..;.;.近年來白血病的免疫分型已成為診斷血液惡性腫瘤不可缺少的重要標準之一。早年曾用過的熒光顯微鏡或P利用熒光素標記的單克隆抗體（McAb）作分子探針，多參數分析白血病細胞的細胞膜和細胞漿或細胞核的免疫表型，由此了解被測白血病細胞所屬細胞系列及其分化程度。流式細胞儀診斷白血病的依據⑴FCM能快速，多參數，客觀的定性又定量測定細胞膜、漿、核的抗原表達⑵至今尚未發現白血病的特異抗原。⑶能用正常血細胞的單抗來進行免疫分型是基于白血病形成的分化阻斷學說。即白血病細胞基因異常，分化受阻于某階段形成不同亞型的白血病。這群細胞充盈于骨髓。正常血細胞從多能干細胞分化、發育、成熟為功能細胞的過程中，細胞膜、細胞漿或胞核抗原的出現、表達增多與減少甚至消失與血細胞的分化發育階段密切相關，而且表現出與細胞系列及其分化程度相關的特異性。因此，這些抗原的表達與否可作為鑒別和分類血細胞的基礎。白血病是造血系統的惡性腫瘤，在形態上變化雖相當大，但仍能表達正常血細胞所具有的抗原，因而仍可依據其抗原的表達譜對白血病進行免疫分型。流式細胞儀診斷白血病的意義MIC形態學、細胞化學染色不能肯定細胞來源的白血病。②形態學為急性淋巴細胞白血病（ALL）或急性未分化白血病（AUL）但缺乏特異性淋巴細胞系列抗原標記。③混合性白血病。④部分髓系白血病。目前，免疫分型對粒細胞和單核細胞白血病的鑒別尚有一定困難。⑤慢性淋巴細胞白血病。⑥微小殘留白血病。CD7CD34⑶ 二、免疫分型常用的免疫標志及其意義1．白血病系列分化抗原T淋巴細胞白血病：CD3、CD5、CD7。B淋巴細胞白血病：CD10、CD19、CD22。NK淋巴細胞白血病：CD16、CD56、CD57。：CD13、CD14、CD33、MPO（髓過氧化物酶。紅白血病A（A。巨核細胞白血病：CD41、CD42、CD61。2．白血病系列非特異性抗原CD34、HLA－DR為早期細胞抗原，無系列特異性，可與CD38聯合運用于免疫分型。一般而言，干/祖細胞CD34＋、HLA－DR＋、CD38－，原始細胞CD34＋、HLA－DR＋、CD38＋，而幼稚細胞（如早幼粒細胞）CD34－、HLA－DR－、CD38＋。白血病分化階段抗原TCD4、CD8B：CD10、Cyμ（胞漿μ鏈、SmIg（表面膜免疫球蛋白、CD38CyIg（胞漿免疫球蛋白、CD11C。白細胞共同抗原CD45次減弱。紅細胞（中，晚幼紅細胞，成熟紅細胞）CD45SSC/CD45PerCPMcAbCD45SSCMcAbl-FITCMcAb2-PECD45PerCP三、白血病及淋巴瘤免疫分型1．AMLSSCCD45－SSCCD13MPOCD13CD33CD7CD4HLA－DR、CD34陽性，有些研究表明CD7與CD34共表達在AML且預后差。M1：流式上M1與M0相似不易區分，M1一般CD13＋、CD33＋、HLA－DR－，但CD34表達少于M0，可能表達部分CD15。M2：M0M1blastsCD15M1CD34M1，CD13，多數病例A－R（。－Ct區至成熟骨髓細胞區的連續細胞帶，CD45－SSCblastsM3SSCCD45CHLA－DR（-）或表達減少，CD343（＋2445（＋45SSC，CD45－SSC圖上，成熟CCD13CD33HLA－DRCD14，33，（＋、3（－、（－）5，但只出現在5（＋。M6：M6HLA－DR，CD34CD13CD33CD45－SSCM7：巨核細胞白血病，在AML中少于1％。一般CD61（GpⅢa）和/或CD41（GpⅡb-Ⅲa）陽性，而注意由于血小板粘附在blasts上造成的假陽性，可以用流式雙色分析在EDTA存在下，測GpⅡb/Ⅲa與CD34以減少激活血小板的粘附。ALL：ALL是兒童中最常見的惡性腫瘤，約占全部腫瘤的25％，在成人，ALL約占急性白血病的25％，我們將ALL分為B祖細胞型，CD10＋或CD10－，前B細胞型，B細胞型，T細胞型。B祖細胞型ALL：ALL65％～7055％～60％，50％90％CD10＋，在幼兒只有少于50％病例CD10＋，blasts一般FSC、SSC很少，是FAB標準的L1或L2，一般2CD10CD24＋，CD34＋，CD20BsIg-。BALL：ALL25％，細胞一般為＋，胞漿CD20多為陰性，前BBt(1；19)出現相關并由此產生E2A－PBX1融合蛋白，它的表型為CD19＋、CD10＋、CD9＋，不同程度CD20表達，CD34－，確認此表型有助于診斷基因上不確定的病例。B細胞型ALL：BL％～5％BLBLC－SSCFABL3CD19CD20CD22CD24sIg（多數為IGM）多數病例CD10＋。但成熟抗原及sIg使之區別于更早的B系ALL，極少數成熟B細胞ALL無FAB－L3形態。T－ALLFSC、SSCCD45－SSCCD2CD5CD7CD4/CD8CD3、TdTCD2、CD5、CD7、TdTCD2、CD5、CD7CD3＋CD4＋/CD3+CD8+TdTTCD7CD3＋且無其它T，TT合。雜合型白血病：或（3，現在雜合型的誤診率很高。最常導致誤診的原因是在分析中未能排除非白細胞，過度強調弱的非特異性結合，忽略了某些抗體缺乏系特異性，最重要的系特異性抗原在B系、T系、髓系分別為CD22、CD3MPO。CML：CD45－SSCCML1急變期亞型的診斷具有極高價值。直接影響到治療效果。急變期CML主要表現為髓系，偶為淋系，髓性急變可表現出多種形態包括未分化細胞。淋性急變具典型形態特征，為CD10＋B祖細胞ALL極少有T細胞型ALL。CLL：CLL細胞主要為較正常淋巴細胞稍大的小淋巴細胞。免疫分型主要為：SIgM、SIgD弱表達，B系抗原為CD19CD20CD43CD79aCD5CLL（CLL：＋，：3－，0－、－、c5、0LCLLtrisony1214q13q11q，trisony12SIg、CD20CD23－相關與FMC7BCLLB－DLLCLLCD5－，CD22＋，sig。MU5CLLCLLCD5＋BSigCLLCD22－。另一與CLL難于區分的是FCC，細胞為強Sig、CD5－、CD10＋、CD23＋，具B系表型：對于診斷為CLL，CD5、FMC7、CD22與SIg，CD20異常強表表達的病例我們要考慮是否為DLL、MCC或CLL的亞型（trisomy12）因為它們危險性更大。四、流式細胞儀免疫分型實驗1．脊液、皮膚、黏膜（內窺鏡活檢物、細針穿刺物等等。、ACDEDTA、ACD的優點是成熟髓性細胞貼壁造成的損失及血小板聚集較小，但細胞散射光特征丟失較ACDpHACD⑶樣本的保存：樣本的完整性和細胞活性與抗凝劑的選擇、運輸、保存和溫度息息相關。①理想狀態下，樣本應在采集后立刻進行處理和染色。②短期保存（1小時或更短）應在室溫(18-22℃);③長時間保存血或骨髓標本室溫即可，有些樣本可能4℃為佳。④標本保存的時間上限取決于標本類型及其保存條件。⑤肝素抗凝的血和骨髓通常可保存至48-72小時；⑥EDTA抗凝的血和骨髓可保存至12－24小時。⑦ACD抗凝的血和骨髓可保存至72小時，但⑧對于只做胞內染色的樣本，可固定細胞以長期保存。但?quot;固定－染色"的方法取決于要分析的抗原特性和染色方式，采用之前一定要進行新鮮標本的對照和驗證實驗。樣本制備⑴單細胞懸液的制備50um斷靶細胞群體是否仍然存在。②組織塊：機械分離和酶分離兩種方法。分離不僅是要獲得最大產量的單細胞懸液，還要盡量保證細胞結構的完整性和抗原性。大多數淋巴樣組織可用輕柔的機械方法快速分離，并保持收獲細胞的相對完整。某些組織由于細胞間連接緊密，需在機械分離的基礎上用蛋白水解酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶。骨髓標本亦可能因骨細胞成分污染而需要酶消化。但使用酶法一定要確認酶的使用沒有改變、減弱靶抗原的表達，細胞活性沒有顯著降低。⑵分離靶細胞群體樣本的任何處理方式都可能導致靶細胞群體的丟失。所以應盡可能使用最接近原始標本狀態的處理過程。去除紅細胞是流式分析要求的至少步驟。兩種方法：①紅細胞裂解：較佳。操作簡單、快、并最可能保持原始標本的白細胞分布。溶血劑的選擇應基于其選擇性去除成熟紅細胞而最小程度的影響其他細胞的特點。最好在染色后溶血。若在染色前溶血，需確認：抗原性不被溶血過程改變；溶血劑被徹底洗去，細胞和抗體結合的動力反應未受影響；所用溶血劑不含固定劑，否則會影響細胞活性及表面標記結果。②度梯度離心：白血病細胞回收較好并可能得到富集，同時去除死細胞。但費時，白血病細胞的相對頻率較難分析，某些重要細胞群體可能選擇性丟失。根據密度梯度原理，若白血病細胞沒有與淋巴細胞相似的浮力密度即可能丟失。所以用此方法時應檢查各層細胞特性以防止靶細胞的丟失。⑶估細胞懸液①樣本外觀：有嚴重溶血和血凝塊的標本可能會有白細胞的損壞以及細胞亞群的丟失或改變，應棄用。②細胞丟失和分布：確認細胞形態和原始標本相似。密度梯度離心之后更應檢查細胞分布。可做血涂片判斷。③細胞計數和濃度調整：廠家推薦的抗體濃度通常是假定靶細胞數量在正常范圍內 (500,000-1,000,000／testAb)。白細胞數量上的顯著變化會帶來染色模式的變化。而白血病標本常常有異常的白細胞數量，骨髓標本也可能被外周血稀釋，這些標本的細胞性可能有極大的變異。因此有些標本沒有足夠的細胞做流式分析，有些則由于細胞量大，正常濃度下的抗體相對不足，不能飽和所有的結合位點，導致假陽性結果。所以染色前的細胞計數非常必要。推薦方法：WBC<1000/uL:用200uL全血并調整相應溶血劑用量；WBC:1000-10000/uL,用100uLWBC:10000-20000/uL,用50uL相應溶血劑用量；WBC>20000/uL，用稀釋至(2)(3PBS1:10（如自己稀釋抗體④細胞活性：死細胞對許多抗體有非特異性染色，有些抗原同時存在于胞膜和胞漿，這就使樣本的細胞活ǔＳ辛街鄭、D（mmonoacid。活細胞將拒染這些染料。此方法的優勢是細胞表面標志和活性分析可同時進行，通過設門即可得到活細胞的染色特性。尤其適用于高度壞死的樣本。樣本染色后需固定。應在加固定劑之前洗去多余的7AAD，以保證區分的是固定前細胞的死活狀態。但隨著時間延長，7AAD會在固定的細胞群體重新分配，死活細胞的區分變難。對于染12EMAEMADNATrypanblue或其他細胞活性染料。⑷細胞染色所以在細胞表面抗原檢測時應特別注意保持細胞膜的完整以保證檢測的特異性。例如免疫球蛋白重鏈在細胞內和表面的存在有著不同的意義，檢測表面標記必須是未固定的活細胞。TdTMPOcCD3cCD22Ig膜染色，固定，膜通透和胞內染色，最后是DNA染色。固定劑和通透劑都可能對細胞和參數有不同的多重影響，應根據情況選擇。每一步染色對熒光素的選擇和抗體的選擇都很重要。如，用于表面標記的熒光素應不被隨后的固定和通透步驟所影響，而對于胞內染色，所用的熒光素應足夠小能穿透到胞膜內。抗體組合的確定：選擇抗體組合的技術性考慮：基于血液腫瘤的復雜性，提供一個通用的抗體選擇策略是不現實的。國際上迄今也沒有一致性的抗體組合。應該意識到，沒有一個神奇的既小又功能齊全的抗體組合可以解決所有的臨床相關答案。一個局限性的小組合也可能影響對樣本的正確評估和分類。確認細胞異常的能力與所用抗體的數量直接成正比。⑴選擇抗體組合的基本原則如下：測的靈敏度越高。應該指出，由于腫瘤細胞常常缺少細胞的正常標記或表達異常，所以特異性抗體一定程度上的重復選擇有時是必要的。。如現在用CD45抗體來區分正常和幼稚細胞，此方法尤其在幼稚細胞含量少時更顯優勢。3）熒光強度和表位密度應同時考慮。對表達少的抗原表位應盡可能選擇強度強的熒光素。必要時用活性檢測排除死細胞較強的非特異性染色。國外統計，約7048有活性檢測結果。CD⑵常用的方案考慮：大而全的抗體組合：全面了解抗原表達，無需額外染色，省時但費用高。先用篩查試劑了解樣本的一般情況，再根據所得信息采用第二線特異性更高的抗體組。經濟，但費時，也需要正確的抗體選擇的策略性決定。但考慮到所用時間和設備費用，只有約30%國外實驗室采用此法。基于臨床或形態學的資料，選用有目標性的抗體組合以確認可疑的診斷或分類。樣本獲取1-2x1045x104256數據分析只有通過多參數分析，才能最大程度地區分異質的樣本中的正常和異常細胞。多參數分析意味著綜合細胞的光散射和多色熒光特征。最少的要求應是42析步驟越復雜，流式免疫分型的靈敏度越高。FSCvsSSCFLvsFLScattervs.FL等，散射光與熒光參數的綜合分析常常能提供有效的信息。⑵分析步驟：首先分析所有細胞的抗原表達情況，鑒別出正常細胞和異常細胞群體，正常細胞的表現可以作為整個實驗染色過程的內部參照，提供實驗一致性與否的客觀證據，異常細胞則通過進一步設門分析確定表型特點。⑶設門：即選擇特殊的細胞群體分析其各個參數的表現，是一個基本的分析技巧。把分析局限在門內的細胞群體的前提是門內的細胞代表所