InsulinFactor

Ⅷ發酵工程：解決規模放大的問題plasma

derived

FVIII優點：1.成本低廉；2.制作簡單；缺點：1.

資源受限；含有雜質；污染；（HIV，HBV）Source

of

FactorVIIIGlobal

Factor

VIII

sales

exceed

US$5

billion

per

yearThe

Cost

of

Factor

VIII

TherapyA

single

treatment

costs

$1,000

to

$2,000

for

an

adult對比：蛇毒抗血栓藥物生產過程4times/yearPurifyAntibodyaffinitychromatography15,000

snakes1250

gcrude100,000

vialsFermentation10L

supernatantFormulation1

g

nAnfibatideHarvest1

wk/batchHarvestPurifyCommonchromatography100,000

vialsFormulation1

grAnfibatide天然提取工程發酵工程：解決規模放大的問題小試中試發酵工程的發展簡史1第一階段傳統釀造技術（1900之前），食品11發酵工程的發展簡史118431822,born

法國高師1854里爾工學院院長1840

1846中學畢業

畢業1847博士1849乙醇發酵1859自然發生論1865解決蠶病1870蠶病,法國啤酒1857,乳酸發酵1873法國（高溫滅菌） 醫學院1882法蘭西學院1882狂犬1881炭疽1895逝世L.Pasteur事跡簡介12第二階段:準“純菌培養”階段，1900—1940現代工業發酵技術之父，利用丁醇梭桿菌來生產發酵工程的發展簡史113發酵工程的發展簡史1第三階段：通氣發酵技術及裝備，抗生素，1940-1950代表性成就：1921溶菌酶；1928青霉素；14Discovered

byAlexander

Fleming1928proved

to

be

too

difficultFull

scale

production1940’s

1945Fermentationroute

waschosenEfforts

toincrease

productioncell

line

selectionmedium

optimizationprocess

development15+

years發酵工程的發展簡史1厭氧發酵→有氧發Chemical

synthes酵is弗洛里The

story

of

penicillin15第四階段誘變育種和代謝控制時期,氨基酸，1950-1980發酵工程的發展簡史116發酵工程的發展簡史1工程藥物也屬于轉

產品

！第五階段現代發酵工業，重組胰島素、干擾素，1980-現在17發酵工程的發展簡史118第一階段第二階段發酵設備的進步1900年以前

木制，溫度和熱交換儀器1900-1940年鋼制，出現機械攪拌第三階段第四階段第五階段1940-1950年使用檢測電極1950-1980年更大，更完善，計算機初步使用1980-現在大規模細胞發酵罐，自動化219發酵工程簡介發酵食品工業Fermented

Foods有機酸發酵工業

anic

Acids3．氨基酸發酵工業Amino

Acids低聚糖與多糖發酵工業oligosaccharides

and

polysaccharides核苷酸發酵工業Nucleotides

藥物發酵工業Pharmaceutical維生素發酵工業vitamin酶制劑發酵工業Enzymes發酵飼料工業Feedstuff生物肥料與

工業biofertilizer

and

biological

pesticide溶劑發酵工業Solvent水的生物處理工業及環保Environmental

Application(Waste

Treatment)發酵工業類型2發酵工程簡介20發酵工程：利用微生物/細胞的特定性狀，通過現代工程技術在生物反應器中生產有用物質的一種技術體系。221發酵工程簡介一、發酵的相關概念決定發酵工業生產水平的三要素：生產菌種、發酵設備、生產工藝FERMENTATIONProcess

Control上游工程UPSTREAMPROCESSES下游工程DOWNSTREAMPROCESSES二、發酵工程組成從廣義上講，由三部分組成：上游工程、發酵工程、下游工程2發酵工程簡介發酵菌種發酵設備（發酵工藝）產品的提取（純化工藝）生產工藝221

選育獲得高產菌種2

反應器及過程放大3

發酵過程優化和控制4

發酵產物分離提取三、發酵工程的主要內容Part1：上游工程-菌種篩選過程2發酵工程簡介以生物技術藥物領域

酵母發酵工程研究為例，進一步介紹發酵工程的上游工程、中游工程和下游工程24The

ther utic

protein

dividedinto

two

segments：Proteins

that

are

not

PTM（Posttranslational

modification）Proteins

that

require

PTM

(mostly

N-glycosylation)2發酵工程簡介-上游工程25各種重組蛋白表達系統優勢比較2發酵工程簡介-上游工程Heterologous

proteins

expressed

by

P.

pastorisUp

to

5000proteinsexpressed

inP.

pastorisTheruticproteinsproduced

inP.

pastorisKalbitor

is

a

drug

used

for

the

treatment

of

hereditarioedema(HAE)

and

in

the

prevention

of

blood

loss

in

cardiothoracic

surgery.

Itis

an

inhibitor

of

the

protein

kallikrein.approved

byFDA

in

20092發酵工程簡介-上游工程Advantages

of

Pichitoris:Growing

on

chemically

defined

mediaThe

high

yieldsFacilitate

scale-upPTM

(glycosylation,

disulphide

isomerization,

lipidation,sulphation

orphosphorylation)Strong&inducible

AOX

promoter

(30%

of

total

cellular

protein)不存在原核表達系統的內毒素難以除去的問題不存在哺乳動物細胞表達系統的

和支原體污染等問題Comparison

of

yeast-based

expression

systemsCandida,

Turolopsis2發酵工程簡介-上游工程High

MannoseHumanized

glycosylation2發酵工程簡介-上游工程Disadvantages

of

Pichitoris:Tillman

Gerngross,

the

ScientistTurned

Scientific

BusinessmanProfessor

of

Engineering常規酵母人源糖基化改造酵母改造Pichi toris

expression

systemVectors

StrainsGS115KM71X-33SDMsNRRLY-11430Pichia

pinks……pHIL-D2pGAPZpPIC3KpGAPZ

αpPIC9KpAO815pPICZpPICZαpHIL-S1Promoters:

PAOX,PGAP;Signals:

α-MF,PHO,SUC23.:

G418,Zeocin4.High

copies

selectionTransformationPhenotype:

Mut+

,MutS,

His+Protease…

…2發酵工程簡介-上游工程302發酵工程簡介-上游工程0.5

1.0G4182.0

3.0ScreeningConstructionOptimizationGene

of

interest目的：獲得最優的發酵菌株對于工程藥物需要注意：1.這個菌株是轉菌株；2.這個是人類的；3.一般不直接食用轉菌體；232生物制藥發酵工程簡介Part2：發酵工程-產物生產累積過程233發酵工程簡介-中游工程中游工程：發酵菌種擴大培養2發酵工程簡介-中游工程擴培的目的：接種量的需要菌種的馴化縮短發酵時間、保證生產水平的質量要求：總量及濃度能滿足要求生理狀況穩定，

與群體強，移種至發酵后，能夠迅速生長無雜菌污染34中游工程：發酵設備與工藝發酵條件調控、無菌環境控制、過程分析和控制等設備

工藝235發酵工程簡介-中游工程2發酵工程簡介-中游工程36GMP標準的工作環境2發酵工程簡介-中游工程37溫度影響及控制pH值的影響及控制溶解氧的影響及控制基質濃度及補料的控制菌體濃度CO2和呼吸商的影響及其控制發酵終點的判斷發酵染菌及防治發酵過程控制2發酵工程簡介-中游工程參數傳感器參數傳感器溫度熱電偶，熱敏電阻，鉑電阻，溫度計DCO2CO2電極，膜管傳感器氣體流量熱質量流量計，孔板流量計，轉子流量計各種培養基組分及代謝物生物傳感器攪拌轉速轉速傳感器金屬離子濃度離子選擇性電極料液量測力傳感器排氣中的氧分壓熱磁氧分析儀，氧化鎬陶瓷氧分析儀氣泡接觸電極排氣中的CO2分壓紅外氣體分析儀補料速度轉速傳感器，測力傳感器培養液濁度或菌體濃度光導纖維（光電池法），等效電容法pH復合玻璃電極pH復膜氧電極，膜管傳感器發酵過程控制：代謝變化與控制參數目前常用的生物化工參數及其傳感器2發酵工程簡介-中游工程2發酵工程簡介-中游工程發酵過程控制：溫度的影響及控制溫度對發酵的影響影響各種酶反應的速率，改變菌體代謝產物的

方向，影響微生物的代謝調控機制，影響發酵液的理化性質。影響發酵液的黏度、基質和氧在發酵液中的溶解度和傳遞速率、某些基質的分解吸收速率等。2發酵工程簡介-中游工程41最適生長溫度與最適生產溫度往往是不一致的，可采用變溫發酵發酵過程控制：pH的影響及控制1.pH值對發酵的影響影響酶的活性影響微生物細胞的結構影響微生物對基質的利用速率影響代謝方向檸檬酸，當在pH2.5-6.5范圍內時以菌體生長草酸為主。谷氨酸：中性或微堿產谷氨黑曲霉菌在pH2-2.5為主，而在pH7.0時，則以酸/酸性產谷氨酰胺2發酵工程簡介-中游工程發酵過程控制：pH的影響及控制2發酵pH值的確定同一菌種，生長最適pH可能與產物

最適pH不用。最適pH是根據實驗來確定的，即配制不同初始pH的培養基，搖瓶

發酵情況。2發酵工程簡介-中游工程431.溶解氧（dissolved

oxygen,

DO）的影響最適氧濃度（optimal

oxygen

concentration）臨界氧濃度（critical

value

of

dissolved

oxygen

concentration）指不影響菌的呼吸所允許的最低氧濃度溶氧大小與產物的生物

途徑有關，如氨基酸

；發酵過程控制：DO的影響及控制2發酵工程簡介-中游工程2.溶氧濃度決定因素：供氧和需氧兩方面（一）供氧方面：（二）需氧方面：控制方法：通過控制基質濃度，通氣量，純氧，攪拌DO-stat控制44基質對發酵影響碳源對發酵的影響氮源對發酵的影響無機氮源和有機氮源兩類磷酸鹽對發酵的影響微量元素如Cu2+，生物素，Mn2+等發酵過程控制：基質濃度及補料的控制2發酵工程簡介-中游工程補料方式分批培養（batchculture

）補料分批培養（fed-batchculture）連續培養（continuous

culture）（1）分批發酵法

（2）補料分批發酵法中游工程：補料方式2發酵工程簡介-中游工程46（3）連續培養法發酵體積不變發酵體積變大體積基本不變發酵過程控制：基質濃度及補料的控制菌體生長階段菌體生長期、發酵前期產物生成階段產物生產期、發酵中期菌體自溶階段菌體自溶期、發酵后期。遲滯期 對數生長期

穩 定

期

期2發酵工程簡介-中游工程代謝曲線的研究有利于掌握發酵代謝變化的規律和發現工藝控制中存在的問題，有助于改進工藝，提高產物的產量發酵過程控制：發酵終點的確定菌體濃度、補料、溫度、pH值溶氧、染菌、CO2、中游工程：發酵工程影響因素小結2發酵工程簡介-中游工程發酵過程參數：發酵工程技術要求：明確的代謝路線：代謝途徑優化，代謝調節條件明確，產物代謝流通暢。嚴格的生長條件：溫度、pH、DO、營養等條件適宜、基質成分及反應器結構配置合理；純種培養條件：

規程操作、純種狀態；恰當的控制條件：靈巧的參數調節、合理的時段設置、經濟的成本消耗；合理的操作方式：

培養方式（營養細胞/

孢子）、發酵操作方式（分批、補料or連續）。2發酵工程簡介-中游工程502發酵工程簡介Part3：下游工程-產物純化過程對于

工程藥物需要注意：最終獲得產品是高度純化、成分確定的物質；轉

食物是什么成分呢？Downstream

processing,

what

and

whyDownstream

processing

is

any

treatment

of

culture

broth

after

fermentationto

concentrate

and

purify

products.

It

follows

a

general

sequence

of

steps:Clarification,

(cell

removal

by

centrifugation&filtration)Primary

isolation

(Large

volume)Purification

(Highly

selective)Quality

ControlDownstream

processing

mostly

contributes

40-90

%

of

total

cost252發酵工程簡介-下游工程×0.8=12000

g1.Centrifugation（離心）:2.Filtration（過濾）

:Clarification(樣品澄清)Thetypes

of

filtration

usedin

biotechnology

include:Microfiltration（微濾）Ultrafiltration

（超濾）Reverse

Osmosis(反向滲透，not

discussed

here)254發酵工程簡介-下游工程Types

of

Microfiltration255發酵工程簡介-下游工程What’s

the

difference

of

these

materials?How

select

proper

size

for

microfiltrationTypes

of

Ultrafiltration257發酵工程簡介-下游工程258發酵工程簡介-下游工程Microfiltration

vs.

UltrafiltrationMicrofiltration:Proteins

apermeatetheUltrafiltrationProteins

aretentatetheHowever,processes

arebasically

identical59Purification(蛋白純化)Chromatographic

techniques

usually

employed

for

high

value

products.These

methods,

normally

involving

columns

of

chromatographic

media(stationary

phase),

are

used

for

desalting,

concentration

and

purificationof

protein

preparations.

Several

important

aspects

are

molecular

weight,isoelectric

point,hydrophobicity

and

biological

affinity.

Methods

are:Size

exclusion

chromatography分子篩（分子排阻）層析Ion

exchange

chromatography離子交換層析Hydrophobic

chromatography疏水層析Affinity

chromatography親和層析260發酵工程簡介-下游工程2發酵工程簡介-下游工程質量控制（QC）SDS-PAGE、HPLC、CE、Western

blot、MS、N-端

、糖基分析等檢測項目：1.

含量測定

2.

質譜測定3.

純度測定

4.紫外吸收光譜分析5.

肽譜分析

6.

穩定性試驗7.

酵母宿主殘留測定

8.

內毒素含量測定9.純化介質膠殘留量測定等技術方法：盡可能確保成分明單一、明確！61200420082014

2015

20162018

<2020Ernst

&

Young發酵工程處于的

研究階段2發酵工程簡介-下游工程盡可能確保安全有效！生物技術藥物開發步驟發酵工程的應用領域363生物質原料化學品－精細化學品－大宗化學品－生物塑料－溶劑生物能源－生物－生物柴油－甲醇－氫氣－沼氣食品與藥品－氨基酸－食品添加劑－食品強化劑－維生素－抗生素發酵工程的應用領域364一、

和健康領域–常規發酵產品：抗生素、維生素、激素的生產；–

工程菌發酵產品：免疫調節劑和

品、新型藥物（人干擾素、胰島素、生長激素、

、抗體等）；2015/5/5

65發酵工程的應用領域3β-內酰胺類抗生素，作用機理相似，抑制細菌細胞壁形成66二、食品釀造領域醋、醬油、面包、乳酪、酸乳、腐乳、酒等2015/5/567發酵工程的應用領域3發酵工程的應用領域368發酵工程的應用領域369一是釀造工藝、二是儲藏工藝、三是勾兌工藝你相信這些年份是真的嗎？白葡萄酒紅葡萄酒發酵工程的應用領域370自釀葡萄酒好不好？發酵工程的應用領域3例：自釀葡萄酒最有可能含有以下哪種物質，不易長期飲用。（

）A.

甲醇；

B.乙醇；C.

；

D.乙醛；71Q:我要問的問題是：在發酵工程那一節，自釀葡萄酒產生的

物質為

甲醇？發生的反應過程是什么？A：葡萄皮中的果膠在果膠酶或加熱的作用下，可能分解出甲醇，霉變也會產生大量甲醇，發酵越徹底，甲醇含量會越高。除甲醇外，還有可能含有雜醇油等有害成分。發酵工程的應用領域3食品安全發酵工程的應用領域3732015/5/574三、生物能源與資源–微生物可再生的生物質資源轉化。–微生物提

細化工和高分子聚合物的原料。–微生物富集貧礦和微量金屬元素；發酵工程的應用領域375發酵工程的應用領域3生物能源76Consolidated

bioprocessing

(CBP)聯合生物加工77Efficient

CBP

microbe

wantedThere

is

no

single

microbe

available

for ng

CBP

efficiently.the

best

ethanol

producercellulolyticenzymesPoor

secretionHigh

glycosyl