1、物理圖的繪制原 因遺傳分析繪制的基因組圖為何不能指導(dǎo)基因組計(jì)劃的測(cè)序?為何要繪制物理圖?原因有2個(gè)遺傳圖的分辨率有限微生物基因組較小，記錄成百上千次重組試驗(yàn)就能獲得十分詳盡的遺傳圖，標(biāo)記分布密度僅為數(shù)千核苷酸。人類及大多數(shù)高等真核生物由于不可能獲得大量的子代，只有少數(shù)的減數(shù)分裂事件可供研究，連鎖分析的分辨力受到很大限制。最好的一份人類遺傳圖其標(biāo)記密度平均為599kb，還不能直接用于指導(dǎo)全基因組的測(cè)序。離每100kb一個(gè)標(biāo)記的要求仍差距甚遠(yuǎn)，后者是進(jìn)入基因組全面測(cè)序的前提。高密度基因組圖僅僅采用遺傳作圖技術(shù)是無法完成的，必須借助于其他非遺傳分析的方法。 遺傳圖的精確性較低Sturtevant的關(guān)

2、于交換是隨機(jī)發(fā)生的猜想部分正確，因?yàn)橹亟M熱點(diǎn)的存在使染色體某一區(qū)段的交換頻率高于其他區(qū)段。特別是倒位區(qū)段，由于受到交換限制，無法繪制精細(xì)遺傳圖。 遺傳圖的局限性表明，在進(jìn)行大規(guī)模的DNA測(cè)序之前，對(duì)大多數(shù)真核生物的遺傳圖必需進(jìn)行驗(yàn)證并利用其他作圖技術(shù)予以校正和補(bǔ)充。遺傳分析將基因及DNA標(biāo)記定位在染色體上繪制的遺傳圖。另一種基因組作圖，即直接檢測(cè)DNA標(biāo)記在染色體上的實(shí)際位置。物理圖的繪制方法1、限制性作圖2、熒光標(biāo)記原位雜交3、順序標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)作圖 1、限制性作圖 RFLP標(biāo)記是由限制酶酶切產(chǎn)生的一段DNA片段。不同限制酶識(shí)別的順序各異，大多數(shù)限制酶的識(shí)別順序?yàn)?、5或6個(gè)堿基對(duì)，7、

3、8甚至更多的堿基對(duì)。 在連續(xù)出現(xiàn)2個(gè)或多個(gè)相同酶切位點(diǎn)區(qū)段，其排列順序可有多種選擇，此時(shí)采用部分酶切的辦法使該區(qū)段只發(fā)生一次酶切，然后計(jì)算產(chǎn)生片段的長(zhǎng)度，選擇其中正確的排序。后者稱為部分限制作圖。部分限制作圖可提供完整物理圖繪制所需的信息，但是當(dāng)涉及的限制位點(diǎn)過多時(shí)，這種方法就顯得力不從心。特別是內(nèi)部含有大小相同的片段時(shí)，位置重疊的片段無法區(qū)分，使排序變得非常復(fù)雜。此時(shí)可采用末端同位素標(biāo)記結(jié)合部分酶解的方法進(jìn)行物理圖繪制。（2）、DNA分子限制性作圖如果樣品中僅存在較少的限制性位點(diǎn)，用常規(guī)的限制酶即可繪制DNA物理圖。 隨著切點(diǎn)數(shù)目的增多，單酶切，雙酶切及部分酶切產(chǎn)生的條帶數(shù)成比例擴(kuò)大，需要對(duì)

4、大量的片段進(jìn)行比對(duì)與組裝。因?yàn)榇罅科谓?jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離時(shí)總會(huì)有些片段相互貼近，增加了分辨單個(gè)條帶的困難，很可能遺漏一些片段。限制性作圖只能應(yīng)用于較小的DNA分子，其上限取決于作圖分子中限制酶位點(diǎn)的頻率。通常采用的6堿基對(duì)識(shí)別順序的限制酶僅適合50kb以下DNA分子的精確作圖，但50kb遠(yuǎn)低于細(xì)菌及真核生物染色體的長(zhǎng)度，只可覆蓋少數(shù)病毒和細(xì)胞器基因組。限制圖能否用于大于50kb基因組的作圖呢?稀有切點(diǎn)限制酶 限制性內(nèi)切酶是一類可與DNA結(jié)合并在特別的順序位置切割DNA的酶。因其切割位點(diǎn)有專一性，常用于RFLP分析、限制性作圖的操作。有3種限制性內(nèi)切酶，I型和型對(duì)酶切位點(diǎn)的特異性要求不太嚴(yán)格，

5、型限制性內(nèi)切酶只能在完全正確的順序切割，專一性很強(qiáng)。例如來自大腸桿菌的限制酶EcoRI的切點(diǎn)總是5GAATTC3，據(jù)此可預(yù)測(cè)已知順序的DNA經(jīng)酶切后產(chǎn)生的片段大小及其數(shù)目。獲得理想大小的DNA片段對(duì)基因組的限制性作圖至關(guān)重要，其關(guān)鍵是選擇合適的限制酶。限制酶識(shí)別位點(diǎn)的核苷酸數(shù)目與組成決定了該酶產(chǎn)生的DNA片段的大小。如果基因組中4種堿基的分布是隨機(jī)的，預(yù)期產(chǎn)生的限制性DNA片段大小為4n, n代表限制酶識(shí)別位點(diǎn)的堿基數(shù)目。椐此可以推算：常用的4或6堿基對(duì)識(shí)別順序的限制酶只能產(chǎn)生較小的DNA片段，要獲得大于50 kb的DNA片段必須采用稀有切點(diǎn)限制酶。稀有切點(diǎn)限制酶系指該酶識(shí)別的堿基順序在基因組

6、中只有很少數(shù)量，可產(chǎn)生較大的DNA片段。有些限制酶識(shí)別位點(diǎn)較長(zhǎng)，如酵母編碼的ISce識(shí)別順序?yàn)?8bp，即使高等真核生物基因組亦無此序列。此時(shí)可采用變通的方法，將這類識(shí)別位點(diǎn)引入待測(cè)的基因組中。基因組DNA的甲基化狀態(tài)。 基因組DNA分子的順序并非完全隨機(jī)分布，某些特異限制酶識(shí)別順序只分布在一定的區(qū)段。例如人類基因組DNA中5CG3的順序極少，因?yàn)槿思?xì)胞中具有將5CG3中胞嘧啶5碳原子甲基化的酶，產(chǎn)生的5甲基胞嘧啶在生理?xiàng)l件下極不穩(wěn)定，脫氨基后轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏ぁＴ诼L(zhǎng)的進(jìn)化歷史中，人類基因組中原有的許多5CG3順序由于甲基化突變逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)?TG3順序。 活細(xì)胞中大量5CG3順序的胞嘧啶被甲基化(

7、5meC)，許多切點(diǎn)含有5CG3 序的限制酶在人類基因組DNA中只能找到很少可切位點(diǎn)。如限制酶Sma I(5CCCGGG-3)處理人類基因組DNA產(chǎn)生的片段平均長(zhǎng)度為78 kb；NotI是一個(gè)8核苷酸限制酶，靶序列(5GCGCGCGC3)在人類基因組DNA中平均每1 Mb含一個(gè)切點(diǎn)。限制性作圖的潛力隨使用的稀有切點(diǎn)限制酶種類而增加，在低等生物基因組以及大分子DNA克隆片段的物理圖繪制中被廣泛采用 。大分子DNA片段的分離DNA分子的長(zhǎng)度與其在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移率僅在很小的范圍內(nèi)成線性關(guān)系，隨著DNA分子長(zhǎng)度的增加，凝膠電泳的分辨力急劇下降。常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳即使在低濃度的凝膠條件下，也只能

8、分離約30kb以下的線性分子。30kb以上的DNA在常規(guī)電泳凝膠中彼此擠壓，形成單一DNA遷移帶。稀有切點(diǎn)限制酶產(chǎn)生的DNA片段往往超過50kb，如NotI酶切片段可達(dá)1000kb，必須用特殊的凝膠電泳技術(shù)才能分離與觀測(cè)。Cantor首次采用一種新的電泳技術(shù)，即脈沖凝膠電泳(PFGE)突破了瓊脂糖凝膠分離大分子DNA的限制。在不改變凝膠濃度、電場(chǎng)強(qiáng)度和緩沖液的條件下，脈沖凝膠電泳使大分子DNA的分辨力提高于2個(gè)數(shù)量級(jí)，達(dá)到10Mb。PFGE的基本原理：將一個(gè)方向不斷變換的電場(chǎng)取代簡(jiǎn)單的單一電場(chǎng)(單向電場(chǎng))，使電泳中受阻的DNA分子在電場(chǎng)改變時(shí)扭轉(zhuǎn)遷移方向，達(dá)到分離的目的。凝膠中的DNA分子在電

9、場(chǎng)方向不斷變換的作用下，隨時(shí)改變泳動(dòng)的方向。小分子DNA比大分子DNA更易在凝膠中重新定向，因而遷移速度更快。根據(jù)同一原理設(shè)計(jì)的電泳技術(shù)還包括：夾角等值均一電場(chǎng)（CHEF)電場(chǎng)逆轉(zhuǎn)凝膠電泳（FIGE)。交變電場(chǎng)分辨大分子DNA的范圍遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出常規(guī)電泳，可將酵母14條染色體彼此分開。 大腸桿菌基因組限制性酶切位點(diǎn)物理圖大腸桿菌基因組全長(zhǎng)4.5106bp,NotI酶切產(chǎn)生了21個(gè)片段，長(zhǎng)度在201 000 kb之間,經(jīng)脈沖凝膠電泳分離后，將酶切片段轉(zhuǎn)移到雜交膜上,選用已經(jīng)遺傳定位的基因?yàn)樘结樑c之雜交，可確定各酶切片段排列位置。2、熒光標(biāo)記原位雜交 熒光原位雜交(FISH)與同位素雜交的原理相同，只是

10、標(biāo)記物不同。FISH的熒光標(biāo)記信號(hào)特點(diǎn)：可在顯微鏡下觀測(cè)，直接顯示探針與染色體雜交的位置 早期的原位雜交大都采用同位素標(biāo)記探針，但效果不盡人意。原因在于同位素標(biāo)記很難兼顧敏感性與分辨率。敏感性要求放射性標(biāo)記具有較高的發(fā)射能量，但發(fā)射能量過高會(huì)使信號(hào)擴(kuò)散從而降低分辨力。用能量較低的同位素可提高分辨力，但因其敏感性低。20世紀(jì)80年代末由于非同位素標(biāo)記化合物即DNA熒光染料的發(fā)現(xiàn)使上述問題迎刃而解。這些標(biāo)記化合物將高敏感性與高分辨力集于一身，從根本上改進(jìn)了原位雜交的效果。為了使敏感性盡可能提高，可選用能產(chǎn)生極強(qiáng)信號(hào)的熒光物質(zhì)。常選擇長(zhǎng)鏈DNA分子作為探針，一般不少于40 kb的DNA片段。（2）、

11、原位雜交的操作原位雜交最初利用的是細(xì)胞分裂中期染色體。染色體處于高度濃縮狀態(tài)，有可分辨的染色體帶型及明顯的著絲粒位置，各條染色體帶有各自的形態(tài)，有可識(shí)別的帶型。對(duì)特定探針而言，原位雜交所顯示的中期染色體熒光信號(hào)所處的位置與染色體短臂末端的相對(duì)距離是不變的，經(jīng)過比例換算可將其標(biāo)定在連鎖圖上。中期染色體的不利之處在于分辨力較低，要求2個(gè)分子標(biāo)記之間至少需隔開 1000kb。中期染色體的原位雜交不適合構(gòu)建可利用的染色體物理圖，主要用于確定新發(fā)現(xiàn)的分子標(biāo)記屬于哪條染色體，給出十分粗略的染色體定位。 原位雜交的分辨力取決于雜交的技術(shù)以及染色體所處的狀態(tài)。中期染色體過于收縮不適于精細(xì)作圖，為改進(jìn)作圖精度，

12、必須采用處于更為伸展的染色體。有2種方法可達(dá)此目的：機(jī)械伸展的染色體 將中期細(xì)胞核稍作修改即可獲得伸展的染色體，離心可產(chǎn)生剪切力使染色體的伸展長(zhǎng)度增加20倍。用這種方法制備的單個(gè)染色體形態(tài)仍可識(shí)別，其原位雜交信號(hào)的作圖與正常的中期染色體作圖相同。非中期相染色體 提高分辨力考慮，間期染色體更為適用。已有一些改進(jìn)的染色體制備方法可獲得既松散又保持分辨特征的染色體。3、順序標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)作圖 限制性作圖雖然快速，并可提供詳細(xì)的信息，但不適合大基因組。原位雜交因其操作困難，資料積累慢，一次實(shí)驗(yàn)定位的分子標(biāo)記不超過34個(gè)。因此繪制詳細(xì)準(zhǔn)確的物理圖還必需尋找更有效的技術(shù)。 構(gòu)建最為詳細(xì)的大基因組物理圖

13、的主流技術(shù)為STS繪圖。順序標(biāo)簽位點(diǎn)（STS)是一小段長(zhǎng)度在100500bp的DNA順序，每個(gè)基因組僅1份拷貝，很易分辨。原理：當(dāng)2個(gè)片段含有同一STS順序時(shí)，可以確認(rèn)這2個(gè)片段彼此重疊。2個(gè)不同的STS出現(xiàn)在同一片段的機(jī)會(huì)取決于它們?cè)诨蚪M中的位置靠得多近。如果它們彼此鄰接，這2個(gè)STS總會(huì)同時(shí)出現(xiàn)在相同片段上。如果它們相距甚遠(yuǎn)，有時(shí)會(huì)在同一片段，有時(shí)則在不同片段。 要將一組STS作圖定位，必須收集來自同一染色體或整個(gè)基因組隨機(jī)斷裂的DNA片段。依次采用單個(gè)STS挑出它們所在的DNA片段，根據(jù)它們彼此的重疊關(guān)系可以逐段繪制DNA物理圖。一般可用雜交但更多地是用PCR來分析STS所在位置，這一

14、程序已經(jīng)機(jī)械化，可自動(dòng)操作。STS的分析資料可用來估算2個(gè)分子標(biāo)記之間的相對(duì)距離。連鎖分析中，位點(diǎn)間的圖距與2個(gè)標(biāo)記之間的交換頻率有關(guān)。STS作圖中，標(biāo)記之間的圖距依賴于兩點(diǎn)之間斷裂的頻率。（1）、任何單一DNA順序都可作為STS 作為合格的STS要滿足2個(gè)條件：它應(yīng)是一段序列已知的片段，可據(jù)此設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)來檢測(cè)不同的DNA片段中是否存在這一順序；STS必須在染色體上有獨(dú)一無二的位置。如果某一STS在基因組中多個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)，那么由此得出的作圖數(shù)據(jù)將是含混不清的。 常用尋找STS的辦法有以下幾種：表達(dá)順序標(biāo)簽(EST) 這是一些從cDNA克隆中找到的小段順序。因?yàn)榧?xì)胞中的mRNA來自編碼蛋白質(zhì)基

15、因，因此cDNA代表了mRNA所在細(xì)胞中表達(dá)的基因。EST被視為一種獲取重要基因的捷徑，即使其順序不全，仍具有重要價(jià)值。EST可轉(zhuǎn)變?yōu)镾TS，條件是這個(gè)EST來自單拷貝基因而非基因家族成員，后者常常含有相同或相似的順序。SSLP 微衛(wèi)星序列和其他的SSLP在遺傳作圖中的應(yīng)用。SSLP像STS一樣也可用于物理作圖。隨機(jī)基因組順序 從克隆的DNA中隨機(jī)測(cè)序可獲得有用的序列，也可從數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找所感興趣的某些順序。 (2)、STS的物理圖定位 STS作圖程序的第二個(gè)內(nèi)容是將已知的STS定位在染色體或基因組中的DNA區(qū)段，這些STS標(biāo)記和作圖用的染色體區(qū)段以及DNA克隆有時(shí)又稱為作圖試劑。有2種方法用于

16、STS的物理圖定位： 輻射雜種 輻射雜種是含有另一種生物染色體片段的嚙齒類細(xì)胞(1996)。 Harris他們發(fā)現(xiàn)將人體細(xì)胞暴露在30008000rad劑量的X射線中可引起染色體隨機(jī)斷裂，輻射的X射線劑量越大，產(chǎn)生的染色體片段越小。經(jīng)強(qiáng)輻射處理的人體細(xì)胞很快死亡，但若在輻射后立即將處理過的細(xì)胞與未輻射的倉(cāng)鼠或其他鼠類細(xì)胞融合，有些人體細(xì)胞染色體片段將會(huì)整合到鼠類染色體中進(jìn)行擴(kuò)增。 輻射與融合基因轉(zhuǎn)移(IFGT)。化學(xué)試劑PEG(聚乙二醇)或仙臺(tái)病毒可誘導(dǎo)細(xì)胞融合。鑒別雜種細(xì)胞：常規(guī)的辦法是選用一種不能合成胸苷激酶(TK)或次黃嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPRT)的缺陷細(xì)胞，這種細(xì)胞在添加次黃嘌呤、氨基嘌

17、呤和胸苷的培養(yǎng)基(HAT)中是致死的。將融合的細(xì)胞置于HAT培養(yǎng)基中，凡是從人體細(xì)胞中獲得編碼TK和HPRT基因的雜種細(xì)胞都可在選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，由此獲得一系列隨機(jī)插入人類DNA片段的雜種細(xì)胞。通常選擇到的每個(gè)陽性雜種細(xì)胞系可保留 510 Mb大小的人細(xì)胞染色體片段，約占人類基因組的1535。這些雜種細(xì)胞的集合體稱為輻射雜種群，可作為一種作圖試劑用于STS定位。每次從雜種細(xì)胞分離DNA，用PCR檢測(cè)雜種細(xì)胞中含有的STS標(biāo)記，根據(jù)成對(duì)STS出現(xiàn)的頻率，可判斷這些標(biāo)記是否連鎖以及連鎖程度。輻射雜種的作圖單位為厘鐳(centiRay，cR)，其定義為DNA分子暴露在N拉德X射線劑量下兩個(gè)分子標(biāo)記

18、之間發(fā)生1斷裂的頻率。顯然2個(gè)標(biāo)記在染色體上的位置離開越遠(yuǎn)，其間發(fā)生斷裂的可能性越高。由于斷裂的染色體片段在雜種細(xì)胞中隨機(jī)整合，因而兩個(gè)標(biāo)記滯留在同一雜種細(xì)胞中的比例與其之間的連鎖關(guān)系成正比。人類輻射雜種圖的若干特征人類基因組輻射雜種作圖最初是采用特定染色體而非整個(gè)基因組，因?yàn)閱蝹€(gè)染色體作圖所用的雜種數(shù)量要比全基因組少得多。一個(gè)高分辨力的單個(gè)染色體的作圖要求約100200個(gè)雜種群，很適合常規(guī)的PCR檢測(cè)程序。全基因組輻射雜種作圖在人類基因組計(jì)劃(HGP)的物理圖繪制中占有十分重要的地位，是人類基因組計(jì)劃的核心內(nèi)容之一。目前已有現(xiàn)成的全基因組輻射雜種群，如編號(hào)為Genebridge 4群即有93

19、個(gè)人體DNA雜種系。輻射雜種作圖對(duì)于一些缺少遺傳作圖資源的模式生物基因組圖繪制具有重要意義：特別是牛和馬這類妊娠期較長(zhǎng)的大生物，它們的單仔生殖只能提供極有限的作圖數(shù)據(jù)。其他如河豚魚，因其繁殖困難不適宜經(jīng)典遺傳學(xué)分析，輻射雜種作圖是一種理想的方法。許多哺乳動(dòng)物，如老鼠、豬的全基因組輻射雜種作圖已取得重要進(jìn)展，斑馬魚以及雞的輻射雜種作圖也已展開 。克隆作圖基因組測(cè)序計(jì)劃的準(zhǔn)備工作之一，就是將基因組或分離的染色體打斷并將這些DNA片段克隆到高容量的載體中，構(gòu)建全基因組文庫(kù)。這些載體是專門設(shè)計(jì)用來操作大分子的DNA，如YAC克隆平均含12Mb大小的DNA片段。在STS分析中，這類基因文庫(kù)同樣可成為作圖

20、試劑。用于物理圖譜繪制的克隆文庫(kù)有2種：一種是來自全基因組DNA。一種是指定的單一染色體，它們均可用于目的不同的基因組文庫(kù)構(gòu)建。分離單個(gè)相同染色體的儀器為流式細(xì)胞儀，其工作原理是，根據(jù)處在極度收縮狀態(tài)的中期染色體所特有的形態(tài)與結(jié)構(gòu)特征有區(qū)別地分檢所需的成員。將細(xì)胞小心破碎后染色體可釋放到緩沖液中，然后使混合的染色體與熒光染料反應(yīng)。熒光物質(zhì)與染色體的結(jié)合是非特異性的，結(jié)合的數(shù)量取決于染色體的大小。染色體體積越大，結(jié)合的熒光染料越多，發(fā)出熒光亮度越強(qiáng)。帶有熒光物質(zhì)的染色體經(jīng)稀釋后使其通過一種極細(xì)的管道，從管道下方擠出的液滴體積很小，足以保證僅含一條染色體。在液滴通過檢測(cè)裝置時(shí)，染色體所攜帶的熒光強(qiáng)

21、度被記錄，儀器依次根據(jù)熒光強(qiáng)度將相似的成員分檢到同一容器中。對(duì)一些體積大小或形態(tài)相似不易區(qū)分的染色體，可改用專一性結(jié)合的染料。如人類21號(hào)染色體與22號(hào)染色體大小接近，但各自含有的AT與GC堿基比例不同。熒光染料Hoechst 33258和染色素A與AT和GC結(jié)合的能力不同，這種選擇性的結(jié)合賦予了染色體特征性的熒光亮度，借助這種差異很易區(qū)分21號(hào)和22號(hào)染色體。 在獲得基因組大分子DNA克隆文庫(kù)之后，采取PCR方法檢測(cè)含有STS標(biāo)記的克隆，根據(jù)重疊的STS標(biāo)記可繪制克隆連鎖圖。 人類基因組遺傳和物理圖 20世紀(jì)80年代認(rèn)為繪制詳盡的人類基因組圖是一項(xiàng)可望而不可及的任務(wù)。雖然當(dāng)時(shí)果蠅和其他生物的綜合遺傳圖已經(jīng)構(gòu)建，但人類家系遺傳分析存在的問題及相對(duì)缺少多態(tài)性遺傳標(biāo)記，使遺傳學(xué)家懷疑能否繪制一份含有高密度標(biāo)記的人類基因組圖譜。繪制人類遺傳圖的嘗試最初始于RFLP的發(fā)現(xiàn)，這是動(dòng)物基因組中最早被識(shí)別的多態(tài)性DNA標(biāo)記。1987年發(fā)表了第一份人類RFLP連鎖圖，含393個(gè)RFLP和10個(gè)其他多態(tài)性標(biāo)記。這張基因組連鎖圖來自21個(gè)家庭，平均密度為10 Mb。人類基因組計(jì)劃開始確立，世界