1、關于基因工程的操作步驟第1頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四基因工程的基本操作程序1.目的基因的獲取2.基因表達載體的構建3.將目的基因導入受體細胞4.目的基因的檢測與鑒定第2頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四第3頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四知識點一：1.原核細胞的基因結構非編碼區非編碼區編碼區編碼區上游 編碼區下游 與RNA聚合酶結合位點啟動子終止子啟動子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉錄。終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動，

2、并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉錄終止。RNA聚合酶:能夠識別啟動子上的結合位點并與其結合的一種蛋白質.(以模板轉錄然后脫落)第4頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四不能轉錄為信使RNA，不能編碼蛋白質。能轉錄相應的信使RNA，能編碼蛋白質 編碼區非編碼區原核細胞的基因結構有調控遺傳信息表達的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區上游的RNA聚合酶結合位點。非編碼區非編碼區編碼區編碼區上游 編碼區下游 啟動子終止子第5頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四第6頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四能夠編碼蛋白質的序列叫做外顯子

3、不能夠編碼蛋白質的序列叫做內含子編碼區非編碼區非編碼區與RNA聚合酶結合位點內含子 外顯子 啟動子終止子編碼區上游 編碼區下游 內含子： 外顯子： 知識點一：2.真核細胞的基因結構第7頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四真核細胞的 基因結構編碼區非編碼區外顯子：能編碼蛋白質的序列內含子：不能編碼蛋白質的序列有調控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區上游的RNA聚合酶結合位點等。非編碼序列：包括非編碼區和內含子編碼區非編碼區非編碼區與RNA聚合酶結合位點內含子 外顯子 啟動子終止子編碼區上游 編碼區下游 第8頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四原核細胞真核細胞

4、不同點編碼區是_的編碼區是間隔的、_的相同點都由能夠編碼蛋白質的_和具有調控作用的_區組成的原核細胞與真核細胞的基因結構比較思考編碼相同數目氨基酸的蛋白質，原核細胞與真核細胞基因結構一樣長嗎？連續不連續編碼區非編碼第9頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構建3、將目的基因導入受體細胞4、目的基因的檢測與鑒定知識點二.基因工程基本操作的四個步驟第10頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四第11頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四一、獲取目的基因1.獲取目的基因的途徑 A.從自然界已有的物種中分離 B.人

5、工合成2.獲取目的基因的方法 A.從基因文庫中獲取 B.利用PCR技術擴增 C.利用化學方法人工合成目的基因主要是_編碼蛋白質的結構基因第12頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四一、目的基因的獲取（一）從基因文庫中直接獲取1.基因文庫：概念見P92.基因文庫的分類:按外源DNA片段的來源分類種類基因組DNA文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因， 如：cDNA文庫3.基因文庫的目的為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。4.獲取目的基因的根據：見課本P9第13頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四提取某種生物的

6、全部DNA用適當的限制酶切一定大小的DNA片段將DNA片段與載體連接導入受體菌中儲存基因組文庫5.基因文庫的構建方法之一（1）直接分離法(鳥槍法)第14頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四cDNA合成過程 第一步，反轉錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。 5.基因文庫的構建方法之第15頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四基因組文庫和部分基

7、因組文庫(cDNA文庫)比較第16頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四 概念：PCR全稱為_，是一項在生物_復制_的核酸合成技術 聚合酶鏈式反應體外特定DNA片段原理：DNA復制2、利用PCR技術擴增目的基因第17頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四四種脫氧核苷酸(dNTP) 一對引物：熱穩定DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA( 需含有目的基因 ) Mg2+(激活劑)條件：緩沖溶液一對寡核苷酸序列：與目的基因的起始段互補一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據這一序列合成引物前提：第18頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四利用PCR技術

8、擴增目的基因原理:DNA雙鏈復制前提:要有一段已知目的基因的脫氧核苷酸序列，以便合成引物。第19頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四 過程高溫變性（解旋為單鏈）低溫退火（引物與單鏈互補結合）適溫延伸（在Taq酶的作用下合成 與模板互補的DNA雙鏈）重復循環預變性（增加DNA變性的概率）第20頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四2、具體過程第21頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四PCR(多聚酶鏈式反應)第22頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四 概念：PCR全稱為_，是一項在生物_復制_的核酸合成技術 條件：_、

9、_、_ 、 _.等原理：_方式：以_方式擴增，即_（n為擴增循 環的次數）結果：聚合酶鏈式反應體外特定DNA片段DNA復制四種脫氧核苷酸一對引物DNA聚合酶指數2n使目的基因的片段在短時間內成百萬倍地擴增要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提條件）第23頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四過程：a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板 在熱作用下，_斷裂，形成_b、退火（復性55-65）：系統溫度降低，引 物與DNA模板結合，形成局部_。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的_。 氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈第24頁，共46頁，2022年，5月20

10、日，8點15分，星期四PCR技術擴增與DNA復制的比較PCR技術DNA復制相同點原理原料條件不同點解旋方式場所酶結果堿基互補配對四種脫氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復制細胞核內熱穩定的DNA聚合酶細胞內的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個DNA分子第25頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四目的基因的mRNA單鏈DNA (cDNA）雙鏈DNA(即目的基因)反轉錄合成1）反轉錄法： 以目的基因轉錄成的信使RNA為模板，反轉錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結構基因的核苷酸

11、序列目的基因推測推測化學合成2）根據已知的氨基酸序列合成DNA法 ：3、人工合成的目的基因第26頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四二、基因表達載體的構建 基因工程的核心1、目的：所需物質：使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發揮作用。第27頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四2、基因表達載體的組成：復制原點+目的基因+啟動子+終止子+標記基因第28頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRN

12、A，最終獲得蛋白質終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉錄標記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來第29頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四載體與表達載體的區別：二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結構用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。注意第30頁，共46頁，2022年，5月

13、20日，8點15分，星期四三、將目的基因導入受體細胞-植物細胞農桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數單子葉植物沒有感染能力第31頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四將目的基因導入受體細胞-動物細胞顯微注射法第32頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四將目的基因導入受體細胞-微生物細胞Ca2+處理 使細胞處于一種能吸收周圍環境中的DNA-感受態細胞第33頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四四、目的基因的檢測與鑒定檢測:是否插入目的基因（DNA分子雜交技術）是否轉錄（mRNA分子雜交技術）是否翻譯（抗原抗體雜交

14、技術）鑒定:功能活性鑒定抗性鑒定分別提取什么進行檢測歸納步驟第34頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四DNA分子雜交示意圖 采用一定的技術手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結合在一起，形成雜合雙鏈區；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。 第35頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四歸納: 基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學方法人工合成構建基因表達載體目的基因、啟動子、終止子、標記基因將目的基因導入受體細胞農桿菌轉化法、顯微注射法目的基因的檢測與鑒定檢測：

15、是否插入、轉錄、翻譯第36頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四第37頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四基因操作的基本步驟第38頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四基因操作的基本步驟第39頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四練習1：(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產量，黃河三角洲等鹽堿地的開發利用備受關注。我國科學家應用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構建重組DNA分子所用的限制性內切酶作用于圖中的 處，DNA連接酶作用于 處。（填“a”或“b”）aa第40頁，共46頁，202

16、2年，5月20日，8點15分，星期四練習1：(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產量，黃河三角洲等鹽堿地的開發利用備受關注。我國科學家應用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（2）將重組DNA分子導入水稻受體細胞的常用方法有農桿菌轉化法和 法。（3）由導入目的基因的水稻細胞培養成植株需要利用 技術，該技術的核心是 和 。（4）為了確定耐鹽轉基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標記的 作探針進行分子雜交檢測，又要用 方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。基因槍法（花粉管通道法）植物組織培養脫分化和再分化耐鹽基因一定濃度鹽水澆灌第41頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四1）以下說法正確的是 （ ） A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列 B、質粒是基因工程中唯一的運載體 C、運載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接 D、基因控制的性狀都能在后代表現出來C練習第42頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四2）不屬于質粒被選為基因運載體的理由是 A、能復制 （ ） B、有多個限制酶切點 C、具有標記基因 D、它是環狀DNAD練習第43頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四3）有關基因工程的敘述中，錯誤的是（ ） A、