1、關于基因克隆及蛋白表達第1頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四研究某一目的基因功能一般策略 目的DNA獲得來自三條途徑:1. genome上的特定區域或序列2. 含有目的DNA的質粒3. 從cDNA文庫中擴增單個已知cDNA獲得目的DNA構建含目的DNA質粒轉化細菌蛋白表達純化轉染真核細胞蛋白定位、表達及表型變化第2頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四第一部分PCR第3頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四聚合酶鏈反應（PCR）技術 聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)是20世紀80年代后期由K.

2、Mullis等建立的一種體外酶促擴增特異DNA片斷的技術。PCR是利用針對目的基因所設計的一對特異寡核苷酸引物，以目的基因為模板進行的DNA體外合成反應。PCR技術具有靈敏度高，特異性強，操作簡便等特點。目前已廣泛應用于分子生物學的各個領域。第4頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四一、PCR實驗原理第5頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四一、PCR實驗原理第6頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四二、PCR的反應體系 1. PCR引物（1） primer 長度：18-30bp 引物短特異性降低 引物長影響產物生成（2） primer 濃

3、度：0.1-1.0 umol/L 濃度過高錯配、引物二聚體增加 濃度過低PCR效率降低第7頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四二、PCR的反應體系 2. 緩沖液 KCl、Tris-Cl、MgCl2 ， Mg2+：1.52.0 mM Mg2+ : DNA聚合酶 活性 PCR產量 Mg2+ : PCR反應特異性第8頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四二、PCR的反應體系 3. DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 LA DNA聚合酶 Prime STAR (Pyrobest DNA聚合酶 ) Pfu DNA聚合酶第9頁，共86頁，2022年，5月20日，8點1

4、3分，星期四第10頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四第11頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四Taq DNA polymerase5533533553 DNA聚合酶活性。在模板和引物存在的條件下，以dNTP作為底物，沿53方向合成與模板互補的DNA第12頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四LA Taq DNA Polymerase1. 53 DNA聚合酶活性；2. 35 DNA外切酶活性。第13頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四Pyrobest & pfu DNA Polymerase Taq DNA 聚合酶活

5、性 35外切酶活性，可信度極高 PCR產物為平滑末端第14頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四PCR的反應體系4dNTP: 50-200 umol/L5. 模板DNA（1） 單鏈DNA（2） 雙鏈DNA（3） 濃度：基因組DNA：1ug 質粒DNA：10ng第15頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四三、基本操作步驟1.變性(denature):95高溫下,雙螺旋氫鍵斷 裂,雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA2.退火(annealing):兩條引物與模板DNA擴增區 域的兩端按堿基互補配對結合.3.延伸(extension):在4種dNTP底物及Mg2+存在 條

6、件下,Taq DNA聚合酶在72下,將單核 苷酸按堿基互補配對原則從引物3端摻 入,使引物沿53方向延伸合成新股DNA第16頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四四、條件優化1.變性: 95變性20-30s,即可使各種DNA完全變性。2.退火:引物與模板退火溫度由引物長度和GC%決定,退火溫度一般應比Tm值低4-12 為宜,退火時間一般為20-40s。3.延伸:通常68-75。延伸時間取決于擴增片斷的長度. 可以500bp/30s為基準，根據目的片斷的長度計算反應時間。4.循環次數：一般為25-35次。第17頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四PCR反應液

7、PCR Buffer（Mg2+） 2.5ldNTP混合物（各2.5mM） 4l模板DNA 1l引物1（20uM） 0.5l引物2（20uM） 0.5lTaq DNA polymerase（5U/ul） 0.25lddH2O至 25l第18頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四PCR反應條件 94 5min94 30sec55 30sec 30 Cycles72 1min72 10min 4 forever第19頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四五、PCR引物的設計PCR反應成功的一個關鍵條件是正確設計引物PCR引物設計目的是在擴增特異性和擴增效率兩個目標

8、上取得平衡.可以利用計算機軟件進行引物設計,引物設計軟件會通過每一引物設計變化的預定值在兩個目標間取得平衡,找出最佳引物.有時也需根據實驗的具體要求進行適當調整.第20頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四引物設計的基本原則 (一)引物長度在16-30bp范圍內,以18-24bp為最佳.引物過短,產物特異性降低,每增加一個核苷酸,引物特異性可增加4倍.引物的長度是指與模板DNA序列互補的部分,不包括為后續克隆而加的酶切位點與額外序列.第21頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四引物設計的基本原則(二)引物末端1.引物的3末端對于PCR反應是關鍵.2.引物的3

9、末端的第一和第二個堿基影響Taq DNA聚合酶的延伸效率,故其影響PCR反應的擴增效率及特異性.引物3末端最佳堿基選擇G或C，因為它們形成的堿基配對比較穩定。第22頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四引物設計的基本原則3. 引物5末端的堿基無嚴格限制當引物的長度足夠時, 引物5末端的堿基可不與模板DNA互補而呈游離狀態。可在5端加上限制內切酶位點,啟動子序列或其他序列等,以便于PCR產物的分析克隆。第23頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四引物設計的基本原則4.在一個PCR反應中的一對引物之間不應存在互補序列,特別是3末端應盡量避免互補,以免形成“引物二

10、聚體”造成引物浪費和非特異性的擴增.5.每個引物的內部應盡量避免形成二級結構,特別是引物的末端應無回文結構.第24頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四引物設計的基本原則(三)引物的GC含量和Tm值PCR引物G+C堿基的含量應保持在45-65%之間，G+C含量一般為40-60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。PCR擴增中的復性溫度一般是較低Tm值引物的Tm值減去5-10度。引物長度小于20bp時, Tm=4(G+C)+2(A+T) 。第25頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四引物設計的基本原則(四)引物的

11、位置1.引物的序列應位于基因組DNA的高度保守區，且與非擴增區無同源序列，這樣可減少引物與基因組的非特異結合，提高反應的特異性。2.若以cDNA為模板，則首先應盡量使引物和產物保持在mRNA的編碼區域內；其次，盡量把引物放在不同的外顯子上，以便使特異的PCR產物與從污染DNA中產生的產物在大小上相區別。第26頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四引物設計的基本原則（五)Primer primer 5.0輔助的引物設計步驟及條件優化第27頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四第二部分RT-PCR第28頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四RT

12、-PCR是將RNA反轉錄和PCR結合起來建立的一種PCR技術。首先進行反轉錄產生cDNA，然后進行常規PCR。第29頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四cDNA合成 Superscript first-strand synthesis system for RT-PCR 是從總RNA或mRNA合成cDNA。RNA量為1ng5ug。第30頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四Reverse Transcriptase553353351.依賴于RNA的 53 DNA聚合酶活性（反轉錄活性）；2.依賴于DNA的 53 DNA聚合酶活性。第31頁，共86頁，202

13、2年，5月20日，8點13分，星期四Reverse TranscriptaseRNADNADNA3.RNase H 活性：特異性識別并分解RNA-DNA雜交體中的RNA鏈第32頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四RT-PCR 第33頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四用M-MuLV反轉錄酶（RNase H-）進行cDNA第一鏈的合成 RNase H缺陷型莫洛尼氏鼠白血病病毒（M-MuLV）反轉錄酶是一種RNA介導的DNA聚合酶。該酶能以RNA或者單鏈DNA做模板由引物起始合成一個互補的DNA鏈。RNase H活性的缺失增強了該酶合成長鏈cDNA的能力。

14、編碼M-MuLV反轉錄酶的基因在重組大腸桿菌中表達，該酶在其RNase H區域含一點突變，從而使修飾后酶的RNase活性缺失，但反轉錄功能不受影響。第34頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四用M-MuLV反轉錄酶（RNase H-）進行cDNA第一鏈的合成 進行PCR前用Rnase H消化。去除與cDNA結合的RNA，增加PCR敏感性。第一鏈合成過程中RNase H降解模板mRNA，導致全長cDNA合成減少及cDNA第一鏈產量降低。第35頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四cDNA第一鏈的合成有三個方法 （1） Random hexamers：是最非特異

15、性引物。通常在特異全長mRNA難以拷貝時應用此引物。利用該方法，以全部RNA做模板合成cDNA。在PCR時，PCR引物決定其特異性。第36頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四cDNA第一鏈的合成有三個方法（2）oligo（dT）：較特異和常見的方法, 其cDNA的合成數量和復雜性大大低于random hexamers方法,尤其是進行新的mRNA RT-PCR時,建議用此方法.第37頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四cDNA第一鏈的合成有三個方法(3) Gene-specific primer(GSP):最為特異的方法。 利用鄰近mRNA 3末端的PCR

16、引物進行cDNA第一鏈合成,但是,某些GSP即使以DNA為模板,能擴增出DNA條帶.有時,也不能進行cDNA第一條鏈合成.此時建議用oligo（dT）引物.第38頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四cDNA第一條鏈合成步驟第39頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四第40頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四第三部分克隆第41頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四RNA提取純化RT-PCR質粒DNAPCR凝膠回收PCR擴增片段目的基因片段T-A克隆轉化感受態細胞藍白斑篩選質粒提取、酶切鑒定連入GST融合表達載體外源基因克

17、隆到真核表達載體GST融合蛋白表達轉化、活性測定轉染真核細胞表達定位得到目的基因片段的T-A克隆第42頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四PCR片段回收利用從瓊脂糖凝膠中回收純化DNA片段的試劑盒。試劑盒采用了獨特的凝膠融解系統，結合DNA制備膜技術，具有高效快速的特點。本試劑盒純化DNA片段純度高，完整性好。可直接用于連接反應，PCR擴增。 第43頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四第44頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四T-A克隆經Taq DNA聚合酶擴增后的PCR產物末端都帶有單個A。正是基于這一原理，pGEM-T質粒經Eco

18、R V切成平端后，在開口端加上一個T制成T載體，一方面避免了自身環化，另一方面由于T-A互補，提高了T載體與PCR產物之間的連接效率。 第45頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四第46頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四第47頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四T-Vector第48頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四轉化感受態細胞 轉化過程所用的受體細胞：限制修飾酶系統缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變體（R，M）。它可以容忍外源DNA分子進入體內并穩定地遺傳給后代。受體細胞經過一些特殊方法（如電擊

19、法，CaCl2）處理后，細胞膜的通透性發生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進入的感受態細胞（Competent cells）。第49頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四轉化感受態細胞 進入受體細胞的DNA分子通過復制，表達實現遺傳信息的轉移，使受體細胞出現新的遺傳性狀。將經過轉化后的細胞在篩選培養基中培養，即可篩選出轉化子（Transformant），即帶有異源DNA分子的受體細胞。 第50頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四T-Vector第51頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四進行藍白篩選，對陽性克隆進行擴增 IPTG

20、(異丙基-半乳糖苷）是-半乳糖苷酶活性的誘導物,可使lacZ 阻抑物失活，從而誘導lac操縱子轉錄。基于這個特性,當PUC系列載體以lacZ缺欠細胞作為宿主進行轉化時, 如果在培養基中加入X-Gal和IPTG,由于-半乳糖苷酶的-互補性,可以根據是否呈現白色而方便的選擇出基因重組體.第52頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四進行藍白篩選，對陽性克隆進行擴增 X-gal: (5-溴-4氫-3-吲哚-D-半乳糖苷) X-gal是E.Coli產生的-半乳糖苷酶的顯色底物。-半乳糖苷酶可將X-gal轉變為不溶性的深藍色沉淀。第53頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星

21、期四進行藍白篩選，對陽性克隆進行擴增 雙鏈pGEM-T質粒，有一個復制起點，一個氨芐青霉素抗性基因和一個多克隆位點，多克隆位點處于表達LacZ基因產物-半乳糖苷酶的氨基端片段。用質粒轉化LacZ基因突變的大腸桿菌株（JM109或DH5）時，因為由質粒表達的-肽補充了大腸桿菌缺失的-肽，所以恢復了分解半乳糖的能力。第54頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四進行藍白篩選，對陽性克隆進行擴增 在加入IPTG和X-gal的培養基上，長出藍色克隆。如果在多克隆位點內插入外源DNA，由于它破壞了-肽的表達，因而在加入IPTG和X-gal的培養基，不能長出藍色克隆，這就是所謂的藍白篩選。

22、第55頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四質粒的提取及酶切鑒定第56頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四第57頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四第四部分：外源基因的原核表達第58頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四外源基因的原核表達 外源基因的表達是研究和探索基因功能、基因表達調控機制以及編碼蛋白質的結構和功能的重要方法，亦是制備和生產新型蛋白質藥物、新型診斷試劑必不可少的手段。外源基因通過在宿主細胞中的表達可大量獲得其產物。 第59頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四一、原核表達系統常用的載

23、體及其應用 （一）大腸桿菌表達系統 （二）大腸桿菌載體的表達方式 第60頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四大腸桿菌表達系統 大腸桿菌表達系統是目前應用最廣泛的經典表達系統。優點：遺傳背景清晰、目的基因表達水平高、培養周期短等；第61頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四大腸桿菌表達系統 缺點：缺少真核生物的蛋白翻譯后修飾和加工過程，如剪切、糖基化及正確二硫鍵的形成等；表達的蛋白質多以包含體形式存在，需經復性才能恢復構象與活性；宿主本身雜蛋白多，純化步驟復雜。第62頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四大腸桿菌載體的表達方式 1非融合性表

24、達載體：此種載體表達的蛋白質與天然狀態下存在的蛋白質在結構、功能和免疫源性等方面基本或完全一致。第63頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四大腸桿菌載體的表達方式 2融合表達載體：分子量較小的蛋白質可采用這種載體進行表達。優點：可增加mRNA和表達產物的穩定性；可應用針對融合蛋白中非目的蛋白片段進行親和層析，很容易將融合蛋白純化；通過融合表達可產生可溶性蛋白；第64頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四大腸桿菌載體的表達方式 融合表達載體主要有以下幾種：谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）系統；-半乳糖苷酶系統；麥芽糖結合蛋白（MBP）系統；蛋白A系統；與純化標簽

25、融合表達以及其他融合系統。第65頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四大腸桿菌載體的表達方式 3帶純化標簽的表達載體：目前應用較多的純化標簽有GST-tag, FLAG-tag, His-tag.4分泌型表達載體5表面展示表達載體6帶分子伴侶的表達載體第66頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四外源基因的原核表達載體構建及轉化第67頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四擴增陽性克隆并進行誘導表達 pGEX-5x-1載體帶有IPTG（異丙基-D-硫代半乳糖苷）誘導啟動子，可以表達外源蛋白的總量可以達到全菌蛋白的30%以上。 第68頁，共86頁

26、，2022年，5月20日，8點13分，星期四SDS電泳 將含有目標蛋白的樣品用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）分離。利用濃縮膠和分離膠的濃縮效應，電荷效應和分子篩效應對不同分子量大小的蛋白質進行分離。 第69頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四第70頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四Western BlotGST-Pro-BGST第71頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四RNA提取純化RT-PCR質粒DNAPCR凝膠回收PCR擴增片段目的基因片段T-A克隆轉化感受態細胞藍白斑篩選質粒提取、酶切鑒定連入GST融合表達載體外源基因克

27、隆到真核表達載體GST融合蛋白表達轉化、活性測定轉染真核細胞表達定位得到目的基因片段的T-A克隆第72頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四Northern印跡雜交是用于檢測和量化細胞RNA的一種基本技術。它主要是將電泳凝膠中的RNA轉移到尼龍膜上，通過紫外交聯作用而使RNA與膜永久的結合在一起，固定在膜上的RNA樣品與特異的探針雜交，從而對感興趣的RNA進行定位。 Northern印跡雜交 第73頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四Northern印跡雜交 一、DNA探針標記 在核酸分子雜交中，探針是指用放射性核素或其他標記物標記的核酸片段，它具有特定的序列，能夠和待測的核酸片段互補結合，因此可用于檢測核酸樣品中的特定基因。第74頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四Northern印跡雜交 一、DNA探針標記 用于探針標記的標記物有放射性核素與非放射性核素兩大類，前者是目前最常用的標記方式；后者包括生物素、地高辛及熒光素等。第75頁，共86頁，2022年，5月20日，8點13分，星期四Northern印跡雜交 一、DNA探針標記核酸探針的標記方法：1.切口平移法2.隨機引物法 這是近年來發展起來的較為理想的核酸探