1、思考題：1、親子鑒定的原理是什么？2、法醫學常用的遺傳標記有哪些？3、計算父權排除概率和父權指數的法醫學意義是什么？4、如何評價Y染色體和線粒體DNA遺傳標記在親子鑒定中的應用價值？第一節 概述第二節 親子鑒定常用的遺傳標記第三節 DNA遺傳標記的檢測技術第四節 親權鑒定的結果分析第一節 概述 親子鑒定（identification in disputed paternity）是指應用醫學、生物學和人類學的方法檢測遺傳標記，并依據遺傳學理論進行分析，從而對被檢者之間是否存在生物學親緣關系所作的科學判定。起源回顧歷史記載 三國時期滴骨法文學戲劇等 秦劇三滴血描繪的合血法 電視劇 甄嬛傳描繪的合血

2、法 上世紀初(1901年) Landsteiner ABO Southern技術 1980 Whyman and white RFLP技術 指紋 1985 Jeffery DNA fingerprint 基因掃描 1990 STR based PCR 親子鑒定的應用常見于：1 涉及民事糾紛的親子鑒定（1）涉及婚生或非婚生子女撫育責任或財產繼承的訴訟案；（2）懷疑醫院調錯嬰兒或試管嬰兒配子錯配的訴訟案。2 涉及刑事案件的親子鑒定（1）強奸案或違法性犯罪案件對嬰兒（或胎兒）親生父親的確定；（2）碎尸案中的身源認定；（3）殺嬰、拐騙兒童等案件中孩子身源的認定。3 涉及行政事務的親子鑒定（1）移民涉外

3、公證；（2）失散親人親緣關系的認定；（3）計劃外生育責任人的確認及其子女戶籍的注冊。最常見：父權鑒定（paternity testing)親子鑒定的依據 妊娠期限非遺傳特征 性交及生育能力遺傳特征（主要）親子鑒定的依據遺傳性狀（或遺傳特征）是生物體表現的一切形態特征、生理特征和代謝類型的統稱。 單純遺傳特征人類的遺傳性狀 復雜遺傳特征分析單基因遺傳特征是親子鑒定最可靠、最基本和最常用的方法。親代基因型組合子代基因型aaaaaabbaaabbbbbbbabababaaabaa，abbbbb，abaa，bb，ab法醫遺傳標記（genetic marker）產物水平遺傳標記血液細胞表面的遺傳標記（紅

4、細胞型、白細胞型、血小板型）血液蛋白質的遺傳標記（紅細胞酶型、血清酶型、血清型）DNA水平遺傳標記DNA序列多態性DNA長度多態性親子鑒定原理 親子鑒定的基本原理有以下兩點：在肯定孩子的某個等位基因必須來自生父，而假設父親并不具有這個基因的情況下，可以排除其親子關系。在肯定孩子的某個等位基因必須來自生父，而假設父親具有這個基因的情況下，不能排除其親子關系。The Monk and his peas An Austrian monk, Gregor Mendel自由組合律分離率染色體 父親給一半 母親給一半chromosomefromfatherchromosomefrommother基因組 D

5、NA 信息傳遞根據遺傳標記排除父權 血型組合母親 孩子生 父 基 因可 以 排 除 父 權不 能 排 除 父 權aaaaabbaa、abaaabbaabb、ababaaabbaa、abbbbbbaabb、abbbababbaa、ababbbbaabb、abababa、b-aa、bb、abAutosomal (passed on in part, from all ancestors)Y-Chromosome(passed on complete, but only by sons)Mitochondrial (passed on complete, but only by daughters)

6、Lineage MarkersFigure 9.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition 2005 Elsevier Academic Press非孟德爾遺傳規律 mtDNA 母系遺傳模式親子鑒定的程序（一）案件受理（二）樣品檢驗（三）鑒定意見第二節 親子鑒定常用的遺傳標記一、遺傳標記的選擇 親子鑒定的DNA遺傳標記必須具備以下條件：1、基因座定義和具有的特征已有文獻報道；2、種屬特異性、靈敏性、穩定性研究已實施；3、遺傳方式符合相應的遺傳規律；4、遺傳標記的分型不受年齡、疾病及其他因素影響，終生不變；5、體細胞的穩定性，同一

7、個體的不同組織有相應的分型；6、具有遺傳多態性，基因頻率分布較均勻，父權排除率高；7、有可供使用并公開發表的群體遺傳數據；8、遺傳標記的突變率低；9、檢驗方法操作簡單，重復性好，結果明確可靠。親子鑒定效能的評估父權排除概率（power of excluding,PE）又稱非父排除概率（probability of excluding paternity,PEP）是指通過某一個遺傳標記系統的檢測，將不是生父的被控父親排除的概率。非父排除概率是衡量一個遺傳標記系統排除非父能力的一個客觀指標，是選擇親子鑒定遺傳標記的依據和衡量從事親子鑒定實驗室的質量控制標準之一。各個遺傳標記系統非父排除概率的大小取

8、決于該系統的遺傳方式、等位基因數目以及各等位基因在群體中的頻率分布。二、DNA多態性的分子基礎DNA多態性的分子基礎DNA的結構與功能結構：四種脫氧核糖核酸（簡稱核苷酸）通過磷酸二酯鍵聚合而成的多核苷酸鏈。核苷酸由磷酸、脫氧核糖和堿基（A、G、C、T）。功能：把遺傳信息從親代傳給子代。DNA多態性的分子基礎多態性：DNA區域中等位基因（或片段）存在兩種或兩種以上形式，其本質是生物體在進化過程中DNA的核苷酸排列順序改變的結果。DNA多態性可分為序列多態性（sequence polymorphism）和長度多態性（length polymorphism） 序 列 多 態 性在兩條同源染色體上，同

9、源DNA序列長度相等，但其之間的序列存在差異。HLA基因區有極為復雜的高度可變序列。例如：HLA-DQA1區段有239bp，其中序列變異的位置有27個。 長 度 多 態 性是指由于片段插入、缺失或重復序列數目變異所致的DNA長度的個體差異。其中約占整個基因族2030的重復序列是導致DNA長度多態性的最常見原因。1、散在重復序列 2、串聯重復序列 3、倒位重復序列第一代DNA遺傳標記VNTR是由許多長度為770bp的串聯重復單位組成的DNA序列，重復單位的重復次數在不同個體間有極大差異，重復次數少至數次，多至數千次，故又稱為可變數目串聯重復序列（variable number of tandem

10、 repeats，VNTRs）。以核心序列為探針進行限制性片段長度多態性分析時，能同時檢測多個位點小衛星DNA多態性，這便是多位點DNA指紋圖分析的理論基礎之一。小衛星DNA重復單位的重復數目遵循孟德爾遺傳規律遺傳。第二代DNA遺傳標記STR是一類更簡單的寡核苷酸串聯重復序列，重復單位為26bp，重復次數在1060次左右，又被稱為短小串聯重復序列（short tandem repeats，STRs）。STR分布廣泛，在人類基因組中約存在著5萬10萬個。STR實質上也是一種VNTR，同樣具有極高的多態性，亦按孟德爾遺傳規律遺傳。13 CODIS Core STR Loci with Chromo

11、somal PositionsCSF1POD5S818D21S11TH01TPOXD13S317D7S820D16S539D18S51D8S1179D3S1358FGAVWAAMELAMEL第三代DNA遺傳標記SNP主要是指在基因組水平上由單個核苷酸變異所引起的DNA序列多態性。1、SNP多態性低；2、SNP分布廣泛；3、SNP遺傳穩定；4、SNP分型容易。第三節 DNA遺傳標記的檢測技術Sample Obtained from Crime Scene or Paternity InvestigationBiologyDNAExtractionDNAQuantitationPCR Amplif

12、icationof Multiple STR markersTechnologySeparation and Detection of PCR Products(STR Alleles)Sample Genotype DeterminationGeneticsComparison of Sample Genotype to Other Sample ResultsIf match occurs, comparison of DNA profile to population databasesGeneration of Case Report with Probability of Rando

13、m MatchSteps in DNA Sample ProcessingSources of Biological EvidenceBloodSemenSalivaUrineHairTeethBoneTissueBlood stainOnly a very small amount of blood is needed to obtain a DNA profileDNA in the CellTarget Region for PCRchromosomecell nucleusDouble stranded DNA moleculeIndividual nucleotidesShort T

14、andem Repeats (STRs)the repeat region is variable between samples while the flanking regions where PCR primers bind are constant7 repeats8 repeatsAATGHomozygote = both alleles are the same lengthHeterozygote = alleles differ and can be resolved from one another170 bp195 bpDifferent primer sets produ

15、ce different PCR product sizes for the same STR alleleTCAT repeat unitIn 32 cycles at 100% efficiency, 1.07 billion copies of targeted DNA region are createdPCR Copies DNA Exponentially through Multiple Thermal CyclesOriginal DNA target regionThermal cycleThermal cycleThermal cycleMultiplex PCROver

16、10 Markers Can Be Copied at OnceSensitivities to levels less than 1 ng of DNAAbility to Handle Mixtures and Degraded SamplesDifferent Fluorescent Dyes Used to Distinguish STR Alleles with Overlapping Size RangesAn Example Forensic STR Multiplex KitD3FGAvWA5-FAM (blue)D13D5D7NED (yellow)AD8D21D18JOE

17、(green)GS500-internal lane standardROX (red)AmpFlSTR Profiler PlusKit available from PE Biosystems (Foster City, CA)9 STRs amplified along with sex-typing marker amelogenin in a single PCR reaction100 bp400 bp300 bp200 bpSize SeparationColor SeparationAvailable Kits for STR AnalysisKits make it easy

18、 for labs to just add DNA samples to a pre-made mix13 CODIS core lociProfiler Plus and COfiler (PE Applied Biosystems)PowerPlex 1.1 and 2.1 (Promega Corporation)Increased power of discriminationCTT (1994): 1 in 410SGM Plus (1999): 1 in 3 trillionPowerPlex 16 (2000): 1 in 2 x 1017ABI PRISM 310 Geneti

19、c Analyzer Automated gel pouringAutomated sample injectionCapillary electrophoresis with multi-color detection capabilitiesABI Prism 310 Genetic AnalyzercapillarySyringe with polymer solutionAutosampler trayOutlet bufferInjection electrodeInlet bufferClose-up of ABI Prism 310 Sample Loading AreaAuto

20、sampler TraySample VialsElectrodeCapillarySee Technology section for more information on CEamelogeninD19D3D8TH01VWAD21FGAD16D18D2amelogeninD19D3D8TH01VWAD21FGAD16D18D2Two different individualsDNA Size (base pairs)Results obtained in less than 5 hours with a spot of blood the size of a pinheadprobabi

21、lity of a random match: 1 in 3 trillion Human Identity Testing with Multiplex STRsSimultaneous Analysis of 10 STRs and Gender IDAmpFlSTR SGM Plus kitSTR genotyping is performed by comparison of sample data to allelic laddersMicrovariant alleleSTR Allele Frequencies05101520253035404567899.310Caucasia

22、ns (N=427)Blacks (N=414)Hispanics (N=414)TH01 Marker*Proc. Int. Sym. Hum. ID (Promega) 1997, p. 34Number of repeatsFrequencyBruker BIFLEX III Time-of-Flight Mass SpectrometerCapable of fully automated data acquisition on 384 or more samples per plate第四節 親權鑒定的結果分析鑒定結論的證據條件（一）法律性1、鑒定主體2、鑒定程序3、鑒定客體（二）科

23、學性1、鑒定主體2、檢驗方法3、結果分析 遺傳證據強度的判斷指標父權指數（paternity index，PI）又稱親子關系指數，是假設父提供生父基因成為孩子生父的可能性與隨機男子提供生父基因成為孩子生父可能性的比值，表示假設父為孩子生父的機會比隨機男子為孩子生父的機會大多少倍，是一項重要的親子關系參數。 PI=X/YX：假設父作為生父應提供所需基因的幾率Y：隨機男子作為生父應提供所需基因的幾率父權指數是兩個條件概率的比值，是一個典型的似然比，是以分型結果不違反遺傳規律作為條件，假設父是孩子生父的概率與一個隨機男子是孩子生父的概率之比。計算父權指數的具體步驟（1）根據母子組合，確定來自父母的必

24、需基因，即生父和生母基因。（2）確定母親遺傳生母基因的機會（f）。（3）確定隨機男子提供生父基因的機會（g），一般使用相應的基因頻率。（4）確定假設父提供生父基因的機會（c）。（5）計算隨機男子成為生父的機會，Y=fg。（6）計算假設父成為生父的機會，X=fc。（7）計算父權指數，PI=X/Y=fc/fg。PI值的具體計算例見表10-11。 表10-11 PI值計算例案例表型必需基因f隨機男人成為生父的機會（Y=fg）被控父成為生父的機會（X=fc）PI孩子母親被控父母親生父1BAABOB110.2556=0.255610.5=0.51.962ABABBABBA0.50.50.50.2556+

25、0.50.20920.50.596+0.501.280.23240.2983BBABBB或O0.4040.5960.25560.5960.50.87OB0.596 0.5960.5352+0.4040.25560.5960+0.4040.5 0.5748 0.54BOBOB110.2556=0.255610.596=0.5960.23 父權相對機會及計算父權相對機會（relative chance of paternity，RCP）又稱親子關系相對機會，是以百分比形式來表示PI值。RCP=PI/（PI1）100=X/（XY） 100PI理論值可接近無窮大，RCP理論值可非常接近100，但不能達

26、到100。RCP作為衡量親生關系可能性大小的指標，按統計學標準，當RCP達到95，已具有肯定親生關系的意義。親子鑒定結果的評估排除親權關系肯定親權關系單親親子鑒定結果的評估排除親權關系排除父權的類型（根據血型遺傳規律）1、 直接排除2、間接排除直接排除有爭議的可疑父親與孩子中至少有一個為雜合子時，若他們之間的遺傳標記違反遺傳規律，排除親子關系則為直接排除。 直接排除父權例DNA分型是直接檢測染色體上的基因，由于各類DNA多態性位點的雜合度均較高，每個位點的等位基因又為共顯性，故在沒有基因突變、分型差錯的前提下，只要受檢者之間的DNA分型違反孟德爾遺傳規律，可以認為都是直接排除。母親孩子可疑父親

27、例1A型AB型A型例2A型O型AB型 間接排除有爭議的可疑父親和孩子由表型推測均為純合子時，如他們之間的遺傳標記違反遺傳規律，排除親子關系則為間接排除。例 ：MN系統檢測時，孩子為M型，可疑父親為N型，推測孩子和可疑父親的基因型分別為MM和NN，可疑父親因不能提供必須的M基因而排除其與孩子的親子關系。間接排除是根據檢測的陰性結果推測某基因位點為純合子，由于某些血型系統存在O基因、無效基因等，可能將含有這些基因的雜合子誤推測為純合子，故作出結論時應慎重。 排除父權的原則1、只有一個遺傳標記（無論是血型遺傳標記還是單基因位點DNA遺傳標記）違反遺傳規律，不能輕易作出否定結論，必須加測其他系統，因為

28、對于不是生父的男子，隨著檢測項目的增加必定還有其他遺傳標記可排除親子關系。若增加檢測項目，排除遺傳標記不再增加，則可考慮原來排除的那個遺傳標記是由突變或非典型遺傳方式造成的，此時若親子關系相對機會已超過公認的親權認定標準，則可作出認定結論。2、有2個遺傳標記排除，要根據具體情況分析。2個血型遺傳標記，如ABO、HLA違反遺傳規律 ，則可作出排除結論 ；1個血型遺傳標記直接排除，1個DNA遺傳標記排除，且可疑父與孩子均為雜合子，則可否定可疑父為生父；2個DNA遺傳標記排除需慎重對待，宜加測遺傳標記后再具體分析，加測標記數目要考慮CCE值達到0.9999以上，結論較為穩妥。3、有3個及3個以上遺傳

29、標記排除，則可作出排除親子關系的結論。因為假設DNA單一基因位點突變率為0.002，三個位點同時突變造成錯誤排除概率僅為4109。排除案例：位點毛先生毛某1毛某2VWA15，1814，1614，17TPOX8，118，118，11THO16，66，99，9D16S53911，119，119，9D21S1128，33.229，3029，29D18S5119，2213，1913，19D8S117913，1515，2615，16D5S81811，1110，1212，12D13S3178，911，1212，13D7S8208，1011，1211，12CSF1PO11，1210，1210，12D3S13

30、5816，1912，1712，19FGA23，2422，2619，22 肯定親權關系 在親子鑒定中，根據多個血型系統檢測結果的遺傳關系分析，親代與子代的遺傳標記不違反孟德爾遺傳定律，則他們之間可能存在親生關系，但并不等于一定是親生關系，因為隨機男子也可能攜有與生父相同的基因。經標準化實驗檢測遺傳標記，假定為父親的男子不能被排除父權的情況下，計算概率后如同時滿足下列兩項指標，可以認定假定父親的父權，即可以斷定他是孩子的生物學父親。1、實驗檢測遺傳標記的累積非父排除率等于或大于99.99；2、假定父親的累積父權指數等于或大于10000，即在前概率相同的條件下，假定父親的相對父權機會等于或大于99.99。肯定案例：位點韓女士孩子包某VWA16，1916，1717，17TPOX8，98，118，11THO19，99，9.38，9.3D16S5399，1010，1212，12D21S1128，3131，32.232，32.2D18S5115，1813，1513，18D8S117912，1312，1412，14D5S81811，1111，1212，12D13S3178，1111，1111，13D7S82012，1210，1210，10CSF1PO12，1211，121