實驗十五MTT法測定聚乙烯亞胺(PEI)的細胞毒性實驗導讀毒性是外來化合物對機體造成損害的能力。外來化合物是指存在于外界環境中，可能與機體接觸并進入機體的一些化學物質。外來化合物并非機體的組成成分，也非機體所需的營養物質，而且也不是維持機體正常生理功能和生命所必需的物質，但它們可由外界環境通過一定的環節和途徑與機體接觸并進入機體，在機體內呈現一定的生物學作用。常見的外來化合物有農用化學品、工業化學品、藥物、食物添加劑、日用化學品、各種環境污染物及霉菌毒素雀毒性較高的物質，只要相對較小的數量，就可對機體造成一定的損害；而毒性較低的物質，則需要較多的數量，才呈現毒性。物質毒性的高低僅具有相對意義。在一定意義上，只要達到一定數量，任何物質對機體都具有毒性；在一般情況下，如果低于一定數量，任何物質都不具備毒性；關鍵是此種物質與機體接觸的量。除物質與機體接觸的數量外，還與物質本身的理化性質以及其與機體接觸的途徑有關。以目前的技術手段在體外很難全面監控化學物質引起的全身效應，因此大多數試驗都是測定細胞水平的效應，即細胞毒性(cytotoxicity)o這些試驗簡化了化學物質針對的對象，體外的細胞實驗又缺乏神經和體液的調節，因此只是一定程度的近似，但是細胞水平的實驗經濟、易于量化而且重現性高，所以被廣泛應用。將化學物質加入到處于指數生長期的細胞中共孵育一段時間，然后將化學物質換成正常培養液繼續培養，讓細胞再增殖2-3個群體倍增時間，這樣就可以把能夠增殖的存活細胞和那些被化學物質毒性損傷后不能增殖的存活細胞區別開來，然后用MTT染料還原反應測定存活細胞的數目，這樣，就能檢測化學物質對細胞造成的損傷。聚乙烯亞胺(PEI)是一種聚陽離子材料，廣泛應用于基因轉染實驗，其在細胞中的轉染效率依賴于分子量的大小，一般來說，分子量高于25KD時，PEI具有很高的細胞轉染效率，但細胞毒性也較高，相反，分子量低于2KD時，PEI幾乎沒有轉染效率，但毒性也比較低。本實驗通過兩種不同分子量的PEI(25KD和600)在Cos7細胞株進行細胞毒性實驗，以比較兩種材料的細胞毒性。、實驗目的掌握細胞毒性測試的原理熟悉細胞毒性測試的方法二、 實驗原理四唑鹽比色試驗是一種檢測細胞存活和生長的方法。顯色劑四唑鹽是一種能接受氫原子的染料，化學名是3—（4,5一二甲基噻唑一2—2,5一二苯基四氮唑嗅鹽，商品名是噻唑籃，簡稱為MTT。檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結晶物甲臜（formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲臜，用酶聯免疫檢測儀在570nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶物形成的量與細胞數成正比。該方法已經廣泛應用于一些生物活性因子的活性檢測，大規模的抗腫瘤藥物篩選，細胞毒性試驗及腫瘤放射感性測定等。它的特點是靈敏度高、重復性好、操作簡便、經濟、快速、易自動化、無放射性污染，與其他檢測細胞活力的方法（如細胞計數法，軟瓊脂克隆形成試驗和3H-TdR摻入試驗等）有良好的相關性。三、 儀器和試劑儀器：酶標儀（BIO-RAD680，配有570nm的濾光片），微量震蕩器（用于震蕩96孔板），細胞培養用的常規儀器。試劑：（1） Cos-7細胞：于實驗前穩定培養，確認細胞狀態良好，并于實驗前一日細胞瓶中細胞約長滿70%—80%左右。（2） MTT溶液：稱取250mgMTT放入小燒杯中，加入50mLPBS（0.01mol/l，PH7.4），攪拌30min，用0.22m濾器除菌，分裝，4°C保存，2周內有效（5mg/mL）。（3） DMSO（二甲基亞砜）（4） 聚乙烯亞胺PEI25KDa和PEI600配成1mg/mL和10mg/mL兩種濃度（0.02MPBS作為溶液，PH7.4）。四、實驗步驟1.細胞接種，用0.25%胰蛋白酶消化單層Cos-7細胞，用含10%胎牛血清的1640培養液配成單個細胞懸液，將細胞接種到96孔板上，8000細胞/孔，每孔體積200pLo細胞培養，將培養板放入CO2孵箱，在37°C、5%CO2及飽和濕度條件下，培養至細胞貼壁而未進入分化階段（一般為＜16h）。吸去培養液，用PBS清洗細胞，加入無血清培養液，在細胞孔中分別加入PEI溶液，讓每孔中PEI的濃度分別為5,10，25,50，75,100，150，200pg/mL，每孔液體的總體積在200PLO（注意每種濃度都為三復孔，并要有不加任何PEI的對照孔至少3孔）PEI溶液與細胞共孵育3h。吸去培養液，每孔加入90皿無血清培養液和10皿的5mg/mLMTT溶液，37C孵育3h。翻板法棄去液體，每孔加入100皿DMSO，在震蕩器上震蕩10min。在酶標儀上570nm波長測OD值。細胞活力的計算式：細胞活力=每孔樣品OD值/每孔對照組OD平均值X100%統計數據。五、數據記錄與處理觀察PEI25KDa和PEI600的細胞死亡情況。用細胞活力計算細胞活力。以PEI濃度為橫坐標，細胞存活百分率（%）為縱坐標進行繪圖。注意事項實驗時應該觀察細胞的生長狀況，選擇適當的細胞接種濃度，一般情況下，96孔培養板的一個孔內貼壁細胞長滿時約有105個細胞。實驗選擇的接種濃度能保證MTT結晶形成的量與細胞數為良好的線性關系，因此，細胞板的接種與實驗開始的時間間隔不宜超過16h，以免細胞過早進入指數生長期從而干擾實驗結果。避免血清的干擾。細胞培養時一般選擇10%的牛血清培養液進行孵育，在加入化學物質前，要盡量吸盡培養孔中殘余的培養液。設空白對照，與實驗孔平行設置不加細胞只加培養液的空白對照組。進行比色測定時，以空白孔為零值。六、思考題毒性的定義很廣泛，你能舉出身邊遇到的關于化學物質毒性的例子嗎？如何用細胞記數法，計算細胞懸浮液中細胞的濃度？參考文獻1司徒鎮強，吳軍正。細胞培養。北京：世界圖書出版公司，2006。2李永明，趙玉琪。實用分子生物學方法手冊。北京：科學出版社，2000。Cheol-HeeAhn,SuYoungChae,SungWanKimBiodegradablepoly(ethylenimine)forplasmidDNAdelivery.JournalofControlledRelease.2002,(80):273-282W.T.Godbey,KennethK.Wu,AntoniosG.Mikos.Poly(ethylenimine)anditsroleingenedelivery.JournalofControlledRelease.1999,(60):149-160MichaelNeu,DagmarFischer,ThomasKisselRec