第七章

目的基因在宿主中的表達2011-10-221目的基因在宿主中的表達外源基因在大腸桿菌中的表達外源基因在酵母菌中的表達外源基因在哺乳動物細胞中的表達外源基因在高等植物細胞中的表達2011-10-222目的基因在宿主中的表達緒：基因表達的關鍵因素1.轉錄起始（關鍵和限速步驟）轉錄宿主RNA聚合酶啟動子2011-10-223目的基因在宿主中的表達2.mRNA的延伸與穩定性非特異性終止:衰減子,抗終止序列正確終止轉錄：終止序列mRNA穩定性與Poly(A)尾有關載體上添加Poly(A)摻入信號宿主RNase缺失,增強mRNA穩定性2011-10-224目的基因在宿主中的表達強化轉錄終止的必要性

外源基因在強啟動子的控制下表達，容易發生轉錄過頭現象，即RNA聚合酶滑過終止子結構繼續轉錄質粒上鄰近的DNA序列，形成長短不一的mRNA混合物。過長轉錄物的產生在很大程度上會影響外源基因的表達，其原因如下：轉錄產物越長，RNA聚合酶轉錄一分子mRNA所需的時間就相應增加，外源基因本身的轉錄效率下降。如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或DNA功能區域，如選擇性標記基因和復制子結構等，則RNA聚合酶在此處的轉錄可能干擾質粒的復制及其它生物功能，甚至導致重組質粒的不穩定性。過長的mRNA往往會產生大量無用的蛋白質，增加工程菌無謂的能量消耗。更為嚴重的是，過長的轉錄物往往不能形成理想的二級結構，從而大大降低外源基因編碼產物的翻譯效率。2011-10-225目的基因在宿主中的表達3．mRNA有效翻譯原核翻譯⑴AUG起始密碼子⑵SD序列:與16SrRNA互補結合位點，該序列至少含有AGGAGG序列中的4個堿基⑶SD序列與ATG之間合適距離3-9bp⑷翻譯起始區間內不形成明顯二級結構(5)終止密碼子：UAA、UAG、UGA2011-10-226目的基因在宿主中的表達4．外源蛋白的穩定性融合蛋白分泌蛋白表達系統包涵體表達系統使用蛋白水解酶基因缺陷型受體細胞2011-10-227目的基因在宿主中的表達5.目的基因的沉默1）位置效應目的基因位于甲基化程度高，轉錄活性低的異染色質上2）轉錄水平基因沉默啟動子甲基化和外源基因的異染色質化；

目的基因的重復序列可導致自身甲基化3）轉錄后水平基因沉默

共抑制(cosuppression)是轉錄后水平的基因沉默，指被整合的外源基因沉默的同時，與其同源的內源DNA的表達也受到抑制。2011-10-228目的基因在宿主中的表達一、外源基因在大腸桿菌中的表達2011-10-229目的基因在宿主中的表達1.大腸桿菌表達外源基因的優勢全基因組測序，共有4405個開放閱讀框基因克隆表達系統成熟完善繁殖迅速、培養簡單、操作方便、遺傳穩定被美國FDA批準為安全的基因工程受體生物2011-10-2210目的基因在宿主中的表達2.大腸桿菌表達外源基因的劣勢缺乏對真核生物蛋白質的復性功能缺乏對真核生物蛋白質的修飾加工系統內源性蛋白酶降解空間構象不正確的異源蛋白細胞周質內含有種類繁多的內毒素2011-10-2211目的基因在宿主中的表達3.外源基因在大腸桿菌中高效表達的理論基礎啟動子終止子核糖體結合位點密碼子質粒拷貝數2011-10-2212目的基因在宿主中的表達3.1啟動子目的基因(1)啟動子最佳距離的探測AEE

目的基因EEA酶切開啟動子

Bal31酶解2011-10-2213目的基因在宿主中的表達PλLPtrp(2)啟動子的構建啟動子

PrecA

PtraA

Plac

Ptac-35區序列TTGACATTGATATAGACATTGACATTTACATTGACA

-10區序列GATACTTATAATTAATGTTTAACTTATAATTATAATPtac=3Ptrp=11Plac2011-10-2214目的基因在宿主中的表達(3)啟動子的可控性：乳糖操縱子的啟動子Plac野生型的Plac與其控制區Olac偶聯在一起，在沒有誘導物存在時，整個操縱子處于基底水平表達；誘導物可以使啟動子Plac介導的轉錄大幅提高。誘導作用2011-10-2215目的基因在宿主中的表達(3)啟動子的可控性：乳糖操縱子的啟動子Plac野生型的Plac上游附近擁有代謝激活因子（CAP）結合區，cAMP激活CAP，cAMP-CAP復合物與DNA結合，改變DNA結構，促進RNA聚合酶和啟動子結合，使轉錄能力增強。葡萄糖代謝使cAMP減少，從而阻遏Plac介導的轉錄。因此，基因工程中使用的乳糖啟動子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即PlacUV5。cAMP的正調控作用2011-10-2216目的基因在宿主中的表達(3)啟動子的可控性：色氨酸啟動子Ptrp的可控性色氨酸啟動子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白復合物的阻遏，轉錄呈基底狀態。在培養系統中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的細菌培養體系中，除去色氨酸是困難的，因此基因工程中往往添加IAA誘導Ptrp介導的目基因的表達。2011-10-2217目的基因在宿主中的表達3.2終止子2011-10-2218目的基因在宿主中的表達

強終止子的選擇與使用

目前外源基因表達質粒中常用的終止子是來自大腸桿菌

rRNA操縱子上的rrnT1T2以及T7噬菌體DNA上的Tφ。對于一些終止作用較弱的終止子，通常可以采用二聚體終止子串聯的特殊結構，以增強其轉錄終止作用。

終止子、啟動子等，可以通過特殊的探針質粒從細菌或噬菌體基因組DNA中克隆篩選。3.3核糖體結合位點RBS

外源基因在大腸桿菌細胞中的高效表達不僅取決于轉錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關。大腸桿菌細胞中結構不同的mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時可高達數百倍。mRNA翻譯的起始效率主要由其5’端的結構序列所決定，稱為核糖體結合位點（RBS，RibosomeBindingSite）2011-10-2219目的基因在宿主中的表達(1)核糖體結合位點的結構大腸桿菌核糖體結合位點包括下列四個特征結構要素：①位于翻譯起始密碼子上游的6-8個核苷酸序列5’UAAGGAGG3’：即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3’端區域3’AUUCCUCC5’并與之專一性結合，將mRNA定位于核糖體上，從而啟動翻譯。②翻譯起始密碼子：大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點，但有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子。③SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成④基因編碼區5’端若干密碼子的堿基序列2011-10-2220目的基因在宿主中的表達(2)核糖體結合位點對外源基因表達的影響SD序列的影響：

一般來說，mRNA與核糖體的結合程度越強，翻譯的起始效率就越高，而這種結合程度主要取決于SD序列與16SrRNA的堿基互補性，其中以GGAG四個堿基序列尤為重要。對多數基因而言，上述四個堿基中任何一個換成C或T，均會導致翻譯效率大幅度降低。2011-10-2221目的基因在宿主中的表達SD序列與起始密碼子之間的序列的影響：

SD序列下游的堿基若為AAAA或UUUU，翻譯效率最高；而CCCC或GGGG的翻譯效率則分別是最高值的50%和25%。緊鄰AUG的前三個堿基成份對翻譯起始也有影響，對于大腸桿菌β-半乳糖苷酶的mRNA而言，在這個位置上最佳的堿基組合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，則酶的表達水平低20倍。2011-10-2222目的基因在宿主中的表達SD序列與起始密碼子之間的距離的影響：

SD序列與起始密碼子之間的精確距離保證了mRNA在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子AUG正好處于核糖體復合物結構中的P位，這是翻譯啟動的前提條件。在很多情況下，SD序列位于AUG之前大約七個堿基處，在此間隔中少一個堿基或多一個堿基，均會導致翻譯起始效率不同程度的降低。2011-10-2223目的基因在宿主中的表達起始密碼子及其后續若干密碼子的影響：

大腸桿菌中的起始tRNA分子可以同時識別AUG、GUG和UUG三種起始密碼子，但其識別頻率并不相同，通常GUG為AUG的50%而UUG只及AUG的25%。除此之外，從AUG開始的前幾個密碼子堿基序列也至關重要，至少這一序列不能與mRNA的5’端非編碼區形成莖環結構，否則便會嚴重干擾mRNA在核糖體上的準確定位。

目前廣泛用于外源基因表達的大腸桿菌表達型質粒上，均含有與啟動子來源相同的核糖體結合位點序列，序列和間隔是最佳的。2011-10-2224目的基因在宿主中的表達3.4密碼子（1）生物體對密碼子的偏愛性

不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質編碼基因，對簡并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性，其決定因素是： 密碼子與反密碼子相互作用的自由能：性中等強度規律如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少；如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多；細胞內tRNA的含量生物基因組中的堿基含量：在富含AT的生物（如單鏈DNA噬菌體φX174）基因組中，密碼子第三位上的U和A出現的頻率較高；而在GC豐富的生物（如鏈霉菌）基因組中，第三位上含有G或C的簡并密碼子占90%以上的絕對優勢。2011-10-2225目的基因在宿主中的表達CodonUsageDatabaseAspergillusoryzaeAspergillusnigerSaccharomycescerevisiaeEscherichiacoli

2011-10-2226目的基因在宿主中的表達（2）密碼子偏愛性對外源基因表達的影響由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程度的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個重要因素是密碼子的正確選擇。一般而言，有兩種策略可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細胞中獲得最佳表達：外源基因全合成同步表達相關tRNA編碼基因2011-10-2227目的基因在宿主中的表達外源基因全合成按照大腸桿菌密碼子的偏愛性規律，設計更換外源基因中不適宜的相應簡并密碼子。重組人胰島素、干擾素以及生長激素在大腸桿菌中的高效表達均采用了這種方法。實驗技術：密碼子優化http://genomes.urv.cat/CAIcal/OPTIMIZER

2011-10-2228目的基因在宿主中的表達同步表達相關tRNA編碼基因

對于那些含有不和諧密碼子種類單一、出現頻率較高、而本身分子量又較大的外源基因而言，則選擇相關tRNA編碼基因同步克隆表達的策略較為有利。

例如，在人尿激酶原cDNA的412個密碼子中，共含有22個精氨酸密碼子，其中7個AGG、2個AGA，而大腸桿菌受體細胞中tRNAAGG和tRNAAGA的豐度較低。為了提高人尿激酶原cDNA在大腸桿菌中的高效表達，將大腸桿菌的這兩個tRNA編碼基因克隆在另一個高表達的質粒上。由此構建的大腸桿菌雙質粒系統有效地解除了受體細胞對外源基因高效表達的制約作用。2011-10-2229目的基因在宿主中的表達3.5質粒拷貝數（1）質粒拷貝數對細菌生長代謝的影響

目前實驗室里廣泛使用的表達型質粒在每個大腸桿菌細胞中可達數百甚至上千個拷貝，質粒的擴增過程通常發生在受體細胞的對數生長期內，而此時正是細菌生理代謝最旺盛的階段。質粒分子的過度增殖以及其后目的基因的高效表達勢必會影響受體細胞的生長代謝，進而導致重組質粒的不穩定性以及目的基因表達水平的下降。

解決上述難題的一種有效策略是將重組質粒的擴增納入可控制的軌道。2011-10-2230目的基因在宿主中的表達（2）質粒擴增時序的控制pCP3擁有一個溫度可誘導型的復制子，在28℃時，每個細胞的質粒拷貝數為60；在42℃時，拷貝數迅速增至300-600。這是因為，在42℃時，受體細胞染色體上的CI基因表達的溫度敏感型阻遏蛋白失活，從而使受溫度調控的質粒的拷貝數增加。2011-10-2231目的基因在宿主中的表達4.大腸桿菌基因工程菌的構建策略包涵體型異源蛋白的表達分泌型異源蛋白的表達融合型異源蛋白的表達寡聚型異源蛋白的表達整合型異源蛋白的表達蛋白酶抗性或缺陷型表達系統的構建2011-10-2232目的基因在宿主中的表達4.1包涵體型異源蛋白的表達（1）包涵體及其性質

在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細胞內，或被膜包裹或形成無膜裸露結構，這種水不溶性的結構稱為包涵體（InclusionBodies，IB）。由高效表達質粒構建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質，后者在一般情況下以包涵體的形式存在于細菌細胞內。

除此之外，包涵體中還含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。2011-10-2233目的基因在宿主中的表達（2）以包涵體形式表達目的蛋白的優缺點包涵體表達形式的優點：能簡化外源基因表達產物的分離操作包涵體的水難溶性及密度遠大于其它細胞碎片和細胞成分，菌體經超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細菌裂解物中分離出來。能在一定程度上保持表達產物的結構穩定在形成包涵體之后，大腸桿菌的蛋白酶降解作用基本上對異源重組蛋白的穩定性已構不成威脅。2011-10-2234目的基因在宿主中的表達包涵體表達形式的缺點：

以包涵體形式表達的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性-復性操作，才能回收得到具有正確空間構象的目標蛋白，因此包涵體變性-復性操作的效率對目標產物的收率至關重要。然而，這也是一個技術難題，尤其當目標蛋白分子中的Cys殘基數目較高時，體外復性蛋白質的成功率相當低，一般不超過30%。2011-10-2235目的基因在宿主中的表達（3）以包涵體形式表達目的蛋白的操作

如果未進行特殊設計（如分泌型表達或融合型表達），外源基因在大腸桿菌中表達的蛋白量占細胞總蛋白量20%以上時，表達產物一般傾向于形成包涵體。因此，以包涵體形式表達目的基因操作的關鍵就是選擇高表達的載體。事實上，這種高表達率也是包涵體法的長處所在。2011-10-2236目的基因在宿主中的表達包涵體的溶解與變性：

包涵體的溶解與變性的主要任務是在人工條件下，拆開包涵體內蛋白質中錯配的二硫鍵和次級鍵，使包涵體溶解并重新進入復性途徑 。能有效促進包涵體溶解變性的試劑和條件包括：（4）包涵體的變性-復性操作清洗劑：SDS、正十二醇肌氨酸。廉價，但影響復性和純化促溶劑：鹽酸胍、尿素。前者昂貴，尿素便宜，但常被自發形成的氰酸鹽污染，后者能與多肽鏈中的氨基反應。混合溶劑：如尿素與醋酸、二甲亞砜等聯合使用，溶解力強。極端pH：廉價，但許多蛋白質在極端pH條件下發生修飾反應。2011-10-2237目的基因在宿主中的表達包涵體的復性與重折疊（refolding）：包涵體的復性與重折疊的主要任務是：將多肽鏈中被拆開的游離巰基重新折疊；通過次級鍵的形成使蛋白質復性。包涵體復性操作的方法包括：一步稀釋法：蛋白復性與濃度無關，但集聚與濃度關系很大。分段稀釋法：逐步降低變性劑的濃度，防止二次集聚的發生。試劑添加法：精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+。蛋白修飾法：氨基檸檬酸酐酰化，蛋白帶負電，抑制集聚。產物隔離法：將變性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞。分子伴侶法：GroEL、GroES、DnaK，固定化，共表達。2011-10-2238目的基因在宿主中的表達包涵體的復性與重折疊（refolding）：二硫鍵形成

在包涵體變性體系中，始終存在著還原劑，使多肽鏈中的巰基保持還原狀態，防止二硫鍵錯配導致嚴重的集聚。在變性操作結束后，這些游離型的巰基必須重新配對形成二硫鍵，此時多肽鏈也重新發生折疊。形成二硫鍵的方式主要有：

化學氧化法（A）：需要電子受體，最廉價的電子受體為空氣，二硫鍵形成是隨機的，僅適用于那些不含游離半胱氨酸殘基的蛋白質的重折疊。 二硫鍵交換（B）：需要還原型和氧化型谷胱甘肽（GSH和GSSG），二硫鍵形成相對特異，因此適用性較廣，重折疊效果好。2011-10-2239目的基因在宿主中的表達4.2分泌型異源蛋白的表達

在大腸桿菌中表達的異源蛋白按其在細胞中的定位可分為兩種形式：即以可溶性或不溶性（包涵體）狀態存在于細胞質中；或者通過運輸或分泌方式定位于細胞周質，甚至穿過外膜進入培養基中。蛋白產物N端信號肽序列的存在是蛋白質分泌的前提條件。2011-10-2240目的基因在宿主中的表達（1）以分泌形式表達目的蛋白的優缺點分泌表達形式的優點：目的蛋白穩定性高重組人胰島素原若分泌到細胞周質中，其穩穩定性大約是在細胞質中的10倍。目的蛋白易于分離目的蛋白末端完整相當多的真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸殘基。當這些真核基因在大腸桿菌中表達時，蛋白質N端的甲硫氨酸殘基往往不能被切除。如若將外源基因與大腸桿菌的信號肽編碼序列重組在一起，一旦分泌型表達，其N端的甲硫氨酸殘基便可在信號肽的剪切過程中被有效除去。2011-10-2241目的基因在宿主中的表達分泌表達形式的缺點：

相對其它生物細胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機制并不健全。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進行分泌型表達，少數外源基因既便能分泌表達，其表達效率通常要比包涵體方式低很多，因此目前用于產業化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌盡管有，但并不普遍。2011-10-2242目的基因在宿主中的表達（2）蛋白質的分泌機制原核細菌周質中含有多種分子伴侶可阻止分泌蛋白的隨機折疊，分泌在細胞周質或培養基中的重組蛋白很少形成分子間的二硫鍵交聯，因此與包涵體相比，分泌型重組蛋白具有較高比例的正確構象，生物活性的回收率增加，且對蛋白酶不敏感。2011-10-2243目的基因在宿主中的表達（3）分泌型目的蛋白表達系統的構建

有些革蘭氏陰性菌的細菌素釋放蛋白，它激活定位于內膜上的磷酸酯酶，導致細菌內外膜的通透性增大。

因此，只要將細菌素釋放蛋白編碼基因克隆在一個合適的質粒上，并轉化宿主菌，即可構建完全分泌型的受體細胞。此時，用另一種攜帶大腸桿菌信號肽編碼序列和目的基因的表達質粒轉化上述完全分泌型受體細胞，使用相同性質的啟動子介導目的基因的轉錄，則可實現目的蛋白從重組大腸桿菌中的完全分泌。2011-10-2244目的基因在宿主中的表達4.3融合型異源蛋白的表達

除了直接表達異源蛋白外，還可將外源基因與受體菌自身的蛋白質編碼基因拼接在一起，并作為一個開放閱讀框進行表達。由這種雜合基因表達出的蛋白質稱為融合蛋白。在這種融合蛋白結構中，通常受體細菌的蛋白部分位于N端，異源蛋白位于C端。通過在DNA水平上人工設計引入蛋白酶切割位點或化學試劑特異性斷裂位點，可以在體外從純化的融合蛋白分子中釋放異源蛋白。2011-10-2245目的基因在宿主中的表達（1）以融合形式表達目的蛋白的優缺點目的蛋白穩定性高：尤其對分子量較小的多肽效果更佳。目的蛋白易于分離：利用受體蛋白成熟的抗體、配體、底物進行親和層析，可以快速獲得純度較高的融合蛋白。目的蛋白表達率高：與受體蛋白共用一套完善的表達元件。目的蛋白溶解性好：由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞內形成良好的空間構象，且大多具有水溶性。目的蛋白需要回收：融合蛋白需要裂解和進一步分離，才能獲得目的蛋白。在實際生產中，產品主要的成本往往就在該工段。2011-10-2246目的基因在宿主中的表達（2）融合型目的蛋白表達系統的構建融合蛋白表達質粒的構建原則：受體細胞的結構基因能高效表達，且其表達產物可以通過親和層析進行特異性簡單純化。外源基因應裝在受體蛋白編碼基因的下游，為融合蛋白提供終止密碼子。在某些情況下，并不需要完整的受體結構基因，目的是盡可能避免融合蛋白分子中兩種組份的分子量過于接近，為目的蛋白分離回收創造條件。兩個結構基因拼接位點處的序列設計十分重要，它直接決定著融合蛋白的裂解工藝。兩個蛋白編碼序列應保持一致的翻譯閱讀框架。2011-10-2247目的基因在宿主中的表達用于融合蛋白構建的受體蛋白：谷胱甘肽轉移酶（GST）：維持良好空間構象麥芽糖結合蛋白（MBP）：促進分泌金黃色葡萄球菌蛋白A（SAPA）：免疫親和層析硫氧化還原蛋白（TrxA）：維持良好空間構象外膜蛋白（OmpF）：促進分泌β-半乳糖苷酶（LacZ）：免疫親和層析泛素蛋白（Ubi）：維持良好空間構象2011-10-2248目的基因在宿主中的表達（3）目的蛋白的回收

融合蛋白中受體蛋白部分的存在可能會影響目的蛋白的空間構象和生物活性，如果將之注入人體還會導致免疫反應，因此在制備和生產藥用目的蛋白時，將融合蛋白中的受體蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位點專一性斷裂方法有兩種：

化學斷裂法酶促裂解法2011-10-2249目的基因在宿主中的表達化學斷裂法：

用于蛋白位點專一性化學斷裂的最佳試劑為溴化氰（CNBr）。它與多肽鏈中的甲硫氨酸殘基側鏈的硫醚基反應，生成溴化亞氨內酯，后者不穩定，在水的作用下肽鍵斷裂，形成兩個多肽降解片段。其中上游肽段的甲硫氨酸殘基轉化為高絲氨酸殘基，而下游肽段N端的第一位氨基酸殘基保持不變。這一方法的優點是回收率高（可達到85%以上），專一性強，而且所產生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸，與真核生物細胞中的成熟表達產物較為接近。然而，如果異源蛋白分子內部含有甲硫氨酸殘基，則不能用此方法。2011-10-2250目的基因在宿主中的表達酶促裂解法：單殘基位點

蛋白酶酶促裂解法的特點是斷裂效率更高，

同時每種蛋白酶均具有相應的斷裂位點決定 簇，因此可供選擇的專一性斷裂位點范圍較 廣。幾種斷裂位點專一性最強的商品化蛋白 酶分別在多肽鏈中的精氨酸、谷氨酸、賴氨 酸殘基處切開酰胺鍵，形成不含上述殘基的 下游斷裂肽段，與溴化氰化學斷裂法相似。用上述蛋白酶裂解融合蛋白的前提條件是外源蛋白分子內部不能含有精氨酸、谷氨酸、賴氨酸殘基，如果外源基因表達產物為小分子多肽，這一限制條件并不苛刻，但對大分子量的異源蛋白來說，上述三種氨基酸殘基的出現頻率是相當高的。2011-10-2251目的基因在宿主中的表達酶促裂解法：多殘基位點

為了克服僅切單一氨基酸殘基的蛋白酶所帶來的應用局限性，可在受體蛋白編碼序列與不含起始密碼子的外源基因之間加裝一段編碼寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接頭片段，該寡肽為具有蛋白酶活性的凝血因子Xa的識別和作用序列，其斷裂位點在Arg的C末端。純化后的融合蛋白用Xa處理，即可獲得不含上述寡肽序列的目的蛋白。由于Xa的識別作用序列由四個氨基酸殘基組成，大多數蛋白質中出現這種寡肽序列的概率極少，因此這種方法可廣泛用于從融合蛋白中回收各種不同大小的目的蛋白產物。2011-10-2252目的基因在宿主中的表達ATCGAAGGTCGCGAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-1IleGluGlyArgGluATCGAAGGTCGCGAAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-2ATCGAAGGTCGCGAAAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-3NruIHindIIIPvuIIBamHIKpnIEcoRVBglIISmaINotIXa因子切割位點2011-10-2253目的基因在宿主中的表達4.4寡聚型異源蛋白的表達構建串聯型異源蛋白表達載體，將多拷貝的外源基因克隆在一個低拷貝質粒上，以取代單拷貝外源基因在高拷貝載體上表達的策略。2011-10-2254目的基因在宿主中的表達4.5整合型異源蛋白的表達整合型的目的基因隨受體細胞染色體DNA的復制而復制，在大多數情況下相當穩定，工程菌在沒有選擇壓力存在下可以連續培養而不丟失目的基因表達盒，這對以改良物種遺傳性狀為目的的基因工程案例特別有意義。2011-10-2255目的基因在宿主中的表達4.6蛋白酶抗性或缺陷型表達系統的構建

無論是在真核生物還是在原核細胞中，重組目的蛋白表達后都會面臨被降解的命運，其穩定性甚至還不如半衰期較短的受體細胞內源性蛋白質。

在大多數情況下，重組目的蛋白的不穩定性可歸結為對受體細胞蛋白酶系統的敏感性。然而越來越多的實驗表明，重組目的蛋白在受體細胞內的半衰期可以通過蛋白序列的人工設計以及受體細胞的改造加以調整和控制。2011-10-2256目的基因在宿主中的表達5.基因工程菌的遺傳不穩定性及其對策基因工程菌遺傳不穩定性的表現與機制改善基因工程菌不穩定性的策略2011-10-2257目的基因在宿主中的表達5.1基因工程菌遺傳不穩定性的表現與機制（1）工程菌遺傳不穩定性的表現形式基因工程菌的遺傳不穩定性主要表現在重組質粒的不穩定性，這種不穩定性具有下列兩種表現形式：結構不穩定性：重組DNA分子上某一區域發生缺失、重排、修飾，導致其表觀生物學功能的喪失。分配不穩定性：整個重組DNA分子從受體細胞中逃逸（curing）2011-10-2258目的基因在宿主中的表達（2）工程菌遺傳不穩定性的產生機制受體細胞中的限制修飾系統對外源重組DNA分子的降解；外源基因的高效表達嚴重干擾受體細胞正常的生長代謝；能量、物質的匱乏和外源基因表達產物的毒性誘導受體細胞產生應激反應：關閉合成途徑，啟動降解程序；重組質粒在受體細胞分裂時的不均勻分配，這是重組質粒逃逸的基本原因；受體細胞中內源性的轉座元件促進重組分子的缺失重排。2011-10-2259目的基因在宿主中的表達（3）重組質粒的逃逸率

當含有重組質粒的工程菌在非選擇性條件下生長時，培養系統中一部分細胞不再攜帶重組質粒，這些空載細胞數與總細胞數之比稱為稱為重組質粒的宏觀逃逸率。重組質粒逃逸的原因有：高溫培養、表面活性劑（SDS）、藥物（利福平）、染料（吖啶）促使重組質粒滲漏；受體細胞中的核酸酶降解重組質粒；重組質粒在受體細胞分裂時不均勻分配，細胞所含重組質粒拷貝數的差異隨著細胞分裂次數的增多而加劇。2011-10-2260目的基因在宿主中的表達5.2改善基因工程菌不穩定性的策略（1）改進載體受體系統以增大質粒穩定性為目的的構建方法包括：將R1質粒上的parB基因引入表達型載體中，其表達產物可以選擇性地殺死由于分配不均勻所產生的無質粒細胞；正確設置載體上的多克隆位點，禁止DNA片段插在非穩定區內；2011-10-2261目的基因在宿主中的表達（2）施加選擇壓力根據載體上的抗藥性標記，向培養系統中添加相應的抗生素。但注意，藥物和食品生產時禁止使用抗生素。根據載體上的營養缺陷型標記，向培養系統中添加相應的營養組份。培養基復雜，成本較高。2011-10-2262目的基因在宿主中的表達（3）控制目的基因的過量表達2011-10-2263目的基因在宿主中的表達（4）優化基因工程菌的培養工藝使用可控型啟動子控制目的基因的定時表達及表達程度；使用可控型復制子控制質粒的定時增殖或降低質粒的拷貝數。培養基組成：限制培養基比豐富培養基更有利于穩定；培養溫度：較低的培養溫度有利于重組質粒的穩定。2011-10-22目的基因在宿主中的表達646.利用重組大腸桿菌生產人胰島素1982年，美國ElyLiLi公司首先使用重組大腸桿菌生產人胰島素，成為世界上第一個上市的基因工程藥物。1987年，Novo公司推出了利用重組酵母菌生產人胰島素的新工藝。上述由基因工程菌合成的重組人胰島素在體外胰島素受體結合性能、淋巴細胞和成纖維細胞的應答能力、降血糖作用、血漿藥代動力學等指標上均與天然胰島素沒有任何區別，而且還具有無免疫原性、注射吸收迅速等優點，充分展示了基因工程在生物醫藥領域中的巨大潛力。

2011-10-2265目的基因在宿主中的表達6.1A鏈和B鏈分別表達法基因工程菌的構建策略：2011-10-2266目的基因在宿主中的表達表達產物的后處理路線：2011-10-2267目的基因在宿主中的表達生產技術的評價：由于A鏈和B鏈上共存在六個半胱氨酸殘基，體外二硫鍵的正確配對率較低，通常只有10%-20%，因此采用這條工藝路線生產的重組人胰島素每克成本高達100美元以上。為了進一步降低生產成本，美國ElyLiLi公司隨后又建立了第二條生產重組人胰島素的工藝路線。

2011-10-2268目的基因在宿主中的表達6.2人胰島素原表達法基因工程菌的構建策略：2011-10-2269目的基因在宿主中的表達表達產物的后處理路線：2011-10-2270目的基因在宿主中的表達生產技術的評價：在人胰島素原表達工藝中，由于C肽的存在，胰島素原能形成良好的空間構象，三對二硫鍵的正確配對率也相應提高，折疊率高達80%以上。雖然這條工藝路線并不比AB鏈分別表達法更為簡捷，而且還要使用兩種高純度的酶制劑，但理想的折疊率在很大程度上彌補了工藝繁瑣的缺陷，使得每克最終產品的成本僅50美元。目前美國ElyLiLi公司采用此工藝年產十幾噸的重組人胰島素。2011-10-2271目的基因在宿主中的表達6.3A鏈和B鏈同時表達法2011-10-2272目的基因在宿主中的表達6.4分泌型重組人胰島素表達法上述三種重組大腸桿菌的構建路線均采用胰島素或胰島素原編碼序列與大腸桿菌b-半乳糖苷酶基因拼接的方法，所產生的融合型重組蛋白表達率高、穩定性強，但不能分泌，只要以包涵體的形式存在于胞質中。一種能促進融合蛋白分泌的工程菌構建策略是將胰島素或胰島素原編碼序列與b-內酰胺酶基因拼接，b-內酰胺酶通常能被大腸桿菌分泌到胞外。由此獲得的工程菌同時具備了穩定高效表達可分泌型融合蛋白的優良特性，為胰島素的后續分離純化工序減輕了負擔。2011-10-2273目的基因在宿主中的表達二、外源基因在酵母菌中的表達2011-10-2274目的基因在宿主中的表達1.酵母菌作為表達外源基因受體菌的特征1.1酵母菌的分類學特征

酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式進行無性繁殖的單細胞真核生物，分屬于子囊菌綱（子囊酵母菌）、擔子菌綱（擔子酵母菌）、半知菌類（半知酵母菌），共由56個屬和500多個種組成。如果說大腸桿菌是外源基因最成熟的原核生物表達系統，則酵母菌是最成熟的真核生物表達系統。2011-10-2275目的基因在宿主中的表達1.2酵母菌表達外源基因的優勢全基因組測序，基因表達調控機理比較清楚，遺傳操作簡便；具有原核細菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統；大規模發酵歷史悠久、技術成熟、工藝簡單、成本低廉；能將外源基因表達產物分泌至培養基中；不含有特異性的病毒、不產內毒素，美國FDA認定為安全的基因工程受體系統（GenerallyRecognizedAsSafe，GRAS）；酵母菌是最簡單的真核模式生物2011-10-2276目的基因在宿主中的表達2.酵母菌的宿主系統廣泛用于外源基因表達的酵母宿主菌提高重組蛋白表達產率的突變宿主菌抑制超糖基化作用的突變宿主菌減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌2011-10-2277目的基因在宿主中的表達目前已廣泛用于外源基因表達和研究的酵母菌包括：酵母屬：如釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）克魯維酵母屬：如乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces

lactis）畢赤酵母屬：如巴斯德畢赤酵母（Pichia

pastoris）裂殖酵母屬：如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）漢遜酵母屬：如多型漢遜酵母（Hansenulapolymorpha）其中釀酒酵母的遺傳學和分子生物學研究最為詳盡，但巴斯德畢赤酵母表達外源基因最理想。2.1廣泛用于外源基因表達的酵母宿主菌2011-10-2278目的基因在宿主中的表達能提高釀酒酵母中重組蛋白產量或改善其質量的突變類型突變類型

ssc1 ssc2 rgr1 ose1 ssc11 rho-

生物效應改善重組蛋白分泌提高重組蛋白表達提高重組蛋白表達 提高重組蛋白表達改善重組蛋白分泌 提高重組蛋白表達

作用位點鈣離子依賴型的ATP酶轉錄后加工轉錄水平 轉錄水平羧肽酶Y

轉錄水平2011-10-2279目的基因在宿主中的表達2.2提高重組蛋白表達產率的突變宿主菌mnnalgoch2.3抑制超糖基化作用的突變宿主菌酵母菌普遍擁有蛋白質的糖基化系統，但野生型釀酒酵母對異源蛋白的糖基化反應很難控制，呈超糖基化傾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。能抑制超糖基化的突變類型突變類型

生物效應甘露糖生物合成缺陷型天門冬酰胺側鏈糖基化缺陷型外側糖鏈添加缺陷型2011-10-2280目的基因在宿主中的表達許多真核生物的蛋白質在其天門冬酰胺側鏈上接有寡糖基團，它們常常影響蛋白質的生物活性。2.4減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌泛素降解途徑衰減的釀酒酵母UBI4缺陷型：在釀酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表達，UBI4缺陷突變株能正常生長，但細胞內游離泛素分子的濃度比野生株要低得多，因此UBI4缺陷突變株是外源基因表達理想的受體。UBA1缺陷型：UBA1編碼泛素激活酶E1，UBA1突變株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介導的蛋白降解。Ubc4-ubc5雙突變型：七個泛素連接酶基因的突變對衰減蛋白降解作用同樣有效。2011-10-2281目的基因在宿主中的表達3.酵母菌的載體系統酵母菌中的野生型質粒酵母菌克隆表達質粒的構建2011-10-2282目的基因在宿主中的表達3.1酵母菌中的野生型質粒（1）釀酒酵母中的2μ環狀質粒幾乎所有的釀酒酵母中都含有2μ雙鏈環狀質粒，拷貝數達50至100個。IRs反向重復序列，600bp，重組FLP編碼產物驅動IRs的同源重組REP編碼產物控制質粒的穩定性STBREP的結合位點接合酵母屬中的pSR1和pSB1，以及克魯維酵母屬中的pKD1等，均與2μ質粒類似。2011-10-2283目的基因在宿主中的表達（2）乳酸克魯維酵母中的線狀質粒乳酸克魯維酵母中含有兩種不同的雙鏈線狀質粒pGKL1和pGKL2。拷貝數為50-100個，分別攜帶K1K2兩種能使多種酵母菌致死的毒素蛋白編碼基因（αβγ），同時含有毒素蛋白抗性基因。2011-10-2284目的基因在宿主中的表達3.2酵母菌克隆表達質粒的構建（1）含有ARS的YRp質粒的構建

ARS為酵母菌中的自主復制序列，0.8-1.5kb，染色體上每30-40kb就有一個ARS元件。酵母菌自主復制型質粒的構建組成包括復制子、標記基因、提供克隆位點的大腸桿菌質粒DNA。以ARS為復制子的質粒稱為YRp以2μ質粒上的復制元件為復制子的質粒稱為YEp

上述兩類質粒在釀酒酵母中的拷貝數最高可達200個，但培養幾代后，質粒的丟失率高達50%-70%，主要是由于分配不均勻所致。2011-10-2285目的基因在宿主中的表達（2）含有CEN的YCp質粒的構建CEN為酵母菌染色體DNA上與染色體均勻分配有關的序列將CENDNA插入含ARS的質粒中，獲得的新載體稱為YCpYCp質粒具有較高的有絲分裂穩定性，但拷貝數只有1-5個。2011-10-2286目的基因在宿主中的表達（3）含有酵母菌染色體DNA同源序列的YIp質粒的構建在大腸桿菌質粒上組裝酵母菌染色體DNA特定序列和標記基因，構建出來的質粒稱為YIp。目的基因表達盒通常插在染色體DNA特定序列中。這樣，目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色體DNA區域。2011-10-2287目的基因在宿主中的表達4.酵母菌的轉化系統酵母菌的轉化程序轉化質粒在酵母細胞中的命運用于轉化子篩選的標記基因2011-10-2288目的基因在宿主中的表達4.1酵母菌的轉化程序（1）酵母菌原生質體轉化法早期酵母菌的轉化都采用在等滲緩沖液中穩定的原生質體轉化法，在Ca2+和PEG的存在下，轉化細胞可達原生質體總數的1-2%。但該程序操作周期長，而且轉化效率受到原生質再生率的嚴重制約。原生質體轉化法的一個顯著特點是，一個受體細胞可同時接納多個質粒分子，而且這種共轉化的原生質體占轉化子總數的25-33%。2011-10-2289目的基因在宿主中的表達（2）堿金屬離子介導的酵母菌完整細胞的轉化釀酒酵母的完整細胞經堿金屬離子（如Li+等）、PEG、熱休克處理后，也可高效吸收質粒DNA，而且具有下列特性：吸收線型DNA的能力明顯大于環狀DNA，兩者相差80倍；共轉化現象極為罕見。2011-10-2290目的基因在宿主中的表達（3）酵母菌電擊轉化法酵母菌原生質體和完整細胞均可在電擊條件下吸收質粒DNA。但在此過程中應避免使用PEG，它對受電擊的細胞具有較大的負作用。電擊轉化的優點是不依賴于受體細胞的遺傳特征及培養條件，適用范圍廣，而且轉化率可高達105/μgDNA。2011-10-2291目的基因在宿主中的表達4.2轉化質粒在酵母細胞中的命運單雙鏈DNA均可轉化酵母菌，但單鏈的轉化率是雙鏈的10-30倍含有復制子的單鏈質粒進入細胞后，能準確地轉化為雙鏈并復制不含復制子的單鏈質粒進入細胞后，能高效地同源整合入染色體這對于體內定點突變酵母基因組極為有利。克隆在YIp整合型質粒上的外源基因，如果含有受體細胞的染色體DNA的同源序列，會發生高頻同源整合，整合子占轉化子總數的50-80%。2011-10-2292目的基因在宿主中的表達4.3用于轉化子篩選的標記基因（1）營養缺陷型的互補基因用于酵母菌轉化子篩選的標記基因主要有營養缺陷型互補基因和顯性基因兩大類。營養缺陷型互補基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA（尿嘧啶

）、ADE（腺嘌呤）。

但對于多倍體酵母來說，篩選營養缺陷型的受體非常困難。2011-10-2293目的基因在宿主中的表達（2）顯性標記基因

顯性標記基因的編碼產物是毒性物質的抗性蛋白標記基因

aph cat dhfr cup1 suc2 ilv2

編碼產物

氨基糖苷轉移酶氯霉素乙酰轉移酶 二氫葉酸還原酶 銅離子螯合物蔗糖轉化酶乙酰乳糖合成酶

遺傳表型抗G418

抗氯霉素抗氨甲喋呤和磺胺耐受銅離子耐受高濃度蔗糖抗硫酰脲除草劑2011-10-2294目的基因在宿主中的表達5.酵母菌的表達系統酵母菌啟動子的可控性外源基因在酵母菌中表達的限制因素酵母菌表達系統的選擇2011-10-2295目的基因在宿主中的表達5.1酵母菌啟動子的可控性（1）溫度控制型啟動子pho4TS-PHO5啟動子釀酒酵母PHO5啟動子在培養基中游離磷酸鹽耗盡時才能打開；PHO4基因編碼產物是PHO5啟動子的正調控因子；PHO4溫度敏感型突變基因pho4TS的編碼產物在35℃時失活。因此，裝在pho4TS-PHO5啟動子下游的外源基因在35℃時關閉，23℃誘導表達。2011-10-2296目的基因在宿主中的表達（2）超誘導型啟動子釀酒酵母的半乳糖利用酶系由GAL1、GAL7和GAL10基因編碼。半乳糖誘導效果不明顯，基因基底水平表達半乳糖誘導時，GAL4高效表達，GAL1、GAL7、GAL10超高效表達2011-10-2297目的基因在宿主中的表達5.2外源基因在酵母菌中表達的限制因素外源基因穩態mRNA的濃度外源基因mRNA的翻譯活性酵母菌對密碼子的偏愛性在釀酒酵母中，高豐度的蛋白質（如甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脫氫酶ADH）中96%以上的氨基酸是由25個密碼子編碼的。2011-10-2298目的基因在宿主中的表達5.3酵母菌表達系統的選擇（1）釀酒酵母表達系統釀酒酵母的基因表達系統最為成熟，包括轉錄活性較高的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脫氫酶基因ADH所屬的啟動子等，多種重組外源蛋白獲得成功表達。釀酒酵母表達系統的最大問題在于其超糖基化能力，往往使得有些重組蛋白（如人血清白蛋白等）與受體細胞緊密結合，而不能大量分泌，這一缺陷可用非釀酒酵母型的表達系統來彌補。2011-10-2299目的基因在宿主中的表達（2）乳酸克魯維酵母表達系統乳酸克魯維酵母的雙鏈環狀質粒pKD1已被廣泛用作重組異源蛋白生產的高效表達穩定性載體，即便在無選擇壓力的條件下，也能穩定遺傳40代以上。乳酸克魯維酵母表達分泌型和非分泌型的重組蛋白，性能均優于釀酒酵母表達系統。2011-10-22100目的基因在宿主中的表達（3）巴斯德畢赤酵母表達系統巴斯德畢赤酵母是一種甲基營養菌，能在低廉的甲醇培養基中生長，甲醇可高效誘導甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達。由于巴斯德畢赤酵母沒有合適的自主復制型載體，所以外源基因的表達序列一般整合入受體的染色體DNA上。在此情況下，外源基因的高效表達在很大程度上取決于整合拷貝數的多寡。目前已有20余種具有經濟價值的重組蛋白在巴斯德畢赤酵母系統中獲得成功表達。2011-10-22101目的基因在宿主中的表達巴斯德畢赤酵母表達系統的三大優勢生長迅速乙醇氧化酶基因AOX1強啟動子表達具有可誘導性（4）多型漢遜酵母表達系統多型漢遜酵母也是一種甲基營養菌。其自主復制序列HARS已被克隆，并用于構建克隆表達載體，但與巴斯德畢赤酵母相似，這種載體在受體細胞有絲分裂時顯示出不穩定性。所不同的是，HARS質粒能高頻自發地整合在受體的染色體DNA上，甚至可以連續整合100多個拷貝，因此重組多型漢遜酵母的構建也是采取整合的策略。目前，包括乙型肝炎表面抗原在內的數種外源蛋白在該系統中獲得成功表達。2011-10-22102目的基因在宿主中的表達6.利用重組酵母生產乙肝疫苗由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一種嚴重的傳染病，每年約有200萬病人死亡，并有3億人成為HBV攜帶者，其中相當一部分人可能轉化為肝硬化或肝癌患者。目前對乙型肝炎病毒還沒有一種有效的治療藥物，因此高純度乙型疫苗的生產對預防病毒感染具有重大的社會效益，而利用重組酵母大規模生產乙型疫苗為其廣泛應用提供了可靠的保證。2011-10-22103目的基因在宿主中的表達6.1乙型肝炎病毒的結構與性質

乙肝病毒是一種蛋白包裹型的雙鏈DNA病毒，具有感染力的病毒顆粒呈球面狀，直徑為42nm，基因組僅為3.2kb。病毒顆粒的主要結構蛋白是病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化和非糖基化兩種形式。顆粒內的蛋白成份包括核心抗原（HBcAg）、病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝臟還能合成并釋放大量的22nm的空殼亞病毒顆粒，其免疫原性是未裝配的各種包裝蛋白組份的1000倍。包裝蛋白共有三種轉膜糖蛋白：S、M、L多肽。乙型肝炎病毒的結構2011-10-22104目的基因在宿主中的表達乙型肝炎病毒的包裝蛋白編碼基因ATGATGATGTAA108aa55aa226aapreS1preS2SS多肽226aaM多肽281aaL多肽399aa2011-10-22105目的基因在宿主中的表達

乙肝病毒在體外細胞培養基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫苗是從病毒攜帶者的肝細胞質膜上提取出來的。雖然這種質膜來源的疫苗具有較高的免疫原性，但由于原材料的限制難以大規模產業化。6.2傳統乙肝疫苗的制備2011-10-22106目的基因在宿主中的表達6.3產乙肝表面抗原的重組釀酒酵母

20世紀80年代開始選擇釀酒酵母表達重組HBsAg，主要工作包括將S多肽的編碼置于ADH1啟動子控制下，轉化子能表達出具有免疫活性的重組蛋白，它在細胞提取物中以球形脂蛋白顆粒的形式存在，平均顆粒直徑為22nm，其結構和形態均與慢性乙肝病毒攜帶者血清中的病毒顆粒相同。目前，由釀酒酵母生產的重組HBsAg顆粒已作為乙肝疫苗商品化重組產物的最終產量可達細胞總蛋白量的1%-2%。進一步的研究表明，M多肽和L多肽對S型疫苗具有顯著的增效作用，由三者（或兩者）構成的復合型乙肝疫苗還可以誘導那些對S抗原缺乏響應的人群的免疫反應。2011-10-22107目的基因在宿主中的表達6.4產乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母整合型重組巴斯德畢赤酵母的構建2011-10-22108目的基因在宿主中的表達重組巴斯德畢赤酵母的性能

由于巴斯德畢赤酵母染色體DNA上還擁有第二個乙醇氧化酶基因AOX2，所以整合型重組菌仍能在含有甲醇的培養基上生長。重組菌首先在含有甘油的培養基中培養，待甘油耗盡后，加入甲醇誘導HBsAg表達，最終S蛋白的產量可達細胞可溶性蛋白總量的3%在大規模的生產過程中，巴斯德畢赤酵母工程菌在一個240L的發酵罐中培養，最終可獲得90克22nm的HBsAg顆粒，足夠制成900萬份乙肝疫苗。2011-10-22109目的基因在宿主中的表達三、外源基因在哺乳動物細胞中的表達2011-10-22110目的基因在宿主中的表達高等哺乳動物基因工程高等哺乳動物轉基因技術

轉基因動物個體

哺乳動物遺傳性狀改良； 藥物篩選研究評價模型； 人體基因治療高等哺乳動物細胞基因表達技術

動物工程細胞

蛋白多肽物質大規模生產； 藥物篩選研究評價模型1.高等哺乳動物基因工程的基本概念2011-10-22111目的基因在宿主中的表達2.高等哺乳動物的受體系統高等哺乳動物細胞的生長特性高等哺乳動物受體細胞的條件高等哺乳動物受體細胞的遺傳標記常用的高等哺乳動物受體細胞2011-10-22112目的基因在宿主中的表達2.1高等哺乳動物細胞的生長特性正常的哺乳類動物細胞具有下列四大生物學特征：錨地依賴性：細胞必須附在固體上或固定的表面才能生長血清依賴性：細胞必須在具有生長因子的培養液中才能生長接觸抑制性：細胞與細胞接觸后，生長便受到抑制形態依賴性：細胞呈扁平狀，并有長纖維網狀結構上述特征使得正常的哺乳動物細胞在體外培養中，一般只能存活50代，且在培養皿上以平面的形式生長，即單層細胞生長。有時，正常細胞會改變某些特征而越過生理臨界點，繼續增殖并無限制分裂，這種狀態稱為細胞系形成，此時的細胞成為細胞系。2011-10-22113目的基因在宿主中的表達2.2高等哺乳動物受體細胞的條件高等哺乳動物受體細胞應具備下列條件細胞系特征：喪失細胞接觸抑制性和錨地依賴性特征，便于大規模培養遺傳穩定性：外源基因多次傳代后不會丟失，易于長期保存合適的標記：便于轉化株的篩選和維持生長快且齊：分裂周期短，生長均一，便于控制安全性能好：不合成致病物質，不致癌大多數正常的高等哺乳動物細胞并不能同時具備上述條件，癌細胞能滿足上述前四項要求，但在安全性能上有欠缺。2011-10-22114目的基因在宿主中的表達2.3高等哺乳動物受體細胞的遺傳標記2011-10-22115目的基因在宿主中的表達（1）營養缺陷型的哺乳動物受體細胞含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）編碼基因缺陷的受體細胞（tk-）

不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養基上（HAT培養基）生長，載體上的標記基因tk能與之遺傳互補。不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養基上（HAT培養基）生長，載體上的標記基因hprt與之遺傳互補。2011-10-22116目的基因在宿主中的表達含有次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶（HPRT）編碼基因缺陷的受體細胞（hprt-）（2）哺乳動物受體細胞常見的遺傳選擇標記遺傳標記

APH- DHFR HPH- TK-

編碼產物氨基糖苷磷酸轉移酶二氫葉酸還原酶潮霉素B磷酸轉移酶胸腺嘧啶核苷激酶

篩選藥物G418氨甲喋呤潮霉素B氨基喋呤

作用機理APH滅活G418DHFR變體抗氨甲喋呤HPH滅活潮霉素BTK合成TMPXGPRT-黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶霉酚酸XGPRT合成GMPADA-腺嘌呤核苷脫氨酶腺嘌呤木酮糖苷ADA滅活Xyl-A2011-10-22117目的基因在宿主中的表達2.4常用的高等哺乳動物受體細胞

迄今為止，用于醫療用品（藥物、抗體、診斷試劑）大規模生產的高等哺乳動物受體細胞主要是中國倉鼠卵巢細胞CHO），其優勢有如下幾個方面：遺傳背景清楚，生理代謝穩定與人的親緣關系接近，外源蛋白修飾準確基因轉移和載體表達系統完善耐受剪切力，便于大規模培養被美國FDA確認為安全的基因工程受體細胞（GRAS）2011-10-22118目的基因在宿主中的表達3.高等哺乳動物的載體系統人腺病毒DNA猴多瘤病毒DNA（SV40）人乳多瘤病毒DNA（BKV）人牛痘病毒DNA2011-10-22119目的基因在宿主中的表達3.1人腺病毒DNA（1）腺病毒的生物學特性腺病毒科為線狀雙鏈DNA病毒，無包膜，呈二十面體，共有93個成員，分哺乳動物腺病毒和禽腺病毒兩個屬。目前已鑒定的人腺病毒有6個亞屬，其中常用來構建載體的主要是C亞屬的2型（Ad2）和5型（Ad5）病毒。腺病毒感染人細胞時呈裂解型，不致癌；但對嚙齒目動物來說，絕大多數的腺病毒成員均能致癌。2011-10-22120目的基因在宿主中的表達（2）腺病毒的基因組DNA

腺病毒基因組DNA全長36kb，其包裝上限為原基因組的105%。DNA兩端各有一個反向重復序列（ITR）；E1-E4為早期基因，與病毒基因組的復制及晚期基因的表達調控有關，其中E3編碼晚期基因的調控因子；L1-L5為編碼病毒包裝蛋白的晚期基因；IVa2、VA均為病毒RNA聚合酶的亞基編碼基因。E3區缺失只會影響病毒顆粒的成熟，不影響基因組的復制功能，因而在構建載體時往往除去這個2.2kb的片段，使得載體的裝載量提高到4kb以上。2011-10-22121目的基因在宿主中的表達（3）腺病毒DNA載體的特點基因重排低：外源基因與病毒DNA重組后能穩定復制幾個周期安全性能好：不整合人的染色體DNA，不會導致惡性腫瘤宿主范圍廣：對受體細胞是否處于分裂期要求不嚴格使用效果好：外源基因在載體上容易高效表達2011-10-22122目的基因在宿主中的表達3.2猴多瘤病毒DNA（SV40）（1）SV40的生物學特性SV40屬于乳多瘤病毒科多瘤病毒屬，呈小型二十面體，由VP1、VP2、VP3三種衣殼蛋白包裝而成，基因組為5224bp的雙鏈環狀DNA。SV40可以與所有哺乳動物宿主細胞中的組蛋白H2、H3、H4結合，從而使其DNA形成類似核小體的微型染色體結構。SV40感染猴細胞時呈裂解型，不致癌；但感染嚙齒類動物后，便發生非同源整合而致癌。2011-10-22123目的基因在宿主中的表達

（2）SV40的基因組DNAt/T基因：編碼病毒的小抗原和大抗原，與病毒的致癌作用密切相關。高效表達外源蛋白：SV40在裂解宿主細胞前的晚期狀態時，每個宿主細胞含有105個病毒DNA拷貝，因此十分適合用于高效表達外源蛋白。2011-10-22124目的基因在宿主中的表達（3）SV40DNA-質粒DNA雜合載體的構建重組的SV40DNA分子必須經過包裝后才具有感染能力，因此插入的外源DNA片段不能太大。為了盡量提高SV40的裝載量，必須刪除一些基因片段，因此重組的SV40分子必須與野生型病毒共感染受體細胞，才能形成有感染力的重組病毒顆粒。pV2-GPT：是一種SV40DNA與大腸桿菌質粒DNA雜合的載體，其中gpt為細菌來源的谷氨酸-丙氨酸轉氨酶基因，用于篩選重組子。該載體曾被成功地用于在猴腎細胞中表達有生物活性的兔β-珠蛋白。2011-10-22125目的基因在宿主中的表達（4）利用SV40DNA載體表達外源基因的程序2011-10-22126目的基因在宿主中的表達（5）SV40DNA載體的特點基因表達好：外源基因能高效表達基因重排高：病毒基因組和重組分子常發生重排和缺失現象宿主范圍窄：只能轉染猴細胞裝載量較小2011-10-22127目的基因在宿主中的表達3.3人乳多瘤病毒DNA（BKV）（1）人乳多瘤病毒的生物學特性人乳多瘤病毒（BKV）屬于乳多瘤病毒科乳頭瘤病毒屬，其基因組為雙鏈DNA，感染宿主細胞后基因不發生整合，獨立于染色體而自主復制，每個宿主細胞最高可達500個拷貝。2011-10-22128目的基因在宿主中的表達（2）人乳多瘤病毒表達載體的構建刪除編碼病毒核心蛋白和外殼蛋白的基因，并與大腸桿菌質粒拼接，構成穿梭載體，它不能整合，同時也不能形成成熟的病毒顆粒裂解受體細胞。安裝細胞色素P450dioxin介導的增強子DRE，控制小鼠乳腺癌啟動子MMTP，由其啟動外源基因的表達。SV40來源的啟動子控制Neor標記基因，以G418篩選重組子。以此載體在人細胞系中表達β1-干擾素和單純皰疹病毒B蛋白獲得成功。2011-10-22129目的基因在宿主中的表達3.4人牛痘病毒DNA（1）人牛痘病毒的生物學特性

人牛痘病毒是一個大型DNA病毒，基因組長185kb，能在宿主細胞中自主復制。以前外源基因插在病毒基因組的非必需區內，構建出的重組病毒具有感染力，而且一經轉染，外源基因即可在最鄰近的病毒啟動子的控制下高效表達。然而由于牛痘病毒基因組較大，體外DNA重組很困難，因此通常采用體內重組的方式進行。2011-10-22130目的基因在宿主中的表達（2）人牛痘病毒DNA表達載體的構建

目前廣泛使用的牛痘病毒表達系統是一種預先構建好的重組病毒。其基因組上插入了一個可表達的大腸桿菌T7RNA聚合酶編碼基因。在外源基因導入受體細胞之前，先以上述的重組病毒感染細胞，使其大量表達T7RNA聚合酶，然后再將含有外源基因和T7啟動子的細菌型重組質粒導入哺乳動物受體細胞，此時外源基因整合在受體細胞染色體DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表達出重組蛋白。人囊狀纖維化基因就是采用這種策略高效表達的。2011-10-22131目的基因在宿主中的表達（3）利用人牛痘病毒載體表達外源基因的程序2011-10-22132目的基因在宿主中的表達4.高等哺乳動物的基因轉移哺乳動物細胞的物理轉化法哺乳動物細胞的病毒轉染法2011-10-22133目的基因在宿主中的表達4.1哺乳動物細胞的物理轉化法利用物理方法轉化高等哺乳動物細胞的主要優點是外源基因表達盒中不含任何病毒基因序列，這對外源基因表達產物的分離純化減輕了負擔。但外源基因表達盒進入受體細胞后，往往以多拷貝的形式隨機整合在染色體DNA上，易導致受體細胞基因滅活、外源基因不表達。2011-10-22134目的基因在宿主中的表達（1）磷酸鈣共沉淀法將待轉化的DNA溶解在磷酸緩沖液中，加入CaCl2溶液混勻，此時DNA被包裹在磷酸鈣晶體顆粒內；將上述制備的顆粒懸浮液滴入細胞培養皿中，37℃保溫4-16小時此時細胞膜形成吞噬泡，磷酸鈣晶體局部溶解膜結構，DNA便進入受體細胞；

棄去DNA溶液，加入新鮮培養基，繼續培養7天即可篩選轉化株。在外源DNA中摻入少量的受體細胞內源性DNA可以提高轉化效率。利用磷酸鈣共沉淀法轉化腫瘤病毒DNA，可使正常細胞轉化為癌細胞，這是人們對腫瘤發生機制的最早理解。2011-10-22135目的基因在宿主中的表達（2）電擊轉化法將待轉化的DNA溶解在受體細胞懸浮液中，然后加入電擊轉化儀的樣品槽內，兩端施加瞬時高壓電場，使細胞膜產生細小的縫隙，此時DNA片段便可不經過胞飲作用直接進入受體細胞。電擊轉化法常用于對磷酸鈣共沉淀法無效的細胞類型，如生長在懸浮液中的淋巴細胞等。2011-10-22136目的基因在宿主中的表達（3）脂質體介導法將待轉化的DNA溶解，與天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面活性劑的存在下形成包埋水相DNA的脂質體結構。將這種脂質體懸浮液加入到細胞培養液中，它便會與受體細胞膜融合，DNA隨即進入胞質和核內。利用上述程序曾將外源基因成功地導入了小鼠的淋巴細胞和HeLa細胞（子宮頸癌細胞）。2011-10-22137目的基因在宿主中的表達（4）顯微注射法通過激素療法使雌鼠超數排卵，并與雄性小鼠交配，然后殺死雌鼠，從其輸卵管內取出受精卵；借助于顯微鏡將純化的DNA溶液迅速注入到受精卵中變大了的雄性原核內。上述程序多用于動物個體的轉基因過程，由于必須單細胞逐一操作，所以不太適用于基因的克隆和表達。2011-10-22138目的基因在宿主中的表達（5）血影細胞介導法血影細胞是指哺乳動物的紅細胞在機械作用、病毒誘導、低滲環境下發生溶血，血紅蛋白大量溢出，最后形成僅被細胞膜包裹的細胞核結構。在溶血過程中，紅細胞膜的通透性大增，在血紅蛋白溢出的同時，外源DNA也容易進入。當上述外界條件消失后，紅細胞膜又可恢復原來的通透性。因此，可先將外源DNA轉入血影細胞，然后再將血影細胞與受體細胞在適當條件下發生融合，從而將外源DNA轉入受體細胞。2011-10-22139目的基因在宿主中的表達4.2哺乳動物細胞的病毒轉染法以病毒DNA為載體可以將外源基因直接轉染或與野生型病毒顆粒共轉染特定的受體細胞。這種方法具有定向性好、實驗重復性佳、導入效率高等優點，但也存在一定的缺陷，如目前常用的載體宿主范圍有限，往往無法轉染一些具有重要經濟價值的家禽和牲畜細胞等。2011-10-22140目的基因在宿主中的表達5.利用哺乳動物工程細胞生產重組蛋白哺乳動物細胞高效表達外源蛋白的基本原理利用哺乳動物工程細胞生產人源化的小鼠抗