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文檔簡介

第七章

目的基因在宿主中的表達(dá)2011-10-221目的基因在宿主中的表達(dá)外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)外源基因在酵母菌中的表達(dá)外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)外源基因在高等植物細(xì)胞中的表達(dá)2011-10-222目的基因在宿主中的表達(dá)緒:基因表達(dá)的關(guān)鍵因素1.轉(zhuǎn)錄起始(關(guān)鍵和限速步驟)轉(zhuǎn)錄宿主RNA聚合酶啟動(dòng)子2011-10-223目的基因在宿主中的表達(dá)2.mRNA的延伸與穩(wěn)定性非特異性終止:衰減子,抗終止序列正確終止轉(zhuǎn)錄:終止序列mRNA穩(wěn)定性與Poly(A)尾有關(guān)載體上添加Poly(A)摻入信號(hào)宿主RNase缺失,增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性2011-10-224目的基因在宿主中的表達(dá)強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄終止的必要性

外源基因在強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下表達(dá),容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象,即RNA聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的DNA序列,形成長短不一的mRNA混合物。過長轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會(huì)影響外源基因的表達(dá),其原因如下:轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長,RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子mRNA所需的時(shí)間就相應(yīng)增加,外源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降。如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或DNA功能區(qū)域,如選擇性標(biāo)記基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等,則RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其它生物功能,甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性。過長的mRNA往往會(huì)產(chǎn)生大量無用的蛋白質(zhì),增加工程菌無謂的能量消耗。更為嚴(yán)重的是,過長的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級(jí)結(jié)構(gòu),從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率。2011-10-225目的基因在宿主中的表達(dá)3.mRNA有效翻譯原核翻譯⑴AUG起始密碼子⑵SD序列:與16SrRNA互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn),該序列至少含有AGGAGG序列中的4個(gè)堿基⑶SD序列與ATG之間合適距離3-9bp⑷翻譯起始區(qū)間內(nèi)不形成明顯二級(jí)結(jié)構(gòu)(5)終止密碼子:UAA、UAG、UGA2011-10-226目的基因在宿主中的表達(dá)4.外源蛋白的穩(wěn)定性融合蛋白分泌蛋白表達(dá)系統(tǒng)包涵體表達(dá)系統(tǒng)使用蛋白水解酶基因缺陷型受體細(xì)胞2011-10-227目的基因在宿主中的表達(dá)5.目的基因的沉默1)位置效應(yīng)目的基因位于甲基化程度高,轉(zhuǎn)錄活性低的異染色質(zhì)上2)轉(zhuǎn)錄水平基因沉默啟動(dòng)子甲基化和外源基因的異染色質(zhì)化;

目的基因的重復(fù)序列可導(dǎo)致自身甲基化3)轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默

共抑制(cosuppression)是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默,指被整合的外源基因沉默的同時(shí),與其同源的內(nèi)源DNA的表達(dá)也受到抑制。2011-10-228目的基因在宿主中的表達(dá)一、外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)2011-10-229目的基因在宿主中的表達(dá)1.大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)全基因組測(cè)序,共有4405個(gè)開放閱讀框基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物2011-10-2210目的基因在宿主中的表達(dá)2.大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢(shì)缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素2011-10-2211目的基因在宿主中的表達(dá)3.外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的理論基礎(chǔ)啟動(dòng)子終止子核糖體結(jié)合位點(diǎn)密碼子質(zhì)粒拷貝數(shù)2011-10-2212目的基因在宿主中的表達(dá)3.1啟動(dòng)子目的基因(1)啟動(dòng)子最佳距離的探測(cè)AEE

目的基因EEA酶切開啟動(dòng)子

Bal31酶解2011-10-2213目的基因在宿主中的表達(dá)PλLPtrp(2)啟動(dòng)子的構(gòu)建啟動(dòng)子

PrecA

PtraA

Plac

Ptac-35區(qū)序列TTGACATTGATATAGACATTGACATTTACATTGACA

-10區(qū)序列GATACTTATAATTAATGTTTAACTTATAATTATAATPtac=3Ptrp=11Plac2011-10-2214目的基因在宿主中的表達(dá)(3)啟動(dòng)子的可控性:乳糖操縱子的啟動(dòng)子Plac野生型的Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一起,在沒有誘導(dǎo)物存在時(shí),整個(gè)操縱子處于基底水平表達(dá);誘導(dǎo)物可以使啟動(dòng)子Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄大幅提高。誘導(dǎo)作用2011-10-2215目的基因在宿主中的表達(dá)(3)啟動(dòng)子的可控性:乳糖操縱子的啟動(dòng)子Plac野生型的Plac上游附近擁有代謝激活因子(CAP)結(jié)合區(qū),cAMP激活CAP,cAMP-CAP復(fù)合物與DNA結(jié)合,改變DNA結(jié)構(gòu),促進(jìn)RNA聚合酶和啟動(dòng)子結(jié)合,使轉(zhuǎn)錄能力增強(qiáng)。葡萄糖代謝使cAMP減少,從而阻遏Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。因此,基因工程中使用的乳糖啟動(dòng)子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型,即PlacUV5。cAMP的正調(diào)控作用2011-10-2216目的基因在宿主中的表達(dá)(3)啟動(dòng)子的可控性:色氨酸啟動(dòng)子Ptrp的可控性色氨酸啟動(dòng)子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白復(fù)合物的阻遏,轉(zhuǎn)錄呈基底狀態(tài)。在培養(yǎng)系統(tǒng)中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸(IAA),便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的細(xì)菌培養(yǎng)體系中,除去色氨酸是困難的,因此基因工程中往往添加IAA誘導(dǎo)Ptrp介導(dǎo)的目基因的表達(dá)。2011-10-2217目的基因在宿主中的表達(dá)3.2終止子2011-10-2218目的基因在宿主中的表達(dá)

強(qiáng)終止子的選擇與使用

目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來自大腸桿菌

rRNA操縱子上的rrnT1T2以及T7噬菌體DNA上的Tφ。對(duì)于一些終止作用較弱的終止子,通??梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu),以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用。

終止子、啟動(dòng)子等,可以通過特殊的探針質(zhì)粒從細(xì)菌或噬菌體基因組DNA中克隆篩選。3.3核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS

外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的頻率,而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。大腸桿菌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)不同的mRNA分子具有不同的翻譯效率,它們之間的差別有時(shí)可高達(dá)數(shù)百倍。mRNA翻譯的起始效率主要由其5’端的結(jié)構(gòu)序列所決定,稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS,RibosomeBindingSite)2011-10-2219目的基因在宿主中的表達(dá)(1)核糖體結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)包括下列四個(gè)特征結(jié)構(gòu)要素:①位于翻譯起始密碼子上游的6-8個(gè)核苷酸序列5’UAAGGAGG3’:即Shine-Dalgarno(SD)序列,它通過識(shí)別大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3’端區(qū)域3’AUUCCUCC5’并與之專一性結(jié)合,將mRNA定位于核糖體上,從而啟動(dòng)翻譯。②翻譯起始密碼子:大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點(diǎn),但有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子。③SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成④基因編碼區(qū)5’端若干密碼子的堿基序列2011-10-2220目的基因在宿主中的表達(dá)(2)核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)的影響SD序列的影響:

一般來說,mRNA與核糖體的結(jié)合程度越強(qiáng),翻譯的起始效率就越高,而這種結(jié)合程度主要取決于SD序列與16SrRNA的堿基互補(bǔ)性,其中以GGAG四個(gè)堿基序列尤為重要。對(duì)多數(shù)基因而言,上述四個(gè)堿基中任何一個(gè)換成C或T,均會(huì)導(dǎo)致翻譯效率大幅度降低。2011-10-2221目的基因在宿主中的表達(dá)SD序列與起始密碼子之間的序列的影響:

SD序列下游的堿基若為AAAA或UUUU,翻譯效率最高;而CCCC或GGGG的翻譯效率則分別是最高值的50%和25%。緊鄰AUG的前三個(gè)堿基成份對(duì)翻譯起始也有影響,對(duì)于大腸桿菌β-半乳糖苷酶的mRNA而言,在這個(gè)位置上最佳的堿基組合是UAU或CUU,如果用UUC、UCA或AGG取代之,則酶的表達(dá)水平低20倍。2011-10-2222目的基因在宿主中的表達(dá)SD序列與起始密碼子之間的距離的影響:

SD序列與起始密碼子之間的精確距離保證了mRNA在核糖體上定位后,翻譯起始密碼子AUG正好處于核糖體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的P位,這是翻譯啟動(dòng)的前提條件。在很多情況下,SD序列位于AUG之前大約七個(gè)堿基處,在此間隔中少一個(gè)堿基或多一個(gè)堿基,均會(huì)導(dǎo)致翻譯起始效率不同程度的降低。2011-10-2223目的基因在宿主中的表達(dá)起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子的影響:

大腸桿菌中的起始tRNA分子可以同時(shí)識(shí)別AUG、GUG和UUG三種起始密碼子,但其識(shí)別頻率并不相同,通常GUG為AUG的50%而UUG只及AUG的25%。除此之外,從AUG開始的前幾個(gè)密碼子堿基序列也至關(guān)重要,至少這一序列不能與mRNA的5’端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu),否則便會(huì)嚴(yán)重干擾mRNA在核糖體上的準(zhǔn)確定位。

目前廣泛用于外源基因表達(dá)的大腸桿菌表達(dá)型質(zhì)粒上,均含有與啟動(dòng)子來源相同的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列,序列和間隔是最佳的。2011-10-2224目的基因在宿主中的表達(dá)3.4密碼子(1)生物體對(duì)密碼子的偏愛性

不同的生物,甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因,對(duì)簡并密碼子使用頻率并不相同,具有一定的偏愛性,其決定因素是: 密碼子與反密碼子相互作用的自由能:性中等強(qiáng)度規(guī)律如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少;如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多;細(xì)胞內(nèi)tRNA的含量生物基因組中的堿基含量:在富含AT的生物(如單鏈DNA噬菌體φX174)基因組中,密碼子第三位上的U和A出現(xiàn)的頻率較高;而在GC豐富的生物(如鏈霉菌)基因組中,第三位上含有G或C的簡并密碼子占90%以上的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。2011-10-2225目的基因在宿主中的表達(dá)CodonUsageDatabaseAspergillusoryzaeAspergillusnigerSaccharomycescerevisiaeEscherichiacoli

2011-10-2226目的基因在宿主中的表達(dá)(2)密碼子偏愛性對(duì)外源基因表達(dá)的影響由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程度的差異性,因此外源基因尤其是高等哺乳動(dòng)物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個(gè)重要因素是密碼子的正確選擇。一般而言,有兩種策略可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細(xì)胞中獲得最佳表達(dá):外源基因全合成同步表達(dá)相關(guān)tRNA編碼基因2011-10-2227目的基因在宿主中的表達(dá)外源基因全合成按照大腸桿菌密碼子的偏愛性規(guī)律,設(shè)計(jì)更換外源基因中不適宜的相應(yīng)簡并密碼子。重組人胰島素、干擾素以及生長激素在大腸桿菌中的高效表達(dá)均采用了這種方法。實(shí)驗(yàn)技術(shù):密碼子優(yōu)化http://genomes.urv.cat/CAIcal/OPTIMIZER

2011-10-2228目的基因在宿主中的表達(dá)同步表達(dá)相關(guān)tRNA編碼基因

對(duì)于那些含有不和諧密碼子種類單一、出現(xiàn)頻率較高、而本身分子量又較大的外源基因而言,則選擇相關(guān)tRNA編碼基因同步克隆表達(dá)的策略較為有利。

例如,在人尿激酶原cDNA的412個(gè)密碼子中,共含有22個(gè)精氨酸密碼子,其中7個(gè)AGG、2個(gè)AGA,而大腸桿菌受體細(xì)胞中tRNAAGG和tRNAAGA的豐度較低。為了提高人尿激酶原cDNA在大腸桿菌中的高效表達(dá),將大腸桿菌的這兩個(gè)tRNA編碼基因克隆在另一個(gè)高表達(dá)的質(zhì)粒上。由此構(gòu)建的大腸桿菌雙質(zhì)粒系統(tǒng)有效地解除了受體細(xì)胞對(duì)外源基因高效表達(dá)的制約作用。2011-10-2229目的基因在宿主中的表達(dá)3.5質(zhì)??截悢?shù)(1)質(zhì)??截悢?shù)對(duì)細(xì)菌生長代謝的影響

目前實(shí)驗(yàn)室里廣泛使用的表達(dá)型質(zhì)粒在每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中可達(dá)數(shù)百甚至上千個(gè)拷貝,質(zhì)粒的擴(kuò)增過程通常發(fā)生在受體細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長期內(nèi),而此時(shí)正是細(xì)菌生理代謝最旺盛的階段。質(zhì)粒分子的過度增殖以及其后目的基因的高效表達(dá)勢(shì)必會(huì)影響受體細(xì)胞的生長代謝,進(jìn)而導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因表達(dá)水平的下降。

解決上述難題的一種有效策略是將重組質(zhì)粒的擴(kuò)增納入可控制的軌道。2011-10-2230目的基因在宿主中的表達(dá)(2)質(zhì)粒擴(kuò)增時(shí)序的控制pCP3擁有一個(gè)溫度可誘導(dǎo)型的復(fù)制子,在28℃時(shí),每個(gè)細(xì)胞的質(zhì)粒拷貝數(shù)為60;在42℃時(shí),拷貝數(shù)迅速增至300-600。這是因?yàn)椋?2℃時(shí),受體細(xì)胞染色體上的CI基因表達(dá)的溫度敏感型阻遏蛋白失活,從而使受溫度調(diào)控的質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加。2011-10-2231目的基因在宿主中的表達(dá)4.大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略包涵體型異源蛋白的表達(dá)分泌型異源蛋白的表達(dá)融合型異源蛋白的表達(dá)寡聚型異源蛋白的表達(dá)整合型異源蛋白的表達(dá)蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建2011-10-2232目的基因在宿主中的表達(dá)4.1包涵體型異源蛋白的表達(dá)(1)包涵體及其性質(zhì)

在某些生長條件下,大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子,它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi),或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu),這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體(InclusionBodies,IB)。由高效表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質(zhì),后者在一般情況下以包涵體的形式存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。

除此之外,包涵體中還含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。2011-10-2233目的基因在宿主中的表達(dá)(2)以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn):能簡化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作包涵體的水難溶性及密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分,菌體經(jīng)超聲波裂解后,直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì)菌裂解物中分離出來。能在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定在形成包涵體之后,大腸桿菌的蛋白酶降解作用基本上對(duì)異源重組蛋白的穩(wěn)定性已構(gòu)不成威脅。2011-10-2234目的基因在宿主中的表達(dá)包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn):

以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性,必須通過有效的變性-復(fù)性操作,才能回收得到具有正確空間構(gòu)象的目標(biāo)蛋白,因此包涵體變性-復(fù)性操作的效率對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的收率至關(guān)重要。然而,這也是一個(gè)技術(shù)難題,尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中的Cys殘基數(shù)目較高時(shí),體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)停话悴怀^30%。2011-10-2235目的基因在宿主中的表達(dá)(3)以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的操作

如果未進(jìn)行特殊設(shè)計(jì)(如分泌型表達(dá)或融合型表達(dá)),外源基因在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白量占細(xì)胞總蛋白量20%以上時(shí),表達(dá)產(chǎn)物一般傾向于形成包涵體。因此,以包涵體形式表達(dá)目的基因操作的關(guān)鍵就是選擇高表達(dá)的載體。事實(shí)上,這種高表達(dá)率也是包涵體法的長處所在。2011-10-2236目的基因在宿主中的表達(dá)包涵體的溶解與變性:

包涵體的溶解與變性的主要任務(wù)是在人工條件下,拆開包涵體內(nèi)蛋白質(zhì)中錯(cuò)配的二硫鍵和次級(jí)鍵,使包涵體溶解并重新進(jìn)入復(fù)性途徑 。能有效促進(jìn)包涵體溶解變性的試劑和條件包括:(4)包涵體的變性-復(fù)性操作清洗劑:SDS、正十二醇肌氨酸。廉價(jià),但影響復(fù)性和純化促溶劑:鹽酸胍、尿素。前者昂貴,尿素便宜,但常被自發(fā)形成的氰酸鹽污染,后者能與多肽鏈中的氨基反應(yīng)?;旌先軇喝缒蛩嘏c醋酸、二甲亞砜等聯(lián)合使用,溶解力強(qiáng)。極端pH:廉價(jià),但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反應(yīng)。2011-10-2237目的基因在宿主中的表達(dá)包涵體的復(fù)性與重折疊(refolding):包涵體的復(fù)性與重折疊的主要任務(wù)是:將多肽鏈中被拆開的游離巰基重新折疊;通過次級(jí)鍵的形成使蛋白質(zhì)復(fù)性。包涵體復(fù)性操作的方法包括:一步稀釋法:蛋白復(fù)性與濃度無關(guān),但集聚與濃度關(guān)系很大。分段稀釋法:逐步降低變性劑的濃度,防止二次集聚的發(fā)生。試劑添加法:精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+。蛋白修飾法:氨基檸檬酸酐酰化,蛋白帶負(fù)電,抑制集聚。產(chǎn)物隔離法:將變性的蛋白分子固定化,避免其相互碰撞。分子伴侶法:GroEL、GroES、DnaK,固定化,共表達(dá)。2011-10-2238目的基因在宿主中的表達(dá)包涵體的復(fù)性與重折疊(refolding):二硫鍵形成

在包涵體變性體系中,始終存在著還原劑,使多肽鏈中的巰基保持還原狀態(tài),防止二硫鍵錯(cuò)配導(dǎo)致嚴(yán)重的集聚。在變性操作結(jié)束后,這些游離型的巰基必須重新配對(duì)形成二硫鍵,此時(shí)多肽鏈也重新發(fā)生折疊。形成二硫鍵的方式主要有:

化學(xué)氧化法(A):需要電子受體,最廉價(jià)的電子受體為空氣,二硫鍵形成是隨機(jī)的,僅適用于那些不含游離半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)的重折疊。 二硫鍵交換(B):需要還原型和氧化型谷胱甘肽(GSH和GSSG),二硫鍵形成相對(duì)特異,因此適用性較廣,重折疊效果好。2011-10-2239目的基因在宿主中的表達(dá)4.2分泌型異源蛋白的表達(dá)

在大腸桿菌中表達(dá)的異源蛋白按其在細(xì)胞中的定位可分為兩種形式:即以可溶性或不溶性(包涵體)狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中;或者通過運(yùn)輸或分泌方式定位于細(xì)胞周質(zhì),甚至穿過外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中。蛋白產(chǎn)物N端信號(hào)肽序列的存在是蛋白質(zhì)分泌的前提條件。2011-10-2240目的基因在宿主中的表達(dá)(1)以分泌形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)分泌表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn):目的蛋白穩(wěn)定性高重組人胰島素原若分泌到細(xì)胞周質(zhì)中,其穩(wěn)穩(wěn)定性大約是在細(xì)胞質(zhì)中的10倍。目的蛋白易于分離目的蛋白末端完整相當(dāng)多的真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸殘基。當(dāng)這些真核基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí),蛋白質(zhì)N端的甲硫氨酸殘基往往不能被切除。如若將外源基因與大腸桿菌的信號(hào)肽編碼序列重組在一起,一旦分泌型表達(dá),其N端的甲硫氨酸殘基便可在信號(hào)肽的剪切過程中被有效除去。2011-10-2241目的基因在宿主中的表達(dá)分泌表達(dá)形式的缺點(diǎn):

相對(duì)其它生物細(xì)胞而言,大腸桿菌的蛋白分泌機(jī)制并不健全。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表達(dá),少數(shù)外源基因既便能分泌表達(dá),其表達(dá)效率通常要比包涵體方式低很多,因此目前用于產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌盡管有,但并不普遍。2011-10-2242目的基因在宿主中的表達(dá)(2)蛋白質(zhì)的分泌機(jī)制原核細(xì)菌周質(zhì)中含有多種分子伴侶可阻止分泌蛋白的隨機(jī)折疊,分泌在細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中的重組蛋白很少形成分子間的二硫鍵交聯(lián),因此與包涵體相比,分泌型重組蛋白具有較高比例的正確構(gòu)象,生物活性的回收率增加,且對(duì)蛋白酶不敏感。2011-10-2243目的基因在宿主中的表達(dá)(3)分泌型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建

有些革蘭氏陰性菌的細(xì)菌素釋放蛋白,它激活定位于內(nèi)膜上的磷酸酯酶,導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)外膜的通透性增大。

因此,只要將細(xì)菌素釋放蛋白編碼基因克隆在一個(gè)合適的質(zhì)粒上,并轉(zhuǎn)化宿主菌,即可構(gòu)建完全分泌型的受體細(xì)胞。此時(shí),用另一種攜帶大腸桿菌信號(hào)肽編碼序列和目的基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化上述完全分泌型受體細(xì)胞,使用相同性質(zhì)的啟動(dòng)子介導(dǎo)目的基因的轉(zhuǎn)錄,則可實(shí)現(xiàn)目的蛋白從重組大腸桿菌中的完全分泌。2011-10-2244目的基因在宿主中的表達(dá)4.3融合型異源蛋白的表達(dá)

除了直接表達(dá)異源蛋白外,還可將外源基因與受體菌自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起,并作為一個(gè)開放閱讀框進(jìn)行表達(dá)。由這種雜合基因表達(dá)出的蛋白質(zhì)稱為融合蛋白。在這種融合蛋白結(jié)構(gòu)中,通常受體細(xì)菌的蛋白部分位于N端,異源蛋白位于C端。通過在DNA水平上人工設(shè)計(jì)引入蛋白酶切割位點(diǎn)或化學(xué)試劑特異性斷裂位點(diǎn),可以在體外從純化的融合蛋白分子中釋放異源蛋白。2011-10-2245目的基因在宿主中的表達(dá)(1)以融合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)目的蛋白穩(wěn)定性高:尤其對(duì)分子量較小的多肽效果更佳。目的蛋白易于分離:利用受體蛋白成熟的抗體、配體、底物進(jìn)行親和層析,可以快速獲得純度較高的融合蛋白。目的蛋白表達(dá)率高:與受體蛋白共用一套完善的表達(dá)元件。目的蛋白溶解性好:由于受體蛋白的存在,融合蛋白往往能在胞內(nèi)形成良好的空間構(gòu)象,且大多具有水溶性。目的蛋白需要回收:融合蛋白需要裂解和進(jìn)一步分離,才能獲得目的蛋白。在實(shí)際生產(chǎn)中,產(chǎn)品主要的成本往往就在該工段。2011-10-2246目的基因在宿主中的表達(dá)(2)融合型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建原則:受體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基因能高效表達(dá),且其表達(dá)產(chǎn)物可以通過親和層析進(jìn)行特異性簡單純化。外源基因應(yīng)裝在受體蛋白編碼基因的下游,為融合蛋白提供終止密碼子。在某些情況下,并不需要完整的受體結(jié)構(gòu)基因,目的是盡可能避免融合蛋白分子中兩種組份的分子量過于接近,為目的蛋白分離回收創(chuàng)造條件。兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因拼接位點(diǎn)處的序列設(shè)計(jì)十分重要,它直接決定著融合蛋白的裂解工藝。兩個(gè)蛋白編碼序列應(yīng)保持一致的翻譯閱讀框架。2011-10-2247目的基因在宿主中的表達(dá)用于融合蛋白構(gòu)建的受體蛋白:谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST):維持良好空間構(gòu)象麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP):促進(jìn)分泌金黃色葡萄球菌蛋白A(SAPA):免疫親和層析硫氧化還原蛋白(TrxA):維持良好空間構(gòu)象外膜蛋白(OmpF):促進(jìn)分泌β-半乳糖苷酶(LacZ):免疫親和層析泛素蛋白(Ubi):維持良好空間構(gòu)象2011-10-2248目的基因在宿主中的表達(dá)(3)目的蛋白的回收

融合蛋白中受體蛋白部分的存在可能會(huì)影響目的蛋白的空間構(gòu)象和生物活性,如果將之注入人體還會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng),因此在制備和生產(chǎn)藥用目的蛋白時(shí),將融合蛋白中的受體蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位點(diǎn)專一性斷裂方法有兩種:

化學(xué)斷裂法酶促裂解法2011-10-2249目的基因在宿主中的表達(dá)化學(xué)斷裂法:

用于蛋白位點(diǎn)專一性化學(xué)斷裂的最佳試劑為溴化氰(CNBr)。它與多肽鏈中的甲硫氨酸殘基側(cè)鏈的硫醚基反應(yīng),生成溴化亞氨內(nèi)酯,后者不穩(wěn)定,在水的作用下肽鍵斷裂,形成兩個(gè)多肽降解片段。其中上游肽段的甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)化為高絲氨酸殘基,而下游肽段N端的第一位氨基酸殘基保持不變。這一方法的優(yōu)點(diǎn)是回收率高(可達(dá)到85%以上),專一性強(qiáng),而且所產(chǎn)生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸,與真核生物細(xì)胞中的成熟表達(dá)產(chǎn)物較為接近。然而,如果異源蛋白分子內(nèi)部含有甲硫氨酸殘基,則不能用此方法。2011-10-2250目的基因在宿主中的表達(dá)酶促裂解法:單殘基位點(diǎn)

蛋白酶酶促裂解法的特點(diǎn)是斷裂效率更高,

同時(shí)每種蛋白酶均具有相應(yīng)的斷裂位點(diǎn)決定 簇,因此可供選擇的專一性斷裂位點(diǎn)范圍較 廣。幾種斷裂位點(diǎn)專一性最強(qiáng)的商品化蛋白 酶分別在多肽鏈中的精氨酸、谷氨酸、賴氨 酸殘基處切開酰胺鍵,形成不含上述殘基的 下游斷裂肽段,與溴化氰化學(xué)斷裂法相似。用上述蛋白酶裂解融合蛋白的前提條件是外源蛋白分子內(nèi)部不能含有精氨酸、谷氨酸、賴氨酸殘基,如果外源基因表達(dá)產(chǎn)物為小分子多肽,這一限制條件并不苛刻,但對(duì)大分子量的異源蛋白來說,上述三種氨基酸殘基的出現(xiàn)頻率是相當(dāng)高的。2011-10-2251目的基因在宿主中的表達(dá)酶促裂解法:多殘基位點(diǎn)

為了克服僅切單一氨基酸殘基的蛋白酶所帶來的應(yīng)用局限性,可在受體蛋白編碼序列與不含起始密碼子的外源基因之間加裝一段編碼寡肽序列(Ile-Glu-Gly-Arg)的人工接頭片段,該寡肽為具有蛋白酶活性的凝血因子Xa的識(shí)別和作用序列,其斷裂位點(diǎn)在Arg的C末端。純化后的融合蛋白用Xa處理,即可獲得不含上述寡肽序列的目的蛋白。由于Xa的識(shí)別作用序列由四個(gè)氨基酸殘基組成,大多數(shù)蛋白質(zhì)中出現(xiàn)這種寡肽序列的概率極少,因此這種方法可廣泛用于從融合蛋白中回收各種不同大小的目的蛋白產(chǎn)物。2011-10-2252目的基因在宿主中的表達(dá)ATCGAAGGTCGCGAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-1IleGluGlyArgGluATCGAAGGTCGCGAAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-2ATCGAAGGTCGCGAAAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-3NruIHindIIIPvuIIBamHIKpnIEcoRVBglIISmaINotIXa因子切割位點(diǎn)2011-10-2253目的基因在宿主中的表達(dá)4.4寡聚型異源蛋白的表達(dá)構(gòu)建串聯(lián)型異源蛋白表達(dá)載體,將多拷貝的外源基因克隆在一個(gè)低拷貝質(zhì)粒上,以取代單拷貝外源基因在高拷貝載體上表達(dá)的策略。2011-10-2254目的基因在宿主中的表達(dá)4.5整合型異源蛋白的表達(dá)整合型的目的基因隨受體細(xì)胞染色體DNA的復(fù)制而復(fù)制,在大多數(shù)情況下相當(dāng)穩(wěn)定,工程菌在沒有選擇壓力存在下可以連續(xù)培養(yǎng)而不丟失目的基因表達(dá)盒,這對(duì)以改良物種遺傳性狀為目的的基因工程案例特別有意義。2011-10-2255目的基因在宿主中的表達(dá)4.6蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建

無論是在真核生物還是在原核細(xì)胞中,重組目的蛋白表達(dá)后都會(huì)面臨被降解的命運(yùn),其穩(wěn)定性甚至還不如半衰期較短的受體細(xì)胞內(nèi)源性蛋白質(zhì)。

在大多數(shù)情況下,重組目的蛋白的不穩(wěn)定性可歸結(jié)為對(duì)受體細(xì)胞蛋白酶系統(tǒng)的敏感性。然而越來越多的實(shí)驗(yàn)表明,重組目的蛋白在受體細(xì)胞內(nèi)的半衰期可以通過蛋白序列的人工設(shè)計(jì)以及受體細(xì)胞的改造加以調(diào)整和控制。2011-10-2256目的基因在宿主中的表達(dá)5.基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對(duì)策基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略2011-10-2257目的基因在宿主中的表達(dá)5.1基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制(1)工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)形式基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性,這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式:結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性:重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾,導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失。分配不穩(wěn)定性:整個(gè)重組DNA分子從受體細(xì)胞中逃逸(curing)2011-10-2258目的基因在宿主中的表達(dá)(2)工程菌遺傳不穩(wěn)定性的產(chǎn)生機(jī)制受體細(xì)胞中的限制修飾系統(tǒng)對(duì)外源重組DNA分子的降解;外源基因的高效表達(dá)嚴(yán)重干擾受體細(xì)胞正常的生長代謝;能量、物質(zhì)的匱乏和外源基因表達(dá)產(chǎn)物的毒性誘導(dǎo)受體細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng):關(guān)閉合成途徑,啟動(dòng)降解程序;重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)的不均勻分配,這是重組質(zhì)粒逃逸的基本原因;受體細(xì)胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進(jìn)重組分子的缺失重排。2011-10-2259目的基因在宿主中的表達(dá)(3)重組質(zhì)粒的逃逸率

當(dāng)含有重組質(zhì)粒的工程菌在非選擇性條件下生長時(shí),培養(yǎng)系統(tǒng)中一部分細(xì)胞不再攜帶重組質(zhì)粒,這些空載細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)之比稱為稱為重組質(zhì)粒的宏觀逃逸率。重組質(zhì)粒逃逸的原因有:高溫培養(yǎng)、表面活性劑(SDS)、藥物(利福平)、染料(吖啶)促使重組質(zhì)粒滲漏;受體細(xì)胞中的核酸酶降解重組質(zhì)粒;重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)不均勻分配,細(xì)胞所含重組質(zhì)??截悢?shù)的差異隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增多而加劇。2011-10-2260目的基因在宿主中的表達(dá)5.2改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略(1)改進(jìn)載體受體系統(tǒng)以增大質(zhì)粒穩(wěn)定性為目的的構(gòu)建方法包括:將R1質(zhì)粒上的parB基因引入表達(dá)型載體中,其表達(dá)產(chǎn)物可以選擇性地殺死由于分配不均勻所產(chǎn)生的無質(zhì)粒細(xì)胞;正確設(shè)置載體上的多克隆位點(diǎn),禁止DNA片段插在非穩(wěn)定區(qū)內(nèi);2011-10-2261目的基因在宿主中的表達(dá)(2)施加選擇壓力根據(jù)載體上的抗藥性標(biāo)記,向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗生素。但注意,藥物和食品生產(chǎn)時(shí)禁止使用抗生素。根據(jù)載體上的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記,向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的營養(yǎng)組份。培養(yǎng)基復(fù)雜,成本較高。2011-10-2262目的基因在宿主中的表達(dá)(3)控制目的基因的過量表達(dá)2011-10-2263目的基因在宿主中的表達(dá)(4)優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)工藝使用可控型啟動(dòng)子控制目的基因的定時(shí)表達(dá)及表達(dá)程度;使用可控型復(fù)制子控制質(zhì)粒的定時(shí)增殖或降低質(zhì)粒的拷貝數(shù)。培養(yǎng)基組成:限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定;培養(yǎng)溫度:較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定。2011-10-22目的基因在宿主中的表達(dá)646.利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素1982年,美國ElyLiLi公司首先使用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素,成為世界上第一個(gè)上市的基因工程藥物。1987年,Novo公司推出了利用重組酵母菌生產(chǎn)人胰島素的新工藝。上述由基因工程菌合成的重組人胰島素在體外胰島素受體結(jié)合性能、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的應(yīng)答能力、降血糖作用、血漿藥代動(dòng)力學(xué)等指標(biāo)上均與天然胰島素沒有任何區(qū)別,而且還具有無免疫原性、注射吸收迅速等優(yōu)點(diǎn),充分展示了基因工程在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的巨大潛力。

2011-10-2265目的基因在宿主中的表達(dá)6.1A鏈和B鏈分別表達(dá)法基因工程菌的構(gòu)建策略:2011-10-2266目的基因在宿主中的表達(dá)表達(dá)產(chǎn)物的后處理路線:2011-10-2267目的基因在宿主中的表達(dá)生產(chǎn)技術(shù)的評(píng)價(jià):由于A鏈和B鏈上共存在六個(gè)半胱氨酸殘基,體外二硫鍵的正確配對(duì)率較低,通常只有10%-20%,因此采用這條工藝路線生產(chǎn)的重組人胰島素每克成本高達(dá)100美元以上。為了進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本,美國ElyLiLi公司隨后又建立了第二條生產(chǎn)重組人胰島素的工藝路線。

2011-10-2268目的基因在宿主中的表達(dá)6.2人胰島素原表達(dá)法基因工程菌的構(gòu)建策略:2011-10-2269目的基因在宿主中的表達(dá)表達(dá)產(chǎn)物的后處理路線:2011-10-2270目的基因在宿主中的表達(dá)生產(chǎn)技術(shù)的評(píng)價(jià):在人胰島素原表達(dá)工藝中,由于C肽的存在,胰島素原能形成良好的空間構(gòu)象,三對(duì)二硫鍵的正確配對(duì)率也相應(yīng)提高,折疊率高達(dá)80%以上。雖然這條工藝路線并不比AB鏈分別表達(dá)法更為簡捷,而且還要使用兩種高純度的酶制劑,但理想的折疊率在很大程度上彌補(bǔ)了工藝繁瑣的缺陷,使得每克最終產(chǎn)品的成本僅50美元。目前美國ElyLiLi公司采用此工藝年產(chǎn)十幾噸的重組人胰島素。2011-10-2271目的基因在宿主中的表達(dá)6.3A鏈和B鏈同時(shí)表達(dá)法2011-10-2272目的基因在宿主中的表達(dá)6.4分泌型重組人胰島素表達(dá)法上述三種重組大腸桿菌的構(gòu)建路線均采用胰島素或胰島素原編碼序列與大腸桿菌b-半乳糖苷酶基因拼接的方法,所產(chǎn)生的融合型重組蛋白表達(dá)率高、穩(wěn)定性強(qiáng),但不能分泌,只要以包涵體的形式存在于胞質(zhì)中。一種能促進(jìn)融合蛋白分泌的工程菌構(gòu)建策略是將胰島素或胰島素原編碼序列與b-內(nèi)酰胺酶基因拼接,b-內(nèi)酰胺酶通常能被大腸桿菌分泌到胞外。由此獲得的工程菌同時(shí)具備了穩(wěn)定高效表達(dá)可分泌型融合蛋白的優(yōu)良特性,為胰島素的后續(xù)分離純化工序減輕了負(fù)擔(dān)。2011-10-2273目的基因在宿主中的表達(dá)二、外源基因在酵母菌中的表達(dá)2011-10-2274目的基因在宿主中的表達(dá)1.酵母菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征1.1酵母菌的分類學(xué)特征

酵母菌(Yeast)是一群以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無性繁殖的單細(xì)胞真核生物,分屬于子囊菌綱(子囊酵母菌)、擔(dān)子菌綱(擔(dān)子酵母菌)、半知菌類(半知酵母菌),共由56個(gè)屬和500多個(gè)種組成。如果說大腸桿菌是外源基因最成熟的原核生物表達(dá)系統(tǒng),則酵母菌是最成熟的真核生物表達(dá)系統(tǒng)。2011-10-2275目的基因在宿主中的表達(dá)1.2酵母菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)全基因組測(cè)序,基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚,遺傳操作簡便;具有原核細(xì)菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng);大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡單、成本低廉;能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中;不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素,美國FDA認(rèn)定為安全的基因工程受體系統(tǒng)(GenerallyRecognizedAsSafe,GRAS);酵母菌是最簡單的真核模式生物2011-10-2276目的基因在宿主中的表達(dá)2.酵母菌的宿主系統(tǒng)廣泛用于外源基因表達(dá)的酵母宿主菌提高重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率的突變宿主菌抑制超糖基化作用的突變宿主菌減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌2011-10-2277目的基因在宿主中的表達(dá)目前已廣泛用于外源基因表達(dá)和研究的酵母菌包括:酵母屬:如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)克魯維酵母屬:如乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces

lactis)畢赤酵母屬:如巴斯德畢赤酵母(Pichia

pastoris)裂殖酵母屬:如非洲酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)漢遜酵母屬:如多型漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)其中釀酒酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究最為詳盡,但巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源基因最理想。2.1廣泛用于外源基因表達(dá)的酵母宿主菌2011-10-2278目的基因在宿主中的表達(dá)能提高釀酒酵母中重組蛋白產(chǎn)量或改善其質(zhì)量的突變類型突變類型

ssc1 ssc2 rgr1 ose1 ssc11 rho-

生物效應(yīng)改善重組蛋白分泌提高重組蛋白表達(dá)提高重組蛋白表達(dá) 提高重組蛋白表達(dá)改善重組蛋白分泌 提高重組蛋白表達(dá)

作用位點(diǎn)鈣離子依賴型的ATP酶轉(zhuǎn)錄后加工轉(zhuǎn)錄水平 轉(zhuǎn)錄水平羧肽酶Y

轉(zhuǎn)錄水平2011-10-2279目的基因在宿主中的表達(dá)2.2提高重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率的突變宿主菌mnnalgoch2.3抑制超糖基化作用的突變宿主菌酵母菌普遍擁有蛋白質(zhì)的糖基化系統(tǒng),但野生型釀酒酵母對(duì)異源蛋白的糖基化反應(yīng)很難控制,呈超糖基化傾向,因此超糖基化缺陷株非常重要。能抑制超糖基化的突變類型突變類型

生物效應(yīng)甘露糖生物合成缺陷型天門冬酰胺側(cè)鏈糖基化缺陷型外側(cè)糖鏈添加缺陷型2011-10-2280目的基因在宿主中的表達(dá)許多真核生物的蛋白質(zhì)在其天門冬酰胺側(cè)鏈上接有寡糖基團(tuán),它們常常影響蛋白質(zhì)的生物活性。2.4減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌泛素降解途徑衰減的釀酒酵母UBI4缺陷型:在釀酒酵母菌中,泛素主要由UBI4基因表達(dá),UBI4缺陷突變株能正常生長,但細(xì)胞內(nèi)游離泛素分子的濃度比野生株要低得多,因此UBI4缺陷突變株是外源基因表達(dá)理想的受體。UBA1缺陷型:UBA1編碼泛素激活酶E1,UBA1突變株是致死性的,但其等位基因缺陷是非致死性的,而且也能削弱泛素介導(dǎo)的蛋白降解。Ubc4-ubc5雙突變型:七個(gè)泛素連接酶基因的突變對(duì)衰減蛋白降解作用同樣有效。2011-10-2281目的基因在宿主中的表達(dá)3.酵母菌的載體系統(tǒng)酵母菌中的野生型質(zhì)粒酵母菌克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建2011-10-2282目的基因在宿主中的表達(dá)3.1酵母菌中的野生型質(zhì)粒(1)釀酒酵母中的2μ環(huán)狀質(zhì)粒幾乎所有的釀酒酵母中都含有2μ雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒,拷貝數(shù)達(dá)50至100個(gè)。IRs反向重復(fù)序列,600bp,重組FLP編碼產(chǎn)物驅(qū)動(dòng)IRs的同源重組REP編碼產(chǎn)物控制質(zhì)粒的穩(wěn)定性STBREP的結(jié)合位點(diǎn)接合酵母屬中的pSR1和pSB1,以及克魯維酵母屬中的pKD1等,均與2μ質(zhì)粒類似。2011-10-2283目的基因在宿主中的表達(dá)(2)乳酸克魯維酵母中的線狀質(zhì)粒乳酸克魯維酵母中含有兩種不同的雙鏈線狀質(zhì)粒pGKL1和pGKL2??截悢?shù)為50-100個(gè),分別攜帶K1K2兩種能使多種酵母菌致死的毒素蛋白編碼基因(αβγ),同時(shí)含有毒素蛋白抗性基因。2011-10-2284目的基因在宿主中的表達(dá)3.2酵母菌克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建(1)含有ARS的YRp質(zhì)粒的構(gòu)建

ARS為酵母菌中的自主復(fù)制序列,0.8-1.5kb,染色體上每30-40kb就有一個(gè)ARS元件。酵母菌自主復(fù)制型質(zhì)粒的構(gòu)建組成包括復(fù)制子、標(biāo)記基因、提供克隆位點(diǎn)的大腸桿菌質(zhì)粒DNA。以ARS為復(fù)制子的質(zhì)粒稱為YRp以2μ質(zhì)粒上的復(fù)制元件為復(fù)制子的質(zhì)粒稱為YEp

上述兩類質(zhì)粒在釀酒酵母中的拷貝數(shù)最高可達(dá)200個(gè),但培養(yǎng)幾代后,質(zhì)粒的丟失率高達(dá)50%-70%,主要是由于分配不均勻所致。2011-10-2285目的基因在宿主中的表達(dá)(2)含有CEN的YCp質(zhì)粒的構(gòu)建CEN為酵母菌染色體DNA上與染色體均勻分配有關(guān)的序列將CENDNA插入含ARS的質(zhì)粒中,獲得的新載體稱為YCpYCp質(zhì)粒具有較高的有絲分裂穩(wěn)定性,但拷貝數(shù)只有1-5個(gè)。2011-10-2286目的基因在宿主中的表達(dá)(3)含有酵母菌染色體DNA同源序列的YIp質(zhì)粒的構(gòu)建在大腸桿菌質(zhì)粒上組裝酵母菌染色體DNA特定序列和標(biāo)記基因,構(gòu)建出來的質(zhì)粒稱為YIp。目的基因表達(dá)盒通常插在染色體DNA特定序列中。這樣,目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色體DNA區(qū)域。2011-10-2287目的基因在宿主中的表達(dá)4.酵母菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)酵母菌的轉(zhuǎn)化程序轉(zhuǎn)化質(zhì)粒在酵母細(xì)胞中的命運(yùn)用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因2011-10-2288目的基因在宿主中的表達(dá)4.1酵母菌的轉(zhuǎn)化程序(1)酵母菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法早期酵母菌的轉(zhuǎn)化都采用在等滲緩沖液中穩(wěn)定的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法,在Ca2+和PEG的存在下,轉(zhuǎn)化細(xì)胞可達(dá)原生質(zhì)體總數(shù)的1-2%。但該程序操作周期長,而且轉(zhuǎn)化效率受到原生質(zhì)再生率的嚴(yán)重制約。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法的一個(gè)顯著特點(diǎn)是,一個(gè)受體細(xì)胞可同時(shí)接納多個(gè)質(zhì)粒分子,而且這種共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的25-33%。2011-10-2289目的基因在宿主中的表達(dá)(2)堿金屬離子介導(dǎo)的酵母菌完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化釀酒酵母的完整細(xì)胞經(jīng)堿金屬離子(如Li+等)、PEG、熱休克處理后,也可高效吸收質(zhì)粒DNA,而且具有下列特性:吸收線型DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA,兩者相差80倍;共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象極為罕見。2011-10-2290目的基因在宿主中的表達(dá)(3)酵母菌電擊轉(zhuǎn)化法酵母菌原生質(zhì)體和完整細(xì)胞均可在電擊條件下吸收質(zhì)粒DNA。但在此過程中應(yīng)避免使用PEG,它對(duì)受電擊的細(xì)胞具有較大的負(fù)作用。電擊轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)是不依賴于受體細(xì)胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件,適用范圍廣,而且轉(zhuǎn)化率可高達(dá)105/μgDNA。2011-10-2291目的基因在宿主中的表達(dá)4.2轉(zhuǎn)化質(zhì)粒在酵母細(xì)胞中的命運(yùn)單雙鏈DNA均可轉(zhuǎn)化酵母菌,但單鏈的轉(zhuǎn)化率是雙鏈的10-30倍含有復(fù)制子的單鏈質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后,能準(zhǔn)確地轉(zhuǎn)化為雙鏈并復(fù)制不含復(fù)制子的單鏈質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后,能高效地同源整合入染色體這對(duì)于體內(nèi)定點(diǎn)突變酵母基因組極為有利??寺≡赮Ip整合型質(zhì)粒上的外源基因,如果含有受體細(xì)胞的染色體DNA的同源序列,會(huì)發(fā)生高頻同源整合,整合子占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的50-80%。2011-10-2292目的基因在宿主中的表達(dá)4.3用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因(1)營養(yǎng)缺陷型的互補(bǔ)基因用于酵母菌轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因主要有營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因和顯性基因兩大類。營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因,如:LEU、TRP、HIS、LYS、URA(尿嘧啶

)、ADE(腺嘌呤)。

但對(duì)于多倍體酵母來說,篩選營養(yǎng)缺陷型的受體非常困難。2011-10-2293目的基因在宿主中的表達(dá)(2)顯性標(biāo)記基因

顯性標(biāo)記基因的編碼產(chǎn)物是毒性物質(zhì)的抗性蛋白標(biāo)記基因

aph cat dhfr cup1 suc2 ilv2

編碼產(chǎn)物

氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 二氫葉酸還原酶 銅離子螯合物蔗糖轉(zhuǎn)化酶乙酰乳糖合成酶

遺傳表型抗G418

抗氯霉素抗氨甲喋呤和磺胺耐受銅離子耐受高濃度蔗糖抗硫酰脲除草劑2011-10-2294目的基因在宿主中的表達(dá)5.酵母菌的表達(dá)系統(tǒng)酵母菌啟動(dòng)子的可控性外源基因在酵母菌中表達(dá)的限制因素酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇2011-10-2295目的基因在宿主中的表達(dá)5.1酵母菌啟動(dòng)子的可控性(1)溫度控制型啟動(dòng)子pho4TS-PHO5啟動(dòng)子釀酒酵母PHO5啟動(dòng)子在培養(yǎng)基中游離磷酸鹽耗盡時(shí)才能打開;PHO4基因編碼產(chǎn)物是PHO5啟動(dòng)子的正調(diào)控因子;PHO4溫度敏感型突變基因pho4TS的編碼產(chǎn)物在35℃時(shí)失活。因此,裝在pho4TS-PHO5啟動(dòng)子下游的外源基因在35℃時(shí)關(guān)閉,23℃誘導(dǎo)表達(dá)。2011-10-2296目的基因在宿主中的表達(dá)(2)超誘導(dǎo)型啟動(dòng)子釀酒酵母的半乳糖利用酶系由GAL1、GAL7和GAL10基因編碼。半乳糖誘導(dǎo)效果不明顯,基因基底水平表達(dá)半乳糖誘導(dǎo)時(shí),GAL4高效表達(dá),GAL1、GAL7、GAL10超高效表達(dá)2011-10-2297目的基因在宿主中的表達(dá)5.2外源基因在酵母菌中表達(dá)的限制因素外源基因穩(wěn)態(tài)mRNA的濃度外源基因mRNA的翻譯活性酵母菌對(duì)密碼子的偏愛性在釀酒酵母中,高豐度的蛋白質(zhì)(如甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脫氫酶ADH)中96%以上的氨基酸是由25個(gè)密碼子編碼的。2011-10-2298目的基因在宿主中的表達(dá)5.3酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇(1)釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)釀酒酵母的基因表達(dá)系統(tǒng)最為成熟,包括轉(zhuǎn)錄活性較高的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脫氫酶基因ADH所屬的啟動(dòng)子等,多種重組外源蛋白獲得成功表達(dá)。釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的最大問題在于其超糖基化能力,往往使得有些重組蛋白(如人血清白蛋白等)與受體細(xì)胞緊密結(jié)合,而不能大量分泌,這一缺陷可用非釀酒酵母型的表達(dá)系統(tǒng)來彌補(bǔ)。2011-10-2299目的基因在宿主中的表達(dá)(2)乳酸克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)乳酸克魯維酵母的雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒pKD1已被廣泛用作重組異源蛋白生產(chǎn)的高效表達(dá)穩(wěn)定性載體,即便在無選擇壓力的條件下,也能穩(wěn)定遺傳40代以上。乳酸克魯維酵母表達(dá)分泌型和非分泌型的重組蛋白,性能均優(yōu)于釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)。2011-10-22100目的基因在宿主中的表達(dá)(3)巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)巴斯德畢赤酵母是一種甲基營養(yǎng)菌,能在低廉的甲醇培養(yǎng)基中生長,甲醇可高效誘導(dǎo)甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達(dá)。由于巴斯德畢赤酵母沒有合適的自主復(fù)制型載體,所以外源基因的表達(dá)序列一般整合入受體的染色體DNA上。在此情況下,外源基因的高效表達(dá)在很大程度上取決于整合拷貝數(shù)的多寡。目前已有20余種具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重組蛋白在巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。2011-10-22101目的基因在宿主中的表達(dá)巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的三大優(yōu)勢(shì)生長迅速乙醇氧化酶基因AOX1強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)具有可誘導(dǎo)性(4)多型漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)多型漢遜酵母也是一種甲基營養(yǎng)菌。其自主復(fù)制序列HARS已被克隆,并用于構(gòu)建克隆表達(dá)載體,但與巴斯德畢赤酵母相似,這種載體在受體細(xì)胞有絲分裂時(shí)顯示出不穩(wěn)定性。所不同的是,HARS質(zhì)粒能高頻自發(fā)地整合在受體的染色體DNA上,甚至可以連續(xù)整合100多個(gè)拷貝,因此重組多型漢遜酵母的構(gòu)建也是采取整合的策略。目前,包括乙型肝炎表面抗原在內(nèi)的數(shù)種外源蛋白在該系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。2011-10-22102目的基因在宿主中的表達(dá)6.利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的急慢性乙型肝炎是一種嚴(yán)重的傳染病,每年約有200萬病人死亡,并有3億人成為HBV攜帶者,其中相當(dāng)一部分人可能轉(zhuǎn)化為肝硬化或肝癌患者。目前對(duì)乙型肝炎病毒還沒有一種有效的治療藥物,因此高純度乙型疫苗的生產(chǎn)對(duì)預(yù)防病毒感染具有重大的社會(huì)效益,而利用重組酵母大規(guī)模生產(chǎn)乙型疫苗為其廣泛應(yīng)用提供了可靠的保證。2011-10-22103目的基因在宿主中的表達(dá)6.1乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

乙肝病毒是一種蛋白包裹型的雙鏈DNA病毒,具有感染力的病毒顆粒呈球面狀,直徑為42nm,基因組僅為3.2kb。病毒顆粒的主要結(jié)構(gòu)蛋白是病毒的表面抗原多肽(HBsAg)或S多肽,它具有糖基化和非糖基化兩種形式。顆粒內(nèi)的蛋白成份包括核心抗原(HBcAg)、病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。除此之外,被乙肝病毒感染的人的肝臟還能合成并釋放大量的22nm的空殼亞病毒顆粒,其免疫原性是未裝配的各種包裝蛋白組份的1000倍。包裝蛋白共有三種轉(zhuǎn)膜糖蛋白:S、M、L多肽。乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)2011-10-22104目的基因在宿主中的表達(dá)乙型肝炎病毒的包裝蛋白編碼基因ATGATGATGTAA108aa55aa226aapreS1preS2SS多肽226aaM多肽281aaL多肽399aa2011-10-22105目的基因在宿主中的表達(dá)

乙肝病毒在體外細(xì)胞培養(yǎng)基中并不能繁殖,因此第一代的乙肝疫苗是從病毒攜帶者的肝細(xì)胞質(zhì)膜上提取出來的。雖然這種質(zhì)膜來源的疫苗具有較高的免疫原性,但由于原材料的限制難以大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。6.2傳統(tǒng)乙肝疫苗的制備2011-10-22106目的基因在宿主中的表達(dá)6.3產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母

20世紀(jì)80年代開始選擇釀酒酵母表達(dá)重組HBsAg,主要工作包括將S多肽的編碼置于ADH1啟動(dòng)子控制下,轉(zhuǎn)化子能表達(dá)出具有免疫活性的重組蛋白,它在細(xì)胞提取物中以球形脂蛋白顆粒的形式存在,平均顆粒直徑為22nm,其結(jié)構(gòu)和形態(tài)均與慢性乙肝病毒攜帶者血清中的病毒顆粒相同。目前,由釀酒酵母生產(chǎn)的重組HBsAg顆粒已作為乙肝疫苗商品化重組產(chǎn)物的最終產(chǎn)量可達(dá)細(xì)胞總蛋白量的1%-2%。進(jìn)一步的研究表明,M多肽和L多肽對(duì)S型疫苗具有顯著的增效作用,由三者(或兩者)構(gòu)成的復(fù)合型乙肝疫苗還可以誘導(dǎo)那些對(duì)S抗原缺乏響應(yīng)的人群的免疫反應(yīng)。2011-10-22107目的基因在宿主中的表達(dá)6.4產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母整合型重組巴斯德畢赤酵母的構(gòu)建2011-10-22108目的基因在宿主中的表達(dá)重組巴斯德畢赤酵母的性能

由于巴斯德畢赤酵母染色體DNA上還擁有第二個(gè)乙醇氧化酶基因AOX2,所以整合型重組菌仍能在含有甲醇的培養(yǎng)基上生長。重組菌首先在含有甘油的培養(yǎng)基中培養(yǎng),待甘油耗盡后,加入甲醇誘導(dǎo)HBsAg表達(dá),最終S蛋白的產(chǎn)量可達(dá)細(xì)胞可溶性蛋白總量的3%在大規(guī)模的生產(chǎn)過程中,巴斯德畢赤酵母工程菌在一個(gè)240L的發(fā)酵罐中培養(yǎng),最終可獲得90克22nm的HBsAg顆粒,足夠制成900萬份乙肝疫苗。2011-10-22109目的基因在宿主中的表達(dá)三、外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)2011-10-22110目的基因在宿主中的表達(dá)高等哺乳動(dòng)物基因工程高等哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物個(gè)體

哺乳動(dòng)物遺傳性狀改良; 藥物篩選研究評(píng)價(jià)模型; 人體基因治療高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)技術(shù)

動(dòng)物工程細(xì)胞

蛋白多肽物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn); 藥物篩選研究評(píng)價(jià)模型1.高等哺乳動(dòng)物基因工程的基本概念2011-10-22111目的基因在宿主中的表達(dá)2.高等哺乳動(dòng)物的受體系統(tǒng)高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長特性高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的條件高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記常用的高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞2011-10-22112目的基因在宿主中的表達(dá)2.1高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長特性正常的哺乳類動(dòng)物細(xì)胞具有下列四大生物學(xué)特征:錨地依賴性:細(xì)胞必須附在固體上或固定的表面才能生長血清依賴性:細(xì)胞必須在具有生長因子的培養(yǎng)液中才能生長接觸抑制性:細(xì)胞與細(xì)胞接觸后,生長便受到抑制形態(tài)依賴性:細(xì)胞呈扁平狀,并有長纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上述特征使得正常的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在體外培養(yǎng)中,一般只能存活50代,且在培養(yǎng)皿上以平面的形式生長,即單層細(xì)胞生長。有時(shí),正常細(xì)胞會(huì)改變某些特征而越過生理臨界點(diǎn),繼續(xù)增殖并無限制分裂,這種狀態(tài)稱為細(xì)胞系形成,此時(shí)的細(xì)胞成為細(xì)胞系。2011-10-22113目的基因在宿主中的表達(dá)2.2高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的條件高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞應(yīng)具備下列條件細(xì)胞系特征:喪失細(xì)胞接觸抑制性和錨地依賴性特征,便于大規(guī)模培養(yǎng)遺傳穩(wěn)定性:外源基因多次傳代后不會(huì)丟失,易于長期保存合適的標(biāo)記:便于轉(zhuǎn)化株的篩選和維持生長快且齊:分裂周期短,生長均一,便于控制安全性能好:不合成致病物質(zhì),不致癌大多數(shù)正常的高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞并不能同時(shí)具備上述條件,癌細(xì)胞能滿足上述前四項(xiàng)要求,但在安全性能上有欠缺。2011-10-22114目的基因在宿主中的表達(dá)2.3高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記2011-10-22115目的基因在宿主中的表達(dá)(1)營養(yǎng)缺陷型的哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞含有胸腺嘧啶核苷激酶(TK)編碼基因缺陷的受體細(xì)胞(tk-)

不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上(HAT培養(yǎng)基)生長,載體上的標(biāo)記基因tk能與之遺傳互補(bǔ)。不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上(HAT培養(yǎng)基)生長,載體上的標(biāo)記基因hprt與之遺傳互補(bǔ)。2011-10-22116目的基因在宿主中的表達(dá)含有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)編碼基因缺陷的受體細(xì)胞(hprt-)(2)哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞常見的遺傳選擇標(biāo)記遺傳標(biāo)記

APH- DHFR HPH- TK-

編碼產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶二氫葉酸還原酶潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶胸腺嘧啶核苷激酶

篩選藥物G418氨甲喋呤潮霉素B氨基喋呤

作用機(jī)理APH滅活G418DHFR變體抗氨甲喋呤HPH滅活潮霉素BTK合成TMPXGPRT-黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶霉酚酸XGPRT合成GMPADA-腺嘌呤核苷脫氨酶腺嘌呤木酮糖苷ADA滅活Xyl-A2011-10-22117目的基因在宿主中的表達(dá)2.4常用的高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞

迄今為止,用于醫(yī)療用品(藥物、抗體、診斷試劑)大規(guī)模生產(chǎn)的高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞主要是中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO),其優(yōu)勢(shì)有如下幾個(gè)方面:遺傳背景清楚,生理代謝穩(wěn)定與人的親緣關(guān)系接近,外源蛋白修飾準(zhǔn)確基因轉(zhuǎn)移和載體表達(dá)系統(tǒng)完善耐受剪切力,便于大規(guī)模培養(yǎng)被美國FDA確認(rèn)為安全的基因工程受體細(xì)胞(GRAS)2011-10-22118目的基因在宿主中的表達(dá)3.高等哺乳動(dòng)物的載體系統(tǒng)人腺病毒DNA猴多瘤病毒DNA(SV40)人乳多瘤病毒DNA(BKV)人牛痘病毒DNA2011-10-22119目的基因在宿主中的表達(dá)3.1人腺病毒DNA(1)腺病毒的生物學(xué)特性腺病毒科為線狀雙鏈DNA病毒,無包膜,呈二十面體,共有93個(gè)成員,分哺乳動(dòng)物腺病毒和禽腺病毒兩個(gè)屬。目前已鑒定的人腺病毒有6個(gè)亞屬,其中常用來構(gòu)建載體的主要是C亞屬的2型(Ad2)和5型(Ad5)病毒。腺病毒感染人細(xì)胞時(shí)呈裂解型,不致癌;但對(duì)嚙齒目動(dòng)物來說,絕大多數(shù)的腺病毒成員均能致癌。2011-10-22120目的基因在宿主中的表達(dá)(2)腺病毒的基因組DNA

腺病毒基因組DNA全長36kb,其包裝上限為原基因組的105%。DNA兩端各有一個(gè)反向重復(fù)序列(ITR);E1-E4為早期基因,與病毒基因組的復(fù)制及晚期基因的表達(dá)調(diào)控有關(guān),其中E3編碼晚期基因的調(diào)控因子;L1-L5為編碼病毒包裝蛋白的晚期基因;IVa2、VA均為病毒RNA聚合酶的亞基編碼基因。E3區(qū)缺失只會(huì)影響病毒顆粒的成熟,不影響基因組的復(fù)制功能,因而在構(gòu)建載體時(shí)往往除去這個(gè)2.2kb的片段,使得載體的裝載量提高到4kb以上。2011-10-22121目的基因在宿主中的表達(dá)(3)腺病毒DNA載體的特點(diǎn)基因重排低:外源基因與病毒DNA重組后能穩(wěn)定復(fù)制幾個(gè)周期安全性能好:不整合人的染色體DNA,不會(huì)導(dǎo)致惡性腫瘤宿主范圍廣:對(duì)受體細(xì)胞是否處于分裂期要求不嚴(yán)格使用效果好:外源基因在載體上容易高效表達(dá)2011-10-22122目的基因在宿主中的表達(dá)3.2猴多瘤病毒DNA(SV40)(1)SV40的生物學(xué)特性SV40屬于乳多瘤病毒科多瘤病毒屬,呈小型二十面體,由VP1、VP2、VP3三種衣殼蛋白包裝而成,基因組為5224bp的雙鏈環(huán)狀DNA。SV40可以與所有哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的組蛋白H2、H3、H4結(jié)合,從而使其DNA形成類似核小體的微型染色體結(jié)構(gòu)。SV40感染猴細(xì)胞時(shí)呈裂解型,不致癌;但感染嚙齒類動(dòng)物后,便發(fā)生非同源整合而致癌。2011-10-22123目的基因在宿主中的表達(dá)

(2)SV40的基因組DNAt/T基因:編碼病毒的小抗原和大抗原,與病毒的致癌作用密切相關(guān)。高效表達(dá)外源蛋白:SV40在裂解宿主細(xì)胞前的晚期狀態(tài)時(shí),每個(gè)宿主細(xì)胞含有105個(gè)病毒DNA拷貝,因此十分適合用于高效表達(dá)外源蛋白。2011-10-22124目的基因在宿主中的表達(dá)(3)SV40DNA-質(zhì)粒DNA雜合載體的構(gòu)建重組的SV40DNA分子必須經(jīng)過包裝后才具有感染能力,因此插入的外源DNA片段不能太大。為了盡量提高SV40的裝載量,必須刪除一些基因片段,因此重組的SV40分子必須與野生型病毒共感染受體細(xì)胞,才能形成有感染力的重組病毒顆粒。pV2-GPT:是一種SV40DNA與大腸桿菌質(zhì)粒DNA雜合的載體,其中g(shù)pt為細(xì)菌來源的谷氨酸-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因,用于篩選重組子。該載體曾被成功地用于在猴腎細(xì)胞中表達(dá)有生物活性的兔β-珠蛋白。2011-10-22125目的基因在宿主中的表達(dá)(4)利用SV40DNA載體表達(dá)外源基因的程序2011-10-22126目的基因在宿主中的表達(dá)(5)SV40DNA載體的特點(diǎn)基因表達(dá)好:外源基因能高效表達(dá)基因重排高:病毒基因組和重組分子常發(fā)生重排和缺失現(xiàn)象宿主范圍窄:只能轉(zhuǎn)染猴細(xì)胞裝載量較小2011-10-22127目的基因在宿主中的表達(dá)3.3人乳多瘤病毒DNA(BKV)(1)人乳多瘤病毒的生物學(xué)特性人乳多瘤病毒(BKV)屬于乳多瘤病毒科乳頭瘤病毒屬,其基因組為雙鏈DNA,感染宿主細(xì)胞后基因不發(fā)生整合,獨(dú)立于染色體而自主復(fù)制,每個(gè)宿主細(xì)胞最高可達(dá)500個(gè)拷貝。2011-10-22128目的基因在宿主中的表達(dá)(2)人乳多瘤病毒表達(dá)載體的構(gòu)建刪除編碼病毒核心蛋白和外殼蛋白的基因,并與大腸桿菌質(zhì)粒拼接,構(gòu)成穿梭載體,它不能整合,同時(shí)也不能形成成熟的病毒顆粒裂解受體細(xì)胞。安裝細(xì)胞色素P450dioxin介導(dǎo)的增強(qiáng)子DRE,控制小鼠乳腺癌啟動(dòng)子MMTP,由其啟動(dòng)外源基因的表達(dá)。SV40來源的啟動(dòng)子控制Neor標(biāo)記基因,以G418篩選重組子。以此載體在人細(xì)胞系中表達(dá)β1-干擾素和單純皰疹病毒B蛋白獲得成功。2011-10-22129目的基因在宿主中的表達(dá)3.4人牛痘病毒DNA(1)人牛痘病毒的生物學(xué)特性

人牛痘病毒是一個(gè)大型DNA病毒,基因組長185kb,能在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制。以前外源基因插在病毒基因組的非必需區(qū)內(nèi),構(gòu)建出的重組病毒具有感染力,而且一經(jīng)轉(zhuǎn)染,外源基因即可在最鄰近的病毒啟動(dòng)子的控制下高效表達(dá)。然而由于牛痘病毒基因組較大,體外DNA重組很困難,因此通常采用體內(nèi)重組的方式進(jìn)行。2011-10-22130目的基因在宿主中的表達(dá)(2)人牛痘病毒DNA表達(dá)載體的構(gòu)建

目前廣泛使用的牛痘病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種預(yù)先構(gòu)建好的重組病毒。其基因組上插入了一個(gè)可表達(dá)的大腸桿菌T7RNA聚合酶編碼基因。在外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞之前,先以上述的重組病毒感染細(xì)胞,使其大量表達(dá)T7RNA聚合酶,然后再將含有外源基因和T7啟動(dòng)子的細(xì)菌型重組質(zhì)粒導(dǎo)入哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞,此時(shí)外源基因整合在受體細(xì)胞染色體DNA上,并在T7RNA聚合酶的作用下表達(dá)出重組蛋白。人囊狀纖維化基因就是采用這種策略高效表達(dá)的。2011-10-22131目的基因在宿主中的表達(dá)(3)利用人牛痘病毒載體表達(dá)外源基因的程序2011-10-22132目的基因在宿主中的表達(dá)4.高等哺乳動(dòng)物的基因轉(zhuǎn)移哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)染法2011-10-22133目的基因在宿主中的表達(dá)4.1哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法利用物理方法轉(zhuǎn)化高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的主要優(yōu)點(diǎn)是外源基因表達(dá)盒中不含任何病毒基因序列,這對(duì)外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化減輕了負(fù)擔(dān)。但外源基因表達(dá)盒進(jìn)入受體細(xì)胞后,往往以多拷貝的形式隨機(jī)整合在染色體DNA上,易導(dǎo)致受體細(xì)胞基因滅活、外源基因不表達(dá)。2011-10-22134目的基因在宿主中的表達(dá)(1)磷酸鈣共沉淀法將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解在磷酸緩沖液中,加入CaCl2溶液混勻,此時(shí)DNA被包裹在磷酸鈣晶體顆粒內(nèi);將上述制備的顆粒懸浮液滴入細(xì)胞培養(yǎng)皿中,37℃保溫4-16小時(shí)此時(shí)細(xì)胞膜形成吞噬泡,磷酸鈣晶體局部溶解膜結(jié)構(gòu),DNA便進(jìn)入受體細(xì)胞;

棄去DNA溶液,加入新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)7天即可篩選轉(zhuǎn)化株。在外源DNA中摻入少量的受體細(xì)胞內(nèi)源性DNA可以提高轉(zhuǎn)化效率。利用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)化腫瘤病毒DNA,可使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞,這是人們對(duì)腫瘤發(fā)生機(jī)制的最早理解。2011-10-22135目的基因在宿主中的表達(dá)(2)電擊轉(zhuǎn)化法將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解在受體細(xì)胞懸浮液中,然后加入電擊轉(zhuǎn)化儀的樣品槽內(nèi),兩端施加瞬時(shí)高壓電場,使細(xì)胞膜產(chǎn)生細(xì)小的縫隙,此時(shí)DNA片段便可不經(jīng)過胞飲作用直接進(jìn)入受體細(xì)胞。電擊轉(zhuǎn)化法常用于對(duì)磷酸鈣共沉淀法無效的細(xì)胞類型,如生長在懸浮液中的淋巴細(xì)胞等。2011-10-22136目的基因在宿主中的表達(dá)(3)脂質(zhì)體介導(dǎo)法將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解,與天然或人工合成的磷脂混合,后者在表面活性劑的存在下形成包埋水相DNA的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。將這種脂質(zhì)體懸浮液加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中,它便會(huì)與受體細(xì)胞膜融合,DNA隨即進(jìn)入胞質(zhì)和核內(nèi)。利用上述程序曾將外源基因成功地導(dǎo)入了小鼠的淋巴細(xì)胞和HeLa細(xì)胞(子宮頸癌細(xì)胞)。2011-10-22137目的基因在宿主中的表達(dá)(4)顯微注射法通過激素療法使雌鼠超數(shù)排卵,并與雄性小鼠交配,然后殺死雌鼠,從其輸卵管內(nèi)取出受精卵;借助于顯微鏡將純化的DNA溶液迅速注入到受精卵中變大了的雄性原核內(nèi)。上述程序多用于動(dòng)物個(gè)體的轉(zhuǎn)基因過程,由于必須單細(xì)胞逐一操作,所以不太適用于基因的克隆和表達(dá)。2011-10-22138目的基因在宿主中的表達(dá)(5)血影細(xì)胞介導(dǎo)法血影細(xì)胞是指哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞在機(jī)械作用、病毒誘導(dǎo)、低滲環(huán)境下發(fā)生溶血,血紅蛋白大量溢出,最后形成僅被細(xì)胞膜包裹的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)。在溶血過程中,紅細(xì)胞膜的通透性大增,在血紅蛋白溢出的同時(shí),外源DNA也容易進(jìn)入。當(dāng)上述外界條件消失后,紅細(xì)胞膜又可恢復(fù)原來的通透性。因此,可先將外源DNA轉(zhuǎn)入血影細(xì)胞,然后再將血影細(xì)胞與受體細(xì)胞在適當(dāng)條件下發(fā)生融合,從而將外源DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。2011-10-22139目的基因在宿主中的表達(dá)4.2哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)染法以病毒DNA為載體可以將外源基因直接轉(zhuǎn)染或與野生型病毒顆粒共轉(zhuǎn)染特定的受體細(xì)胞。這種方法具有定向性好、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性佳、導(dǎo)入效率高等優(yōu)點(diǎn),但也存在一定的缺陷,如目前常用的載體宿主范圍有限,往往無法轉(zhuǎn)染一些具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的家禽和牲畜細(xì)胞等。2011-10-22140目的基因在宿主中的表達(dá)5.利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗

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