2013年臨床醫學專業免疫學實驗課一、間接免疫熒光（寫實驗報告）二、ELISA法檢測HBs-Ab（寫實驗報告）三、凋亡細胞的DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（寫實驗報告）第二次

實驗課內容免疫標記技術

免疫標記技術是指用酶、熒光素、同位素等標記分子標記Ab或Ag，通過酶聯比色儀、熒光顯微鏡或放射測定來定量檢測AgAb反應。免疫標記技術不改變標記的Ag或Ab的性質，不改變包被的Ag或Ab的性質，不影響AgAb反應的特異性。該技術具有靈敏性高及特異性強，既能定性、定量，又能定位檢測的特點。免疫標記技術包括免疫酶技術（如酶聯免疫吸附試驗）、免疫熒光技術、放射免疫測定等方法。

免疫熒光技術

是利用熒光素標記的抗體來分析或定位相應抗原，以測定細胞相應抗原的存在。廣泛應用于免疫學中的一種熒光素是異硫氰酸熒光素（FITC），當在熒光顯微鏡下用紫外線照射時，發出可見的黃綠色熒光。另一個廣泛應用的熒光素是藻紅蛋白（PE），發出可見的紅色熒光。免疫熒光技術分為直接法、間接法和補體法等。免疫熒光技術-直接法免疫熒光技術-間接法免疫熒光技術-補體法補體法

實驗三間接免疫熒光[原理]間接免疫熒光法是用熒光素標記二抗以檢測Ag或Ab的一種實驗技術。其原理是Ag首先與一抗結合，然后一抗再與熒光素標記的二抗結合，形成一個Ag-Ab1-熒光素標記Ab2的三分子復合物，在熒光顯微鏡下呈現熒光。實驗材料：抗原：分離人PBMC一抗：兔抗人白細胞血清二抗：FITC-抗兔單克隆抗體已劃好標記圈的標本片洗脫液（PBS）間接免疫熒光法操作步驟：一、分離新鮮人血清中的PBMC

外周血單個核細胞分離

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葡蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法[原理]外周血單個核細胞（PBMC）包括淋巴細胞、單核細胞，其體積、形狀和比重與其他細胞不同。紅細胞和多核細胞比重較大，為1.092左右，而淋巴細胞和單核細胞比重為1.075左右。利用比重為1.077左右的分層液作密度梯度離心，使一定比重的細胞按密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分離。[材料]1、淋巴細胞分層液（葡蔗糖-泛影葡胺，比重為1.077±0.001g/L）2、Hank’s液或者RPMI-1640培養基3、試管、吸管、水平離心機等[方法]1、無菌采集靜脈血2-3ml，注入盛有肝素的抗凝試管中，混勻。2、吸取淋巴細胞分層液3ml加入離心管中，再將稀釋抗凝血液2ml（剩余的抗凝血離心取血漿作檢測HBsAb用)小心沿管壁加至分層液上，應注意保持兩者界面清晰。（關鍵）3、室溫2000r／min離心20min。管內可分為四層。4、用毛細吸管輕輕吸出乳白色的單個核細胞，加入到1.5ml的EP管中作細胞抗原備用。

（淡黃色）（乳白色）（無色）（白色）（紅色）二、涂細胞抗原片將PBMC用適量PBS稀釋，取10μl左右液體滴加到標本片黑色圈圈背面中央。靜止5-10分鐘，待PBMC干燥。固定。三、加入一抗將稀釋好的一抗約15μl滴加到涂有細胞的標本片處（可看到一小薄層圓圈），37℃，濕盒孵育30分鐘。四、漂洗階段。甩干標本片上液體，小心擦去圓圈周圍的殘余液體，于圓圈中央滴加洗脫液1滴，水平來回震蕩，靜置5分鐘，再甩去液體。重復上述步驟，洗滌5次。五、加入熒光二抗（整個實驗過程需關閉強烈光源，避光?。⒍辜s15μl滴加到涂有細胞的標本片上（可看到一小薄層圓圈）。37℃，濕盒避光孵育30分鐘。

六、漂洗階段。同步驟4，洗滌5次。

七、鏡檢。將干燥后標本片移至熒光顯微鏡下觀察結果。FITC為綠色熒光。結果觀察：熒光顯微鏡觀察：暗背景中有綠色熒光細胞實驗四

酶聯免疫吸附試驗(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應板）表面，使抗原抗體反應在固相表面進行。由于Ab

或Ag與酶連接后，仍保持免疫活性和酶活性，當相應Ag、Ab特異性結合后，其分子上的酶作用相應底物時，可引起底物水解顯色，根據顏色的有無和深淺來檢測Ab或Ag。常用ELISA檢測方法有：間接法、抗原競爭法、夾心法（雙抗體夾心法、雙抗原夾心法）和其他方法。間接法

基本原理與類型

雙抗體夾心法

竟爭法

實驗條件選擇：

固體載相：纖維素、聚苯乙烯板

底物：價廉、安全、本身無色、酶解后出現顏色

終止反應：強酸、強堿，以保持實驗時間不需太長

終點測定：目測、分光光度計酶：辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）

底物：分解后顏色溶解度

鄰苯二胺（OPD）深桔黃色大3,3,5,5,-四甲基聯苯胺（TMB）藍綠色大

堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,AP)底物：分解后顏色溶解度萘酚（AS-mx）、快藍（FB）藍色小快紅（FR）紅色小ELISA（雙抗原夾心法）查HBs-Ab

[原理]

采用純化HBsAg包被酶標板，加入待測標本，同時加入酶標抗原（HBsAg-HRP），當標本中存在抗HBsAg的抗體HBsAb時，HBsAb與包被HBsAg結合并與HBsAg-HRP結合形成HBsAg－HBsAb-HBsAg-HRP復合物，加入TMB底物產生顯色反應，反之則無顯色反應。[材料]1、HBsAg包被酶標板2、酶標抗原（HBsAg-HRP）3、陽性對照（HBsAb+）4、陰性對照（HBsAb-）5、待測標本（血漿）6、洗滌液7、顯色劑A+顯色劑B（TMB底物）8、終止液[方法]1、在已包被抗原的酶標反應板的每孔中加入待測標本50μl，設陰性對照、陽性對照各兩孔。孔內均加相應的試劑一滴。并設空白對照孔1孔。2、

每孔加入酶標抗原一滴（空白對照孔除外），充分混勻，封板，37℃孵育30分鐘。3、洗板：棄去孔內液體，洗滌液注滿各孔，靜置5秒，甩干，重復五次后拍干。4、

每孔加入顯色劑A、顯色劑B各一滴，充分混勻，封板，37℃孵育15分鐘。（藍綠色）5、每孔加入終止液一滴，混勻。（黃色）6、觀察各孔顏色變化。思考題：為什么標記一種抗抗體能檢測多對抗原抗體系統？附：乙肝病毒（hepatitisBvirus，HBV）抗原：抗體1、表面Ag（HBsAg）HBsAb2、核心抗原（HBcAg）HBcAb3、e抗原（HBeAg）HBeAb兩對半：HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb

HBV-Ag、Ab檢測結果臨床分析HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb+----HBV感染/無癥狀攜帶者+-+--急性/慢性乙肝/無癥狀攜帶者+-+-+

急性/慢性乙肝（傳染性強，大三陽）

+

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+

+

急性感染趨向恢復（小三陽）-+-+

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既往感染恢復期-+--+

既往感染恢復期---+-既往感染或“窗口期”-+---既往感染或接種過疫苗12345

實驗五凋亡細胞的DNA瓊脂糖凝膠電泳分析

【原理】本實驗是利用瓊脂糖凝膠電泳分析小鼠胸腺淋巴細胞在地塞米松誘導下細胞的凋亡現象。細胞在凋亡過程中有一系列特征性的形態學的改變，其中最重要和最具有特征性的改變是Ca2+/Mg2+依賴性的核酸內切酶的激活而導致染色質DNA在核小體連接部位斷裂，降解為180~200bp的片段或其整倍數的片段，通過瓊脂糖凝膠電泳可形成典型的“梯狀帶”。

【材料】昆明小鼠RPMI-1640培養基小牛血清地塞米松基因組DNA抽提試劑盒10mg/mlRNA酶TE緩沖液(pH8.0)50×TAE電泳緩沖液DNAladder分子量標準品6×凝膠加樣緩沖液眼科剪、眼科鑷、不銹鋼網、250目尼龍濾布、臺式高速離心機、恒溫水浴、瓊脂糖凝膠電泳裝置、紫外透射儀等

【方法】一、1％瓊脂糖凝膠的制備稱取1g瓊脂糖粉溶于100ml1×TAE緩沖液中，隔水煮沸溶解(或微波爐中溶解）。取15ml上述1％瓊脂糖制成凝膠板備用。

二、胸腺細胞的制備：眼球摘除放血頸椎脫臼處死小鼠，無菌條件下取胸腺，置入含5%小牛血清的預冷RPMI-1640培養液中，先用不銹鋼網研磨，再將研磨好的細胞懸液用250目尼龍濾布過濾，1000rpm離心4min，調整細胞濃度為1x107/ml。取上述1x107/ml濃度的胸腺細胞加入終濃度為1x10－5M的地塞米松，培養5h即為凋亡陽性細胞，不加地塞米松為對照組。（去上清，沉淀細胞加1ml1640混勻備用）。三、小鼠胸腺細胞DNA快速提取小鼠胸腺細胞（細胞濃度107/ml）（誘導組和未誘導組）EP管(1.5ml)棄上清充分混勻后，55℃溫浴20分鐘。12000轉/分，10秒20mlA液和100mlL液加入10μl3MNaAc和1250μlB液充分振蕩混勻后離心12000轉3分鐘期間顛倒EP管五次移取700ml至吸附柱中,靜止1分鐘，離心30s。棄去收集管中的液體，重復上述操作。加入600μlW液離心30s。棄去收集管中的液體，重復上述操作，再離心1次將吸附柱移入一個干凈的EP管中(1.5ml)中。在吸附膜的