結(jié)核病快速診斷進(jìn)展1結(jié)核病快速診斷進(jìn)展1內(nèi)容結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室工作在結(jié)核病控制中的作用為什么要進(jìn)行EQAEQA培訓(xùn)的重要意義4.結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室相關(guān)的流行病學(xué)理論5.痰涂片鏡檢的操作原理6.全球結(jié)核病快速診斷進(jìn)展2內(nèi)容結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室工作在結(jié)核病控制中的作用2結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室工作在結(jié)核病控制中的作用

診斷（發(fā)現(xiàn)傳染源）治療（確定治療方案）療效評價(jià)結(jié)核病控制策略和措施的評估3結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室工作在結(jié)核病控制中的作用

診斷（發(fā)現(xiàn)傳染源）3DiagnosisofPulmonaryTBRelated

toNumbersofTubercleBacilli10102103104105106Poormicroscopy(25%)Goodmicroscopy(55%)Culture/PCR(25%)X-ray/clinicalonly(20%)←AFBpermlofsputumSlideCourtesy:VanDeunA,Nov20034DiagnosisofPulmonaryTBRela細(xì)菌–讓人們聯(lián)想到什么?疾病傳染性流行性食物腐敗在目前已知的細(xì)菌中有1%的細(xì)菌可以導(dǎo)致人患病在目前已知的細(xì)菌中有4%的細(xì)菌可以導(dǎo)致植物得病95%已知細(xì)菌不具有致病性5細(xì)菌–讓人們聯(lián)想到什么?疾病5為什么要進(jìn)行EQA增加人員的責(zé)任心推行標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化操作確保實(shí)驗(yàn)室服務(wù)質(zhì)量的提高生物安全的需要加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)、采集信息6為什么要進(jìn)行EQA增加人員的責(zé)任心6痰涂片鏡檢EQA培訓(xùn)的意義強(qiáng)化EQA的理解，有利于積極推廣提高實(shí)驗(yàn)室服務(wù)質(zhì)量提高對結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室工作的重視逐步提高結(jié)核病防治人員特別是結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室工作人員的地位7痰涂片鏡檢EQA培訓(xùn)的意義強(qiáng)化EQA的理解，有利于積極推廣結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室相關(guān)的流行病學(xué)理論結(jié)核病的發(fā)病學(xué)和流行冰山理論水庫理論病因分析和療效評價(jià)8結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室相關(guān)的流行病學(xué)理論結(jié)核病的發(fā)病學(xué)和流行8核分枝桿菌在人體中的生活周期感染感染–95%后期表現(xiàn)-5%病變早期進(jìn)展-5%例如：HIV,嬰幼兒例如：移民9核分枝桿菌在人體中的生活周期感染感染–95%后期表現(xiàn)-結(jié)核分枝桿菌的生活周期感染人體內(nèi)生存由肺中排入空氣中進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)侵犯人體免疫防御系統(tǒng)免疫激活和營養(yǎng)限制免疫病理釋放調(diào)控因子,例如sigmafactors釋放抗原性蛋白改變營養(yǎng)需要改變細(xì)胞壁10結(jié)核分枝桿菌的生活周期感染人體內(nèi)生存由肺中排入空氣中進(jìn)入細(xì)胞微生物和人類VeryfewmicrobesarealwayspathogenicManymicrobesarepotentiallypathogenicMostmicrobesareneverpathogenic11微生物和人類VeryfewmicrobesarealwpotentialpathogenisolatedfromordetectedinclinicalsamplesRecognisedsyndromes

patient'sclinicalcondition

e.g.septicaemia,endocarditis,osteomyelitismeningitis,UTI,pneumoniapharyngitis我們?nèi)绾沃捞囟ǖ牟≡⑸镏虏?診斷和有效的治療不僅依靠分離病原微生物，而且在于建立實(shí)驗(yàn)室和病人臨床癥狀的聯(lián)系12potentialpathogenisolatedfr如何推測特定病原體可以致病?Koch‘s推測病原體必須在每一例病例中都出現(xiàn)病原體可以從宿主中分離并且可以在純培養(yǎng)基中生長當(dāng)特定的病原體接種到健康機(jī)體時(shí)特定的疾病會(huì)發(fā)生病原微生物可以在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中恢復(fù)13如何推測特定病原體可以致病?Koch‘s推測13Spectrumof

virulencepoliomyelitisinachild0.1-1%ofinfectionsareclinicallyapparentrubella50%ofinfectionsareclinicallyapparentrabies100%ofinfectionsareclinicallyapparent傳染性疾病的冰山理論asymptomatic

infectionclassicalclinicaldiseaselessseveredisease14Spectrumofvirulencepoliomyel水庫理論發(fā)病人數(shù)死亡人數(shù)治愈人數(shù)現(xiàn)有病人數(shù)15水庫理論發(fā)病人數(shù)死亡人數(shù)治愈人數(shù)現(xiàn)有病人數(shù)15痰涂片鏡檢的操作原理16痰涂片鏡檢的操作原理16分枝桿菌的發(fā)現(xiàn)歷史1590年荷蘭楊森父子發(fā)明了顯微鏡19世紀(jì)末,顯微鏡技術(shù)、染色技術(shù)已應(yīng)用于微生物檢測,分枝桿菌的發(fā)現(xiàn)條件已成熟在發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌前,科霍已是一位在微生物學(xué)方面取得豐碩成果的學(xué)者.17分枝桿菌的發(fā)現(xiàn)歷史1590年荷蘭楊森父子發(fā)明了顯微鏡17RobertKoch–第一個(gè)證明細(xì)菌可以致病1876傳染病的微生物病因?qū)W病因?qū)W-疾病的病因建立“科學(xué)規(guī)則”來確定微生物和疾病的病因和效應(yīng)關(guān)系Koch’s原理18RobertKoch–第一個(gè)證明細(xì)菌可以致病18761Koch確定了3個(gè)重要疾病的病因

1.霍亂(fecal-oraldisease)Vibriocholerae2.結(jié)核病(pulmonaryinfection)Mycobacteriumtuberculosis3.炭疽(sheepandcattle)Bacillusanthracis19Koch確定了3個(gè)重要疾病的病因1.霍亂(fecal-結(jié)核病Figure24.9結(jié)核分枝桿菌：棒狀抗酸菌.可以在人與人之間傳播牛型結(jié)核桿菌:美國的病例數(shù)〈１％,不在人與人之間傳播鳥胞內(nèi)分枝桿菌，可以感染

AIDS晚期患者20結(jié)核病Figure24.9結(jié)核分枝桿菌：棒狀抗酸菌.可以光學(xué)顯微鏡的基本原理為區(qū)分物體不同的兩點(diǎn),這兩點(diǎn)的光學(xué)成像必須落在視網(wǎng)膜上不同的感光細(xì)胞上;顯微鏡下,光線經(jīng)過顯微鏡物鏡折射成倒立放大的實(shí)像,然后經(jīng)目鏡折射成正立放大的虛像;經(jīng)顯微鏡放大后,人眼就可以區(qū)分物體不同的兩點(diǎn),以達(dá)到觀察微小物體的目的;由于光線衍射的原因,普通光學(xué)顯微鏡不能區(qū)別小于0.2微米的物體；21光學(xué)顯微鏡的基本原理為區(qū)分物體不同的兩點(diǎn),這兩點(diǎn)的光學(xué)成像必分辨率和對比度人的肉眼不能看清小于0.1毫米的物體普通光學(xué)顯微鏡不能區(qū)別小于0.2微米的物體電子顯微鏡不能看清小于0.1納米的物體22分辨率和對比度22電子顯微鏡下的結(jié)核分枝桿菌Gram-positive

S.aureusGram-negative

E.coliAcidfast

M.tuberculosis

23電子顯微鏡下的結(jié)核分枝桿菌Gram-positive

S.生理?xiàng)l件下細(xì)菌的表面往往帶有大量負(fù)電荷

原因：細(xì)菌表面帶有正負(fù)電荷的基團(tuán)，等電點(diǎn)多在PH７以下，因此在中性或堿性條件下細(xì)菌的表面往往帶有大量負(fù)電荷24生理?xiàng)l件下細(xì)菌的表面往往帶有大量負(fù)電荷原因：細(xì)菌表面帶有正染色反應(yīng)Stains-saltscomposedofapositiveandnegativeion,oneofwhichiscolored(chromophore)堿性染料–著色基團(tuán)帶正電荷dye+Cl-酸性染料–著色基團(tuán)帶正電荷Na+

dye-25染色反應(yīng)Stains-saltscomposedof分枝桿菌涂片鏡檢基本原理１、待檢標(biāo)本中存在分枝桿菌，即受檢者排菌２、分枝桿菌的特殊結(jié)構(gòu)決定了染色方法：染色劑細(xì)菌表面帶負(fù)電荷,與堿性復(fù)紅易于結(jié)合,加熱加深分枝桿菌著色程度脫色為了易于鏡檢，應(yīng)該使抗酸菌以外的所有物質(zhì)近乎完全脫色復(fù)染提供一個(gè)良好的對比，隱去背景中殘留的紅色，但不掩蓋抗酸菌。而且，復(fù)染既要使涂片的背景易于鏡檢時(shí)調(diào)焦，同時(shí)又不能太深以至分散太多注意力26分枝桿菌涂片鏡檢基本原理１、待檢標(biāo)本中存在分枝桿菌，即受檢者結(jié)核菌感染及排出示意圖27結(jié)核菌感染及排出示意圖27結(jié)核病28結(jié)核病28結(jié)核病29結(jié)核病29細(xì)胞壁革蘭氏陽性菌革蘭氏陰性菌分枝桿菌脂質(zhì)雙分子肽聚糖MYCOLATElipid+LPSporinsacyllipids

arabinogalactaLAM30細(xì)胞壁革蘭氏陽性菌革蘭氏陰性菌分枝桿菌脂質(zhì)雙分子肽聚糖MYC細(xì)胞膜兩種主要結(jié)構(gòu)成分雙層磷脂doublelayerofphospholipids蛋白質(zhì)proteins31細(xì)胞膜兩種主要結(jié)構(gòu)成分311.痰涂片操作程序原理2.二甲苯問題321.痰涂片操作程序原理32

假陰性

假陽性技術(shù)錯(cuò)誤

涂片:太薄/太厚、暴露在紫外線下

標(biāo)本中的混雜物質(zhì)

/加熱時(shí)間過長/使用污染的木簽

染色:染色質(zhì)量不佳、未熱染、染色時(shí)

結(jié)晶/環(huán)境抗酸菌、間太短、脫落、涂片未固定

交叉污染脫色:脫色不佳脫色不佳

復(fù)染:過染

染色不佳鏡檢員

視力缺陷、僅觀察少數(shù)視野、

經(jīng)鏡油交叉污染讀片錯(cuò)誤：

未經(jīng)培訓(xùn)未經(jīng)培訓(xùn)記錄/報(bào)告：

記錄錯(cuò)誤記錄錯(cuò)誤產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)果的常見原因33

細(xì)菌感染的診斷病人臨床診斷血液生化Non-microbiologicalinvestigations影像學(xué)標(biāo)本分泌物標(biāo)本

34細(xì)菌感染的診斷病人臨床診斷血液生化Non-microbiol實(shí)驗(yàn)室檢查是臨床診斷的必要環(huán)節(jié)35實(shí)驗(yàn)室檢查是臨床診斷的必要環(huán)節(jié)35OUTLINE細(xì)菌學(xué)診斷顯微鏡檢查術(shù)培養(yǎng)免疫學(xué)診斷分子生物學(xué)診斷

GenProbe噬菌體檢測方法

HPLC

其他36OUTLINE細(xì)菌學(xué)診斷36結(jié)核分枝桿菌的細(xì)菌學(xué)診斷培養(yǎng)onplatesorinbrothidentificationbybiochemicalorserologicaltestsonpuregrowthfromsinglecolony顯微鏡檢查脫色復(fù)染染色unstainedorstainedwithe.g.Gramstain

藥敏血清學(xué)DNA方法bydiscdiffusionmethods,breakpointsorMICs37結(jié)核分枝桿菌的細(xì)菌學(xué)診斷培養(yǎng)onplatesorin顯微鏡檢查Gram-染色抗酸染色Ziehl-Neelsen熒光染色Direct,e.g.auramineImmunofluorescence38顯微鏡檢查Gram-染色38培養(yǎng)SolidmediaAgarplatesForIdentificationForEnumerationSlopesForsafelong-termculture,e.g.Lowenstein-JensenmediaforTBLiquidmedia(broth)Forenrichmentormaximumsensitivity39培養(yǎng)Solidmedia39菌種鑒定形態(tài)學(xué)生長條件生化反應(yīng)酶抗原分子生物學(xué)方法40菌種鑒定形態(tài)學(xué)40非培養(yǎng)的診斷方法血清學(xué)檢測分子生物學(xué)方法其他（HPLC）

41非培養(yǎng)的診斷方法血清學(xué)檢測41什么是分子生物學(xué)診斷方法?為什么用分子生物學(xué)診斷方法?可得的分子生物學(xué)方法?

2022/11/2542討論的議題42什么是分子生物學(xué)診斷方法?2022/11/2242討論的議分子生物學(xué)方法是傳統(tǒng)方法的必要補(bǔ)充顯微鏡檢查有假陽性 -T.vaginalis,N.gonorrhoeae胞內(nèi)致病菌–viruses,M.genitalium低敏感性 –Chlamydiasp.,Neisseriasp.慢速生長–M.tuberculosis

43分子生物學(xué)方法是傳統(tǒng)方法的必要補(bǔ)充顯微鏡檢查有假陽性 分子生物學(xué)方法–如何發(fā)揮作用?每個(gè)微生物擁有一些種屬特異的DNA序列分子生物學(xué)方法使得種屬特異性DNA可以衡量法醫(yī)鑒定44分子生物學(xué)方法–如何發(fā)揮作用?每個(gè)微生物擁有一些種屬特異分子生物學(xué)方法是一系列DNA初級結(jié)構(gòu)的方法雜交的互補(bǔ)序列方法擴(kuò)增合成種屬特異的DNA序列-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G--T-T-A-A-G-C-G-C-T-A-C--A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G--A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G--A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G--A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G--A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-45分子生物學(xué)方法是一系列DNA初級結(jié)構(gòu)的方法雜交的互補(bǔ)序列方法PCR實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本處理DNA準(zhǔn)備

潔凈屋儲(chǔ)存溶液混合點(diǎn)熱循環(huán)和擴(kuò)增

檢測

QC&QA質(zhì)量控制

和質(zhì)量保證

R&DAlternatives:-commercialkits -robots+kitsNoalternative46PCR實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本處理潔凈屋混合點(diǎn)熱循環(huán)和擴(kuò)增檢①Bactec放射呼吸測定以含有放射標(biāo)記的軟脂酸為底物的液體培養(yǎng)基，自動(dòng)測量分枝桿菌代謝14C軟脂酸脫致過程中釋放的14CO2的量。該法藥敏報(bào)告可縮短為4一12天。②分枝桿菌生長指示管法Bactec放射呼吸測定法的替代方法。以培養(yǎng)基中加入熒光釕復(fù)合物代替放射性標(biāo)記，其熒光衰減與細(xì)菌代謝過程中O2的消耗量有關(guān)。熒光衰減可通過一系列不同的紫外透照管檢測。Bactec呼吸測定47①Bactec放射呼吸測定以含有放射標(biāo)記的軟脂酸流式細(xì)胞儀測定法原理:分枝桿菌細(xì)胞內(nèi)的非特異性脂酶能水解培養(yǎng)基中加入的熒光素復(fù)合物(FDA)為游離的熒光素，因而分枝桿菌在生長過程中可造成熒光素的堆積，經(jīng)FCM即可檢測到。48流式細(xì)胞儀測定法原理:分枝桿菌細(xì)胞內(nèi)的非特異性脂酶比色法①M(fèi)TT法

MTT法為線粒體琥珀酸脫氫酶的作用底物，可被活細(xì)胞還原形成不溶性的Formazan產(chǎn)物,其生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正相關(guān)。Formazan經(jīng)溶解后，可在酶標(biāo)儀上測定其光吸收值。②微孔板美蘭比色法美蘭為耗氧指示劑，有氧時(shí)為藍(lán)色，無氧時(shí)為粉紅色。Franzblau等以美蘭為指示劑在96孔微量板中培養(yǎng)細(xì)菌，培養(yǎng)基中加入抗結(jié)核藥物，微量板用Parafilm封口膜封閉。若細(xì)菌為藥物敏感株，可被加入的抗結(jié)核藥物抑制或殺死，首先表現(xiàn)為氧消耗停止。而耗氧指示劑在各獨(dú)立微小隔氧環(huán)境中的頗色變化可客觀反映氧被消耗的程度，從而反映細(xì)菌的生長狀態(tài)。49比色法49噬菌體生物擴(kuò)增法將分枝桿菌噬菌體感染結(jié)核分枝桿菌，未進(jìn)入菌體內(nèi)的噬菌體用特異的杭噬菌體物質(zhì)滅活，進(jìn)入菌體內(nèi)的噬菌體得到保護(hù)而復(fù)制增殖，溶菌后釋放子代噬菌體，將此噬菌體與快速生長的恥垢分枝桿菌混合，接種在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察蝕斑的產(chǎn)生。蝕斑的數(shù)量與噬菌體數(shù)量有關(guān)，也與在含抗結(jié)核藥物培養(yǎng)基上存活的結(jié)核分枝桿菌數(shù)有關(guān)。噬菌體法（Fastflaque)50噬菌體生物擴(kuò)增法將分枝桿菌噬菌體感染結(jié)核分枝桿菌，未進(jìn)噬菌體熒光素酶檢測法

Jacobs等將熒火蟲熒光素酶基因?qū)敕种U菌噬菌體，這種噬菌體感染分枝桿菌后，熒光素酶基因被代謝活躍的分枝桿菌活化，在菌細(xì)胞內(nèi)ATP存在的條件下，可產(chǎn)生光子，通過熒光檢測器測定發(fā)光信號。只有耐藥的分枝桿菌才能在含藥的培養(yǎng)墓上生長，產(chǎn)生光子，敏感菌和死亡菌不產(chǎn)生或產(chǎn)生后不能維持。

51噬菌體熒光素酶檢測法Jacobs等將熒火蟲熒光素酶基因?qū)删w生物擴(kuò)增法原理示意圖52噬菌體生物擴(kuò)增法原理示意圖52GenProbe方法檢測結(jié)核分枝桿菌1.原理2.菌種鑒定53GenProbe方法檢測結(jié)核分枝桿菌1.原理53RNA/RNA錯(cuò)配法

Nash等(1997)首先將該法用于RFP耐藥菌株培養(yǎng)物的檢測。該法是基于雙鏈RNA能抵杭RNA酶的消化的原理而建立的。將待檢菌株以及藥物敏感的參考菌株(H37Rv)的PCR產(chǎn)物混合，加入T7RNA多聚酶和SP6RNA多聚酶，通過轉(zhuǎn)錄形成兩條RNA，在進(jìn)行雜交，若待檢測株為敏感株，則形成兩條互補(bǔ)的RNA，能抵抗RNA酶的消化，若待檢測菌株有突變發(fā)生，則不能與參考株RNA鏈完全配對，加入RNA酶后，雜交產(chǎn)物將在突變位點(diǎn)被切開，通過電泳即可檢測到。

54RNA/RNA錯(cuò)配法Nash等(1997)首先將該法用于R5555RussiaBrazilTokyoSwedenBirkhaugDanishPragueGlaxoTiceFrappierConnaughtPhippsPasteur分枝菌酸(HPLC)AlphaMethoxyKeto300bp200bp100bpBehretal.JBacteriol,200056RussiaBrazilTokyoSwedenBirkhauDNA測序法Hirano等應(yīng)用DNA測序法

DNA測序法被認(rèn)為是檢測變異的“金標(biāo)準(zhǔn)”，可檢測出待檢基因上的所有突變位置和突變情況。利用PCR法擴(kuò)增待檢基因，PCR產(chǎn)物可直接測序，24一48h即可提供精確序列，并準(zhǔn)確判定堿基突變的位點(diǎn)，已用于RFP、INH、PZA、EMB等耐藥基因的檢測。57DNA測序法Hirano等應(yīng)用DNA測序法DNA測序法被基因芯片基因芯片將耐藥基因的DNA或寡核苷酸序列標(biāo)記到芯片上，從而快速的檢測出突變位點(diǎn)，可以在3個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。

58基因芯片基因芯片將耐藥基因的DNA或寡核苷酸序列標(biāo)記基因組學(xué)的問題多樣性

單核苷酸多態(tài)性,復(fù)制子,缺失,重排株水平差異和種屬特異性基因的作用是什么?基因的功能通常是未知的主要是根據(jù)同類中的功能來推論翻譯成效應(yīng)分子信息如何引導(dǎo)診斷、預(yù)防、治療疾病59基因組學(xué)的問題多樣性59M.tuberculosisH37Rv

440萬堿基對3924預(yù)測基因65.6%GC含量ColeSTetal.Nature1998;393:537.60M.tuberculosisH37Rv440萬堿基對斑點(diǎn)雜交和反相斑點(diǎn)雜交斑點(diǎn)雜交DNA/RNA標(biāo)本標(biāo)記探針反相斑點(diǎn)雜交探針標(biāo)記DNA/RNA標(biāo)本61斑點(diǎn)雜交和反相斑點(diǎn)雜交斑點(diǎn)雜交DNA/RNA標(biāo)本標(biāo)記探制作DNA芯片96-孔板‘printer’玻片18mm62制作DNA芯片96-孔板‘printer’玻片18mm62DNA在玻片上的點(diǎn)樣63DNA在玻片上的點(diǎn)樣63DNA微陣列-M.tuberculosisH37Rv的基因組芯片3924開放閱讀框一個(gè)基因一個(gè)探針64DNA微陣列-M.tuberculosisH37RDNA微陣列Cy3Cy5DNA/RNADNA/RNADNA微陣列掃描65DNA微陣列Cy3Cy5DNA/RNADNA/RNADcDNA微陣列Cy3和Cy5熒光強(qiáng)度相等Cy3熒光信號強(qiáng)Cy5熒光信號強(qiáng)66cDNA微陣列Cy3和Cy5熒光強(qiáng)度相等Cy3熒Rv562Rv2875Rv780Rv1974Rv1976Rv1978M.tuberculosisvs.BCG-Danish1331H37RvBCGBothstrainsBehrMAetal.Science1999;284:1520.67Rv562Rv2875Rv780Rv1974Rv1976RvAffymetrix基因芯片68Affymetrix基因芯片68經(jīng)常不斷地學(xué)習(xí),你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量StudyConstantly,AndYouWillKnowEverything.TheMoreYouKnow,TheMorePowerfulYouWillBe寫在最后69經(jīng)常不斷地學(xué)習(xí),你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量寫感謝聆聽不足之處請大家批評指導(dǎo)PleaseCriticizeAndGuideTheShortcomings結(jié)束語講師：XXXXXXXX年XX月XX日

70感謝聆聽結(jié)束語講師：XXXXXX70結(jié)核病快速診斷進(jìn)展71結(jié)核病快速診斷進(jìn)展1內(nèi)容結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室工作在結(jié)核病控制中的作用為什么要進(jìn)行EQAEQA培訓(xùn)的重要意義4.結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室相關(guān)的流行病學(xué)理論5.痰涂片鏡檢的操作原理6.全球結(jié)核病快速診斷進(jìn)展72內(nèi)容結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室工作在結(jié)核病控制中的作用2結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室工作在結(jié)核病控制中的作用

診斷（發(fā)現(xiàn)傳染源）治療（確定治療方案）療效評價(jià)結(jié)核病控制策略和措施的評估73結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室工作在結(jié)核病控制中的作用

診斷（發(fā)現(xiàn)傳染源）3DiagnosisofPulmonaryTBRelated

toNumbersofTubercleBacilli10102103104105106Poormicroscopy(25%)Goodmicroscopy(55%)Culture/PCR(25%)X-ray/clinicalonly(20%)←AFBpermlofsputumSlideCourtesy:VanDeunA,Nov200374DiagnosisofPulmonaryTBRela細(xì)菌–讓人們聯(lián)想到什么?疾病傳染性流行性食物腐敗在目前已知的細(xì)菌中有1%的細(xì)菌可以導(dǎo)致人患病在目前已知的細(xì)菌中有4%的細(xì)菌可以導(dǎo)致植物得病95%已知細(xì)菌不具有致病性75細(xì)菌–讓人們聯(lián)想到什么?疾病5為什么要進(jìn)行EQA增加人員的責(zé)任心推行標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化操作確保實(shí)驗(yàn)室服務(wù)質(zhì)量的提高生物安全的需要加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)、采集信息76為什么要進(jìn)行EQA增加人員的責(zé)任心6痰涂片鏡檢EQA培訓(xùn)的意義強(qiáng)化EQA的理解，有利于積極推廣提高實(shí)驗(yàn)室服務(wù)質(zhì)量提高對結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室工作的重視逐步提高結(jié)核病防治人員特別是結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室工作人員的地位77痰涂片鏡檢EQA培訓(xùn)的意義強(qiáng)化EQA的理解，有利于積極推廣結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室相關(guān)的流行病學(xué)理論結(jié)核病的發(fā)病學(xué)和流行冰山理論水庫理論病因分析和療效評價(jià)78結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室相關(guān)的流行病學(xué)理論結(jié)核病的發(fā)病學(xué)和流行8核分枝桿菌在人體中的生活周期感染感染–95%后期表現(xiàn)-5%病變早期進(jìn)展-5%例如：HIV,嬰幼兒例如：移民79核分枝桿菌在人體中的生活周期感染感染–95%后期表現(xiàn)-結(jié)核分枝桿菌的生活周期感染人體內(nèi)生存由肺中排入空氣中進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)侵犯人體免疫防御系統(tǒng)免疫激活和營養(yǎng)限制免疫病理釋放調(diào)控因子,例如sigmafactors釋放抗原性蛋白改變營養(yǎng)需要改變細(xì)胞壁80結(jié)核分枝桿菌的生活周期感染人體內(nèi)生存由肺中排入空氣中進(jìn)入細(xì)胞微生物和人類VeryfewmicrobesarealwayspathogenicManymicrobesarepotentiallypathogenicMostmicrobesareneverpathogenic81微生物和人類VeryfewmicrobesarealwpotentialpathogenisolatedfromordetectedinclinicalsamplesRecognisedsyndromes

patient'sclinicalcondition

e.g.septicaemia,endocarditis,osteomyelitismeningitis,UTI,pneumoniapharyngitis我們?nèi)绾沃捞囟ǖ牟≡⑸镏虏?診斷和有效的治療不僅依靠分離病原微生物，而且在于建立實(shí)驗(yàn)室和病人臨床癥狀的聯(lián)系82potentialpathogenisolatedfr如何推測特定病原體可以致病?Koch‘s推測病原體必須在每一例病例中都出現(xiàn)病原體可以從宿主中分離并且可以在純培養(yǎng)基中生長當(dāng)特定的病原體接種到健康機(jī)體時(shí)特定的疾病會(huì)發(fā)生病原微生物可以在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中恢復(fù)83如何推測特定病原體可以致病?Koch‘s推測13Spectrumof

virulencepoliomyelitisinachild0.1-1%ofinfectionsareclinicallyapparentrubella50%ofinfectionsareclinicallyapparentrabies100%ofinfectionsareclinicallyapparent傳染性疾病的冰山理論asymptomatic

infectionclassicalclinicaldiseaselessseveredisease84Spectrumofvirulencepoliomyel水庫理論發(fā)病人數(shù)死亡人數(shù)治愈人數(shù)現(xiàn)有病人數(shù)85水庫理論發(fā)病人數(shù)死亡人數(shù)治愈人數(shù)現(xiàn)有病人數(shù)15痰涂片鏡檢的操作原理86痰涂片鏡檢的操作原理16分枝桿菌的發(fā)現(xiàn)歷史1590年荷蘭楊森父子發(fā)明了顯微鏡19世紀(jì)末,顯微鏡技術(shù)、染色技術(shù)已應(yīng)用于微生物檢測,分枝桿菌的發(fā)現(xiàn)條件已成熟在發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌前,科霍已是一位在微生物學(xué)方面取得豐碩成果的學(xué)者.87分枝桿菌的發(fā)現(xiàn)歷史1590年荷蘭楊森父子發(fā)明了顯微鏡17RobertKoch–第一個(gè)證明細(xì)菌可以致病1876傳染病的微生物病因?qū)W病因?qū)W-疾病的病因建立“科學(xué)規(guī)則”來確定微生物和疾病的病因和效應(yīng)關(guān)系Koch’s原理88RobertKoch–第一個(gè)證明細(xì)菌可以致病18761Koch確定了3個(gè)重要疾病的病因

1.霍亂(fecal-oraldisease)Vibriocholerae2.結(jié)核病(pulmonaryinfection)Mycobacteriumtuberculosis3.炭疽(sheepandcattle)Bacillusanthracis89Koch確定了3個(gè)重要疾病的病因1.霍亂(fecal-結(jié)核病Figure24.9結(jié)核分枝桿菌：棒狀抗酸菌.可以在人與人之間傳播牛型結(jié)核桿菌:美國的病例數(shù)〈１％,不在人與人之間傳播鳥胞內(nèi)分枝桿菌，可以感染

AIDS晚期患者90結(jié)核病Figure24.9結(jié)核分枝桿菌：棒狀抗酸菌.可以光學(xué)顯微鏡的基本原理為區(qū)分物體不同的兩點(diǎn),這兩點(diǎn)的光學(xué)成像必須落在視網(wǎng)膜上不同的感光細(xì)胞上;顯微鏡下,光線經(jīng)過顯微鏡物鏡折射成倒立放大的實(shí)像,然后經(jīng)目鏡折射成正立放大的虛像;經(jīng)顯微鏡放大后,人眼就可以區(qū)分物體不同的兩點(diǎn),以達(dá)到觀察微小物體的目的;由于光線衍射的原因,普通光學(xué)顯微鏡不能區(qū)別小于0.2微米的物體；91光學(xué)顯微鏡的基本原理為區(qū)分物體不同的兩點(diǎn),這兩點(diǎn)的光學(xué)成像必分辨率和對比度人的肉眼不能看清小于0.1毫米的物體普通光學(xué)顯微鏡不能區(qū)別小于0.2微米的物體電子顯微鏡不能看清小于0.1納米的物體92分辨率和對比度22電子顯微鏡下的結(jié)核分枝桿菌Gram-positive

S.aureusGram-negative

E.coliAcidfast

M.tuberculosis

93電子顯微鏡下的結(jié)核分枝桿菌Gram-positive

S.生理?xiàng)l件下細(xì)菌的表面往往帶有大量負(fù)電荷

原因：細(xì)菌表面帶有正負(fù)電荷的基團(tuán)，等電點(diǎn)多在PH７以下，因此在中性或堿性條件下細(xì)菌的表面往往帶有大量負(fù)電荷94生理?xiàng)l件下細(xì)菌的表面往往帶有大量負(fù)電荷原因：細(xì)菌表面帶有正染色反應(yīng)Stains-saltscomposedofapositiveandnegativeion,oneofwhichiscolored(chromophore)堿性染料–著色基團(tuán)帶正電荷dye+Cl-酸性染料–著色基團(tuán)帶正電荷Na+

dye-95染色反應(yīng)Stains-saltscomposedof分枝桿菌涂片鏡檢基本原理１、待檢標(biāo)本中存在分枝桿菌，即受檢者排菌２、分枝桿菌的特殊結(jié)構(gòu)決定了染色方法：染色劑細(xì)菌表面帶負(fù)電荷,與堿性復(fù)紅易于結(jié)合,加熱加深分枝桿菌著色程度脫色為了易于鏡檢，應(yīng)該使抗酸菌以外的所有物質(zhì)近乎完全脫色復(fù)染提供一個(gè)良好的對比，隱去背景中殘留的紅色，但不掩蓋抗酸菌。而且，復(fù)染既要使涂片的背景易于鏡檢時(shí)調(diào)焦，同時(shí)又不能太深以至分散太多注意力96分枝桿菌涂片鏡檢基本原理１、待檢標(biāo)本中存在分枝桿菌，即受檢者結(jié)核菌感染及排出示意圖97結(jié)核菌感染及排出示意圖27結(jié)核病98結(jié)核病28結(jié)核病99結(jié)核病29細(xì)胞壁革蘭氏陽性菌革蘭氏陰性菌分枝桿菌脂質(zhì)雙分子肽聚糖MYCOLATElipid+LPSporinsacyllipids

arabinogalactaLAM100細(xì)胞壁革蘭氏陽性菌革蘭氏陰性菌分枝桿菌脂質(zhì)雙分子肽聚糖MYC細(xì)胞膜兩種主要結(jié)構(gòu)成分雙層磷脂doublelayerofphospholipids蛋白質(zhì)proteins101細(xì)胞膜兩種主要結(jié)構(gòu)成分311.痰涂片操作程序原理2.二甲苯問題1021.痰涂片操作程序原理32

假陰性

假陽性技術(shù)錯(cuò)誤

涂片:太薄/太厚、暴露在紫外線下

標(biāo)本中的混雜物質(zhì)

/加熱時(shí)間過長/使用污染的木簽

染色:染色質(zhì)量不佳、未熱染、染色時(shí)

結(jié)晶/環(huán)境抗酸菌、間太短、脫落、涂片未固定

交叉污染脫色:脫色不佳脫色不佳

復(fù)染:過染

染色不佳鏡檢員

視力缺陷、僅觀察少數(shù)視野、

經(jīng)鏡油交叉污染讀片錯(cuò)誤：

未經(jīng)培訓(xùn)未經(jīng)培訓(xùn)記錄/報(bào)告：

記錄錯(cuò)誤記錄錯(cuò)誤產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)果的常見原因103

細(xì)菌感染的診斷病人臨床診斷血液生化Non-microbiologicalinvestigations影像學(xué)標(biāo)本分泌物標(biāo)本

104細(xì)菌感染的診斷病人臨床診斷血液生化Non-microbiol實(shí)驗(yàn)室檢查是臨床診斷的必要環(huán)節(jié)105實(shí)驗(yàn)室檢查是臨床診斷的必要環(huán)節(jié)35OUTLINE細(xì)菌學(xué)診斷顯微鏡檢查術(shù)培養(yǎng)免疫學(xué)診斷分子生物學(xué)診斷

GenProbe噬菌體檢測方法

HPLC

其他106OUTLINE細(xì)菌學(xué)診斷36結(jié)核分枝桿菌的細(xì)菌學(xué)診斷培養(yǎng)onplatesorinbrothidentificationbybiochemicalorserologicaltestsonpuregrowthfromsinglecolony顯微鏡檢查脫色復(fù)染染色unstainedorstainedwithe.g.Gramstain

藥敏血清學(xué)DNA方法bydiscdiffusionmethods,breakpointsorMICs107結(jié)核分枝桿菌的細(xì)菌學(xué)診斷培養(yǎng)onplatesorin顯微鏡檢查Gram-染色抗酸染色Ziehl-Neelsen熒光染色Direct,e.g.auramineImmunofluorescence108顯微鏡檢查Gram-染色38培養(yǎng)SolidmediaAgarplatesForIdentificationForEnumerationSlopesForsafelong-termculture,e.g.Lowenstein-JensenmediaforTBLiquidmedia(broth)Forenrichmentormaximumsensitivity109培養(yǎng)Solidmedia39菌種鑒定形態(tài)學(xué)生長條件生化反應(yīng)酶抗原分子生物學(xué)方法110菌種鑒定形態(tài)學(xué)40非培養(yǎng)的診斷方法血清學(xué)檢測分子生物學(xué)方法其他（HPLC）

111非培養(yǎng)的診斷方法血清學(xué)檢測41什么是分子生物學(xué)診斷方法?為什么用分子生物學(xué)診斷方法?可得的分子生物學(xué)方法?

2022/11/25112討論的議題112什么是分子生物學(xué)診斷方法?2022/11/2242討論的議分子生物學(xué)方法是傳統(tǒng)方法的必要補(bǔ)充顯微鏡檢查有假陽性 -T.vaginalis,N.gonorrhoeae胞內(nèi)致病菌–viruses,M.genitalium低敏感性 –Chlamydiasp.,Neisseriasp.慢速生長–M.tuberculosis

113分子生物學(xué)方法是傳統(tǒng)方法的必要補(bǔ)充顯微鏡檢查有假陽性 分子生物學(xué)方法–如何發(fā)揮作用?每個(gè)微生物擁有一些種屬特異的DNA序列分子生物學(xué)方法使得種屬特異性DNA可以衡量法醫(yī)鑒定114分子生物學(xué)方法–如何發(fā)揮作用?每個(gè)微生物擁有一些種屬特異分子生物學(xué)方法是一系列DNA初級結(jié)構(gòu)的方法雜交的互補(bǔ)序列方法擴(kuò)增合成種屬特異的DNA序列-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G--T-T-A-A-G-C-G-C-T-A-C--A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G--A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G--A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G--A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G--A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-115分子生物學(xué)方法是一系列DNA初級結(jié)構(gòu)的方法雜交的互補(bǔ)序列方法PCR實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本處理DNA準(zhǔn)備

潔凈屋儲(chǔ)存溶液混合點(diǎn)熱循環(huán)和擴(kuò)增

檢測

QC&QA質(zhì)量控制

和質(zhì)量保證

R&DAlternatives:-commercialkits -robots+kitsNoalternative116PCR實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本處理潔凈屋混合點(diǎn)熱循環(huán)和擴(kuò)增檢①Bactec放射呼吸測定以含有放射標(biāo)記的軟脂酸為底物的液體培養(yǎng)基，自動(dòng)測量分枝桿菌代謝14C軟脂酸脫致過程中釋放的14CO2的量。該法藥敏報(bào)告可縮短為4一12天。②分枝桿菌生長指示管法Bactec放射呼吸測定法的替代方法。以培養(yǎng)基中加入熒光釕復(fù)合物代替放射性標(biāo)記，其熒光衰減與細(xì)菌代謝過程中O2的消耗量有關(guān)。熒光衰減可通過一系列不同的紫外透照管檢測。Bactec呼吸測定117①Bactec放射呼吸測定以含有放射標(biāo)記的軟脂酸流式細(xì)胞儀測定法原理:分枝桿菌細(xì)胞內(nèi)的非特異性脂酶能水解培養(yǎng)基中加入的熒光素復(fù)合物(FDA)為游離的熒光素，因而分枝桿菌在生長過程中可造成熒光素的堆積，經(jīng)FCM即可檢測到。118流式細(xì)胞儀測定法原理:分枝桿菌細(xì)胞內(nèi)的非特異性脂酶比色法①M(fèi)TT法

MTT法為線粒體琥珀酸脫氫酶的作用底物，可被活細(xì)胞還原形成不溶性的Formazan產(chǎn)物,其生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正相關(guān)。Formazan經(jīng)溶解后，可在酶標(biāo)儀上測定其光吸收值。②微孔板美蘭比色法美蘭為耗氧指示劑，有氧時(shí)為藍(lán)色，無氧時(shí)為粉紅色。Franzblau等以美蘭為指示劑在96孔微量板中培養(yǎng)細(xì)菌，培養(yǎng)基中加入抗結(jié)核藥物，微量板用Parafilm封口膜封閉。若細(xì)菌為藥物敏感株，可被加入的抗結(jié)核藥物抑制或殺死，首先表現(xiàn)為氧消耗停止。而耗氧指示劑在各獨(dú)立微小隔氧環(huán)境中的頗色變化可客觀反映氧被消耗的程度，從而反映細(xì)菌的生長狀態(tài)。119比色法49噬菌體生物擴(kuò)增法將分枝桿菌噬菌體感染結(jié)核分枝桿菌，未進(jìn)入菌體內(nèi)的噬菌體用特異的杭噬菌體物質(zhì)滅活，進(jìn)入菌體內(nèi)的噬菌體得到保護(hù)而復(fù)制增殖，溶菌后釋放子代噬菌體，將此噬菌體與快速生長的恥垢分枝桿菌混合，接種在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察蝕斑的產(chǎn)生。蝕斑的數(shù)量與噬菌體數(shù)量有關(guān)，也與在含抗結(jié)核藥物培養(yǎng)基上存活的結(jié)核分枝桿菌數(shù)有關(guān)。噬菌體法（Fastflaque)120噬菌體生物擴(kuò)增法將分枝桿菌噬菌體感染結(jié)核分枝桿菌，未進(jìn)噬菌體熒光素酶檢測法

Jacobs等將熒火蟲熒光素酶基因?qū)敕种U菌噬菌體，這種噬菌體感染分枝桿菌后，熒光素酶基因被代謝活躍的分枝桿菌活化，在菌細(xì)胞內(nèi)ATP存在的條件下，可產(chǎn)生光子，通過熒光檢測器測定發(fā)光信號。只有耐藥的分枝桿菌才能在含藥的培養(yǎng)墓上生長，產(chǎn)生光子，敏感菌和死亡菌不產(chǎn)生或產(chǎn)生后不能維持。

121噬菌體熒光素酶檢測法Jacobs等將熒火蟲熒光素酶基因?qū)删w生物擴(kuò)增法原理示意圖122噬菌體生物擴(kuò)增法原理示意圖52GenProbe方法檢測結(jié)核分枝桿菌1.原理2.菌種鑒定123GenProbe方法檢測結(jié)核分枝桿菌1.原理53RNA/RNA錯(cuò)配法

Nash等(1997)首先將該法用于RFP耐藥菌株培養(yǎng)物的檢測。該