1、同濟(jì)大學(xué)2016屆博士/碩士研究生畢業(yè)答辯會(huì)辛伐他汀/TGF-1緩釋支架的構(gòu)建及其對牙髓細(xì)胞作用的研究匯報(bào)人：湯敏 導(dǎo) 師：趙守亮 教授專 業(yè)：牙體牙髓病學(xué) 2016.5.25研究內(nèi)容Research Work臨床病例Clinical Cases結(jié)果結(jié)論Conclusions研究背景Research Background研究背景組織工程 研究背景靜電紡絲 研究背景辛伐他汀辛伐他汀降血脂免疫調(diào)節(jié)促血管生成抗炎辛伐他汀促進(jìn)成骨牙源性細(xì)胞藥物濃度高殺傷細(xì)胞藥物濃度低促成牙1Baigent C, Landray MJ, Reith C et al. The effects of lowering LD

2、L cholesterol with simvastatin plus ezetimibe in patients with chronic kidney disease (Study of Heart and Renal Protection): a randomised placebo-controlled trial. Lancet,2011, 377(9784): 2181-2192.2Chen PY, Sun JS, Tsuang YH et al. Simvastatin promotes osteoblast viability and differentiation via R

3、as/Smad/Erk/BMP-2 signaling pathway. Nutr. Res.,2010, 30(3): 191-199.3Mihaylova B, Emberson J, Blackwell L et al. The effects of lowering LDL cholesterol with statin therapy in people at low risk of vascular disease: meta-analysis of individual data from 27 randomised trials. Lancet,2012, 380(9841):

4、 581-590.4Maeda T, Matsunuma A, Kawane T, Horiuchi N. Simvastatin promotes osteoblast differentiation and mineralization in MC3T3-E1 cells. Biochem. Biophys. Res. Commun.,2001, 280(3): 874-877.研究背景自組裝技術(shù)Srivastava S, Kotov NA. Composite Layer-by-Layer (LBL) Assembly with Inorganic Nanoparticles and N

5、anowires. Accounts Chem. Res.,2008, 41(12): 1831-1841.研究背景共緩釋體系構(gòu)想辛伐他汀 脂溶性濃度依賴性TGF-1 易失活 難靶向PCL/辛伐他汀靜電紡絲共紡(TGF-1/海藻酸鈉)/殼聚糖自組裝于膜 表面辛伐他汀低劑量長效緩釋TGF-1活性保存，長效緩釋辛伐他汀/TGF-1共同緩釋作用？ TGF-1+辛伐他汀=促增殖促礦化雙效？研究目的1.構(gòu)建辛伐他汀/TGF-1緩釋支架，檢測其對牙髓細(xì)胞增殖的影響2.探討辛伐他汀/TGF-1緩釋支架對牙髓細(xì)胞礦化能力的影響實(shí)驗(yàn)部分實(shí)驗(yàn)1：辛伐他汀/PCL緩釋支架的制備及性能評(píng)估實(shí)驗(yàn)2：辛伐他汀/TGF-1

6、共緩釋支架的構(gòu)建及性能評(píng)估實(shí)驗(yàn)3：辛伐他汀/TGF-1緩釋支架對牙髓細(xì)胞礦化能力的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)1：辛伐他汀/PCL緩釋支架的制備及性能評(píng)估圖1 掃描電鏡下纖維膜形貌 a：PCL膜，b：PCL/SIM膜圖2 示PCL/SIM紡絲膜體外釋藥曲線（n=4）實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)1：辛伐他汀/PCL藥物緩釋支架的制備及性能評(píng)估圖3 rDPCs在PCL及PCL/SIM兩種電紡膜浸提液作用下的生長檢測（n=5）PCL材料具有較高的生物安全性；載藥支架具有持續(xù)低濃度緩釋效果結(jié)果討論實(shí)驗(yàn)1：辛伐他汀/PCL藥物緩釋支架的制備及性能評(píng)估靜電紡絲的關(guān)鍵taylor錐形成調(diào)整參數(shù)：電壓、流速、溶液濃度、相對空氣濕度紡絲條

7、件：8wt%的濃度比重，17kv電壓，0.6ml/h， 20-30%相對空氣濕度辛伐他汀的安全有效緩釋濃度通過紫外分光光度法及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，探索構(gòu)建安全有效緩釋效果的載藥支架，最終選定4.2gSIM/mgPCL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)2：辛伐他汀/TGF-1共緩釋支架的構(gòu)建及性能評(píng)估圖4 分別檢測CS、ALG組裝液，TGF-1純水溶液中各組裝成分的電勢實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)2：辛伐他汀/TGF-1共緩釋支架的構(gòu)建及性能評(píng)估圖5 PCL、PCL/SIM支架組裝前后，水接觸角檢測a-1、b-1：PCL、PCL/SIM 組裝前；a-2、b-2：組裝后PCL、PCL/SIM支架圖6 經(jīng)CS/ALG組裝后的纖維表面形貌，a

8、：PCL+CS/(ALG/TGF-1)b：PCL/SIM+CS/(ALG/TGF- 1)實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)2：辛伐他汀/TGF-1共緩釋支架的構(gòu)建及性能評(píng)估圖7 PCL+CS/(ALG/TGF-1)支架中TGF-1累積緩釋量曲線圖8 四組支架對rDPCs增殖影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)2：辛伐他汀/TGF-1共緩釋支架的構(gòu)建及性能評(píng)估圖9 rDPCs與四種支架復(fù)合培養(yǎng)后的形貌，a：PCL a-1：PCL+CS/(ALG/TGF-1) b：PCL/SIM b-1： PCL/SIM+CS/(ALG/TGF-1)結(jié)果討論實(shí)驗(yàn)2：辛伐他汀/TGF-1共緩釋支架的構(gòu)建及性能評(píng)估TGF-1Layer by layer se

9、lf-assembly生長因子（BMP-2，TGF-等） 辛伐他汀/TGF-1緩釋支架可促進(jìn)牙髓細(xì)胞增殖。且支架呈親水性，利于細(xì)胞粘附、遷移。TGF-1具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用He, H.X., et al., Effects of FGF2 and TGF beta(1) on the differentiation of human dental pulp stem cells in vitro. Cell Biology International, 2008. 32(7): p. 827-834自組裝緩釋系統(tǒng)Kim S, Kang YQ, Krueger CA et al. Sequen

10、tial delivery of BMP-2 and IGF-1 using a chitosan gel with gelatin microspheres enhances early osteoblastic differentiation. Acta Biomater.,2012, 8(5): 1768-1777.實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)3：辛伐他汀/TGF-1緩釋支架對牙髓細(xì)胞礦化能力的影響圖10 四組支架對rDPCs的ALP活性影響圖11 鏡下觀察rDPCs誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后的ALP染色情況（圖中Bar=100m）實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)3：辛伐他汀/TGF-1緩釋支架對牙髓細(xì)胞礦化能力的影響圖12 顯微鏡下

11、觀察各實(shí)驗(yàn)組礦化結(jié)節(jié)形成情況，a：組，b：+組，c：TGF-1緩釋組，d：SIM緩釋支架組，e：TGF-1/SIM緩釋支架組（圖中Bar=100m）圖13 肉眼觀察各組rDPCs培養(yǎng)誘導(dǎo)14天后茜素紅染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)3：辛伐他汀/TGF-1緩釋支架對牙髓細(xì)胞礦化能力的影響圖14 礦化誘導(dǎo)rDPCs3，5天后qRT-PCR檢測DMP-1、DSPP、Runx2的mRNA表達(dá)情況結(jié)果討論實(shí)驗(yàn)3：辛伐他汀/TGF-1緩釋支架對牙髓細(xì)胞礦化能力的影響他汀類藥物抑制合成HMG-CoA還原酶降低膽固醇合成，降血脂抑制合成FPP、GGPP等異戊二烯中間體抑制合成抑制異戊二烯合成，藥物呈多效性Rho相關(guān)酶促進(jìn)合

12、成BMP-2、OCN，促進(jìn)成骨TGF-1促進(jìn)合成？Ohnaka, K, et al., Pitavastatin enhanced BMP-2 and osteocalcin expression by inhibition of Rho-associated kinase in human osteoblasts. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2001. 287(2): p. 337-342.研究結(jié)論 辛伐他汀/TGF-1共緩釋系統(tǒng)作用于牙髓細(xì)胞，可促進(jìn)其增殖，抑制其礦化能力，提示了TGF-1與辛伐他汀之間對牙髓細(xì)

13、胞礦化能力有拮抗作用。臨床病例病例1病例1 .左下第二磨牙隱裂根管治療 毛某 ，男 ，59歲， 漢族 主 訴：左下后牙疼痛三日 口腔檢查：37 牙合 面近遠(yuǎn)中向可見明顯裂紋，裂紋越過邊緣嵴至鄰面，無牙體缺損，牙齦 色粉紅，無牙周袋，黏膜無異常，叩痛（+），松動(dòng)（0），冷痛。 輔助檢查：X線片根尖片顯示37根尖無低密度陰影 診 斷：1牙隱裂（37） 2急性牙髓炎（37） 臨床病例病例2病例2 .左上第二磨牙根管治療徐某，女，44歲。主 訴：左上后牙疼痛月余口腔檢查：27遠(yuǎn)中鄰牙合面大面積齲壞，探痛，冷痛（+），叩痛（+）。輔助檢查：X線片顯示27遠(yuǎn)中鄰面頸部齲壞近髓，根尖陰影？。診 斷：慢性根尖周炎（27）臨床病例病例3病例3 .右下第一磨牙根管治療王某，女，24歲。主 訴：本院口腔外科轉(zhuǎn)診，要 求行根管治療口腔檢查：46頰 牙合 面大面積齲 壞，露髓，探痛，冷痛 （+），叩痛（-）, 松動(dòng)度（0）。診 斷：慢性牙髓炎（46）臨床病例病例4病例4 .左下第二磨牙根管治療徐某 男 40歲 漢族主 訴：左下后牙蛀牙求補(bǔ)口腔檢查：37牙合面大面積缺損，髓室頂穿通，根管口暴露，牙冠變色，牙齦色粉紅，無 牙周袋，黏膜無異常，叩痛（+），松動(dòng)（