定形褐紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存，

分子量為580，最大吸收光譜為570nm，呈明亮的橙色熒光，因與C的黃綠色有明顯區(qū)別，故被廣泛用于對比染色或用于兩種不同顏色的熒光抗體的雙重染色。方法為：取1gRB200及五氯化磷（PCL5）2g放乳缽中研磨（在毒氣操作櫥中），加10ml放5min，隨時(shí)攪拌，過濾，用所得溶液進(jìn)行結(jié)合。將每亳升血清1m生理鹽水碳酸鹽緩沖液（，）稀釋，逐滴加入0溶液，隨加隨攪拌，在繼續(xù)攪拌。 (3)TMRITC標(biāo)記

TMRIT為紫紅色粉末，性能比較穩(wěn)定，分子量443，最大吸收光譜550nm，呈橙紅色熒光。其結(jié)合方法與C的直接標(biāo)記法相同，只是所加色素量為蛋白質(zhì)量的，結(jié)合時(shí)間持續(xù)。 影響標(biāo)記的主要因素

溫度、時(shí)間、酸堿度和標(biāo)記量4個(gè)因素。溫度低，標(biāo)記時(shí)間長，溫度高，標(biāo)記時(shí)間應(yīng)

短。℃以h為宜，℃以h為宜，37℃n為宜。pH低時(shí)，標(biāo)記較

慢，pH值偏高（大于10），抗體易變性，pH值5最為適宜。抗體蛋白含量低，標(biāo)記慢以每毫升20-25m蛋白為宜。至于標(biāo)記方法，各有特點(diǎn)，但均不能去除非特異熒光染色因素。透析法適用于小體積的標(biāo)記。 3）標(biāo)記抗體的純化

抗體標(biāo)記以后，應(yīng)立即進(jìn)行純化處理，以消除或降低非特異性染色和特異交叉染色。其步驟如下： 標(biāo)記抗體溶液 ↓透析或凝膠過濾 去除游離熒光色素 （粗制熒光抗體） ↓DEAE纖維素層析 去除過度標(biāo)記的蛋白分子 （精制熒光抗體） ↓抗原交叉吸收或組織制劑吸收 去除特異交叉反應(yīng)的標(biāo)記杭體 （免疫純熒光抗體）

根據(jù)免疫熒光試劑的具體用途，純化的方法可以不同，并不是每一種熒光試劑都須經(jīng)

過以上全部過程。對于某些細(xì)菌診斷試劑，只要除去游離熒光素就可以，檢測病毒抗原的熒光抗體一般要求下述處理： 游離熒光素的去除

去除標(biāo)記過程中未與蛋白質(zhì)結(jié)合的游離熒光素，是純化標(biāo)記試劑的最基本要求，不經(jīng)

過這一步處理，任何免疫熒光試劑都不能應(yīng)用。

①半透膜透析法

利用熒光色素分子可以通過半透膜，而蛋白分子則因分子量大不能通過的原理，逐步將游離色素除去。先將標(biāo)記好的抗體溶液裝于透析袋或玻璃紙袋內(nèi)，注意使液面上留有一定空間，扎緊袋口，先用流動自來水透析，再轉(zhuǎn)入，或生理鹽水中繼續(xù)透析，外液量至少大于內(nèi)液量0倍，透析應(yīng)在低溫（℃）下進(jìn)行，每天換液次，整個(gè)透析時(shí)間約需1周左右，時(shí)間過長容易造成蛋白質(zhì)變性，影響熒光抗體的質(zhì)量。取透析液（外液）以紫外線燈檢查，若無熒光出現(xiàn)，即可停止透析。 ②凝膠過濾法

利用熒光色素分子和蛋白質(zhì)分子量的懸殊差別，通過分子篩除去游離熒光素，一般1h

以內(nèi)即能完成操作，但最好與透析法結(jié)合進(jìn)行。先將標(biāo)記抗體溶液透析，除去大部分游離熒光素和其他小分子物質(zhì)以后，再進(jìn)行凝膠過濾，這樣有利于保護(hù)凝膠柱，延凝膠柱5和G50裝好后，以洗脫液（L或，平衡，然后加入樣品，樣品與柱床容積的比例2以下皆可。樣品全部進(jìn)入柱床后，即可進(jìn)行洗脫。應(yīng)用此法可使游離熒光素完全除去，同時(shí)熒光抗體可以100%回收。 抗原對照：已知抗原加正常同種動物標(biāo)記球蛋白溶液染色，應(yīng)無熒光。

阻抑試驗(yàn)：標(biāo)本滴加同種未標(biāo)記抗體感作30min后，再加標(biāo)記抗體，鏡檢應(yīng)無熒光現(xiàn)

象。 種屬抗原染色：標(biāo)記抗體與種屬抗原標(biāo)本染色，應(yīng)無熒光出現(xiàn)。

陽性對照：標(biāo)記抗體與已知抗原染色，應(yīng)呈強(qiáng)熒光反應(yīng)。對照染色可根據(jù)條件適當(dāng)選

擇。 間接法染色 該方法可用于雞傳染性支氣管炎病毒抗體及其它禽病病原及抗體的檢測。優(yōu)點(diǎn)是既能

檢測病原又能檢測相應(yīng)抗體。如檢查抗原，于被檢標(biāo)本上滴加已知的未標(biāo)記抗體溶液；如查抗體，于已知抗原標(biāo)本上滴加待檢血清。 ①標(biāo)本經(jīng)固定后，于被檢標(biāo)本上滴加已知未標(biāo)記的抗體（或抗原）置濕盒37℃感作

30min。 ②先以pH7.2PBS沖洗，然后浸泡于三缸PBS中，每缸3min并注意振蕩。 ③棄掉PBS，用吸水紙吸干。 ④滴加相應(yīng)的抗球蛋白熒光抗體，置濕盒℃感作30min。 ⑤以上以PBS浸洗3次，最后用蒸餾水洗1次，緩沖甘油封片后鏡檢。 ⑥對照染色間接法首次試驗(yàn)設(shè)置對照，隨后可酌情減少。

間接熒光抗體染色的對照試驗(yàn)

①被檢標(biāo)本加抗球蛋白熒光抗體，應(yīng)無熒光出現(xiàn)。

②標(biāo)本先以相應(yīng)正常動物的血清處30min，水洗后再以抗球蛋白抗體染色，應(yīng)無熒光出現(xiàn)。 ③陽性對照已知陽性標(biāo)本加相應(yīng)的特異性免疫血清，然后再以抗球蛋白熒光抗體染色，應(yīng)出現(xiàn)特異的明亮熒光。 抗原（標(biāo)本第一步應(yīng)用的試劑第二步應(yīng)用的試劑結(jié)果 同種的無或用PBS無或用PBS無熒光現(xiàn)象 SPF雞血清標(biāo)記抗球蛋白熒光抗體無熒光現(xiàn)象 特異性抗血清標(biāo)記抗球蛋白熒光抗體強(qiáng)熒光 特異性抗血清標(biāo)記SPF血清球蛋白熒光抗體無熒光現(xiàn)象 異種的特異性抗血清標(biāo)記抗球蛋白熒光抗體無熒光現(xiàn)象

過度標(biāo)記的蛋白分子的去除

去除游離熒光素后，結(jié)合物中存在的未標(biāo)記的和過度標(biāo)記的蛋白質(zhì)，是降低染色效價(jià)和出現(xiàn)非特異性染色的主要因素。常用的方法是DEAE-纖維素或DEAD-部分（易降低敏感性）自由流出，從而可以得到熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合比最適的部分。

DEAD-纖維柱用PBS平衡后，柱上端放一大小合適的濾紙片，打開下口，調(diào)解流速至每分滴左右，待柱上液面剩一薄PB尚離一薄層時(shí)，用適量PBS沖洗管壁，然后用大量，pH7.2PB洗脫，用20%基水楊酸液試測洗脫液。待蛋白出現(xiàn)陽性反應(yīng)時(shí)即可收集，蛋白反應(yīng)陰轉(zhuǎn)時(shí)停止收集，該