姜黃素對馬兜鈴酸誘發(fā)的膀胱腫瘤的預防作用【摘要】目的以馬兜鈴酸誘發(fā)的膀胱癌為模型，觀察姜黃素對膀胱組織的病理變化、ras蛋白和p53蛋白及細胞角質(zhì)蛋白20〔k20〕的變化，評價姜黃素對馬兜鈴酸誘導膀胱癌的化學預防作用及發(fā)活力制。方法50只大鼠隨機分為對照組、誘癌組、預防組三組。誘癌組：給予10g〔kg·d〕馬兜鈴酸給大鼠灌胃,連續(xù)誘癌3個月；預防組：在誘癌的同時給予含2%姜黃素粉的飼料進展化學防護；對照組：為正常飲食和飲水。3個月后宰殺全部大鼠，取膀胱組織進展he染色顯微鏡下觀察病理變化，用免疫組化染色技術(shù)檢測膀胱組織內(nèi)ras、p53蛋白的變化，熒光定量pr技術(shù)檢測k20rna。結(jié)果經(jīng)3個月誘癌，膀胱癌的發(fā)生率在誘癌組為95%(19／20)，而姜黃素預防組，膀胱癌的發(fā)生率僅為10%〔2/20〕，對照組膀胱黏膜組織ras、p53蛋白及k20rna均呈陰性表達，預防組及誘癌組膀胱黏膜組織ras、p53蛋白及k20rna均呈陽性，且以誘癌組更明顯，差異具有統(tǒng)計學意義〔p0.001〕。結(jié)論姜黃素對馬兜鈴酸誘導的膀胱癌具有良好的化學預防作用，可能分子機制與抑制ras、p53蛋白的過度表達才能有關(guān)。姜黃素有望成為一種有應用前景的膀胱癌預防藥物。【關(guān)鍵詞】姜黃素;馬兜鈴酸;膀胱癌;預防作用preventiveeffetsfuruininratbladderturinduedbyaristlhiaidkeyrds：uruin;aristlhiaid;bladdertur;preventingeffet眾多的細胞實驗和動物試驗證實姜黃素具有確切的抗癌活性，并具有抗癌譜廣、毒副作用小的特點，是一種具有開發(fā)和應用前景的腫瘤預防和治療新藥[1，2]。馬兜鈴酸(aristlhiaid,aa)主要從馬兜鈴酸屬植物細辛屬植物中提取出來,具有鎮(zhèn)痛、消炎、祛痰、利尿、調(diào)節(jié)血壓、抗生育活性等作用以及可預防化、放療引起的白細胞減少，因此在臨床上得到了廣泛的應用。然而,在使用過程中,發(fā)現(xiàn)含有馬兜鈴酸的藥物常并發(fā)泌尿系腫瘤,使得馬兜鈴酸的致癌性成了一個新的研究熱點[3]。本研究利用馬兜鈴酸誘導膀胱癌，應用2%姜黃素粉飼料對大鼠誘發(fā)的膀胱癌進展化學防護，觀察姜黃素對馬兜鈴酸誘導膀胱癌的化學預防效果，為尋找馬兜鈴酸誘導膀胱癌的化學預防藥物提供根底性資料。1材料與方法1.2動物模型選用6周齡的清潔級istar大鼠50只，體重170～210g。分為對照組(10只)、誘癌組(20只)、姜黃素預防組(20只)。誘癌組給予10g〔kg·d〕馬兜鈴酸給大鼠灌胃,連續(xù)灌胃誘癌3個月；預防組，同樣給予10g〔kg·d〕馬兜鈴酸給大鼠灌胃,連續(xù)灌胃誘癌3個月，誘癌同時給予含2%姜黃素粉的飼料進展化學防護。對照組為正常飲食和飲水。動物飼養(yǎng)在武漢大學附屬第一醫(yī)院spf動物實驗室。于３月末宰殺各組所有大鼠，統(tǒng)計大鼠膀胱癌發(fā)生率。1.3組織取材宰殺的大鼠迅速取膀胱組織。迅速把部分膀胱組織凍存于液氮罐中，儲存?zhèn)溆?。剩余的膀胱組織切成大小約為1×1×0.5,4%多聚甲醛固定20～24h。he染色顯微鏡下觀察膀胱組織的病理變化。1.4免疫組化染色每例膀胱組織分別取6點，根據(jù)sp系列試劑盒說明進展ras、p53蛋白免疫組化染色。陰性對照的一抗用pbs代替，陽性對照用己知陽性片進展染色。每張切片均觀察整體染色情況，選擇5個有代表性的區(qū)域，每區(qū)計數(shù)200個細胞。統(tǒng)計每1000個細胞中的陽性細胞數(shù)，計算陽性細胞率。陽性細胞數(shù)≤10%為陰性，11%～30%為弱陽性，31%～50%為陽性，50%為強陽性。ras蛋白在胞漿，呈黃色；p53蛋白在胞核，呈棕褐色。2結(jié)果2.1不同處理組之間腫瘤形成的差異如圖1所示，經(jīng)3個月誘癌，膀胱癌的發(fā)生率在誘癌組為95%(19／20)；而姜黃素預防組，膀胱癌的發(fā)生率僅為10.0%〔2/20〕，不典型增生的發(fā)生率為20%〔4/20〕，顯示姜黃素具有良好的化學防護作用。2.2姜黃素對p53、ras基因蛋白的影響10例對照組膀胱黏膜組織ras、p53基因蛋白表達均呈陰性。20例預防組及20例誘癌組的大鼠膀胱黏膜組織ras、p53基因蛋白均呈陽性，且以誘癌組更明顯，具有明顯統(tǒng)計學意義〔p0.001〕，見表1、2，圖1d～i。2.3不同組別k20表達程度的比較3討論姜黃是一種多年生草本植物，其藥用部分為根莖。姜黃素是其中的主要活性成分，生活中可作為調(diào)料和食物染色劑。同時姜黃素藥理作用廣，具有抗炎、抗氧化、抗凝、降血脂等作用，ra等[4]報道2000pp的姜黃素能明顯抑制氧化偶氮甲烷(a)誘導的f344鼠的大腸癌。2%的姜黃根粉也可抑制化學誘癌劑誘發(fā)的皮膚癌和胃癌[5]。最近，孫明等[6]報道了姜黃素對膀胱癌ej細胞的抑制作用。同時，姜黃素毒性很低，沃興德等[7]進展了長期毒性試驗，高劑量500g(kg·d)，連續(xù)80天，動物各項檢測指標未見異常。同時用人一次口服劑量的600倍對大鼠進展最大耐受量試驗，動物未見任表1姜黃素對各組p53基因蛋白的影響:p0.001何不良反響。huang等[8]報道了姜黃素的一期臨床試驗結(jié)果，8000g/d,連續(xù)口服3個月，自愿者未發(fā)現(xiàn)不良反響。因此姜黃素是一種較理想的膀胱癌化學預防藥物的候選者。直接把腫瘤發(fā)病率降低作為臨床化學預防試驗的終點指標是不實在際的。隨著對腫瘤發(fā)生、開展過程中的分子和表型改變的進一步理解，采用中間生物標記物(interedialbiaker)來反映腫瘤的發(fā)生開展情況是評價化學預防效果的重要指標之一[12]。理想的中間生物標志物應滿足以下條件:〔1〕與腫瘤的發(fā)生、開展親密相關(guān)，能反映腫瘤各個階段特征性的變化;〔2〕容易檢測，特別是在早期就能檢測到它的變化:〔3〕其變化與預防劑的調(diào)控作用相關(guān)。一些指標如增殖、分化信號(如肌動蛋白、vientin)和基因/調(diào)節(jié)的改變(如凋亡、癌基因或抑癌基因的表達)常被用做中間生物指標，評價藥物的預防作用[13]。本文采用ras、p53基因蛋白及k20作為姜黃素臨床化學預防試驗的終點指標，評價姜黃素對馬兜鈴酸誘導的膀胱癌的化學預防作用，指導治療，提供馬兜鈴酸誘導膀胱癌的化學預防藥物的根底性資料?！緟⒖嘉墨I】[2]aggaralbb,kuara,bhartia.antianerptentialfuruin:prelinialandlinialstudies[j].antianerres,2022,23(1a):363.[7]沃興德，洪行球，高承