1、從細菌中分離質粒DNA的具體操作材料、設備及試劑一、材料含PBS的E.coliDH5 a或JM系列菌株，1.5ml塑料離心管(又稱 eppendorf管)，離心管架。二、設備微量取液器(20p l，200p 1，1000p l),臺式高速離心機，恒溫振 蕩搖床，高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋)， 渦旋振蕩器,電泳儀，瓊脂糖平板 電泳裝置和恒溫水浴鍋等。三、試劑1、LB 液體培養基(Luria-Bertani ):稱取蛋白胨(Tryptone) 10g， 酵母提取物(Yeas tex tract )5g，NaCl10g，溶于800ml去離子水中，用NaOH 調pH至7.5，加去離子水至總體積1升，高壓下

2、蒸氣滅菌20分鐘。2、 LB固體培養基：液體培養基中每升加12g瓊脂粉，高壓滅菌。3、 氨芐青霉素(Ampicillin，Amp )母液：配成50mg/ml水溶液，-20C 保存備用。4、溶菌酶溶液：用10mmol/LTrisCl( pH8.0 )溶液配制成10mg/ml， 并分裝成小份(如1.5ml )保存于-20C，每一小份一經使用后便予丟棄。5、3mol/lNaAc (pH5.2 ) : 50ml 水中溶解 40.81gNaAc3H20，用冰醋 酸調pH至5.2，加水定容至100ml，分裝后高壓滅菌，儲存于4C冰箱。6、溶液 1:50mmol/L 葡萄糖，25mmol/ L T r i

3、s. Cl (pH8.0 )， 10mmol/LEDTA ( pH8.0 )。溶液I可成批配制，每瓶100ml，高壓滅菌15分 鐘，儲存于4C冰箱。7、 溶液II： 0.2mol/LNaOH (臨用前用 10mol/LNaOH 母液稀釋)，1 % SDS。8、溶液III： 5mol/LKAc60ml，冰醋酸 11.5ml，H2O28.5ml，定容至 100ml， 并高壓滅菌。溶液終濃度為：K+3mol/L，Ac5mol/L。9、RNA 酶 A 母液：將 RNA 酶 A 溶于 lOmmol/LTrisCl( pH7.5 )， 15mmol/LNaCl 中，配成 10mg/ml的溶液，于100C加

4、熱15分鐘，使混有的DNA酶失活。冷卻后用 1.5mleppendorf管分裝成小份保存于-20C。10、飽和酚：市售酚中含有醌等 氧化物，這些產物可引起磷酸二酯鍵 的斷裂及導致RNA和DNA的交聯，應在160C用冷凝管進行重蒸。重蒸酚加 入0.1 %的8-羥基喹啉(作為抗氧化劑)，并用等體積的0.5mol/LTrisCl(pH8.0 ) 和 O.lmol/LTrisCl( pH8.0 )緩沖液反復抽提使之飽和并使其 pH值達到7.6以上，因為酸性條件下DNA會分配于有機相。11、氯仿：按氯仿：異戊醇二24: 1體積比加入異戊醇。氯仿可使蛋白 變性并有助于液相與有機相的分開，異戊醇則可起消除抽

5、提過程中出現的 泡沫。按體積/體積二1： 1混合上述飽和酚與氯仿即得酚/氯仿(1：1 )。酚和氯仿均有很強的腐蝕性，操作時應戴手套。12、TE 緩沖液：10mmo/LTrisCl( pH8.0 ) , 1mmol/LEDTA (pH8.0 )。 高壓滅菌后儲存于4C冰箱中。13、STET : 0.1mol/LNaCl , 10mmol/LTrisCl( pH8.0 ) , 10mmol/LEDTA (pH8.0 ) , 5%TritonX-100。14、STE: 0.1mol/LNaCl ,10mmol/LTrisCl( pH8.0 ) , 1mmol/LEDTA (pH8.0 )。15、電泳

6、所用試劑：(1)TBE緩沖液(5X):稱取Tris54g ,硼酸27.5g , 并加入 0.5MEDTA (pH8.0 ) 20ml，定溶至 1000ml。(2)上樣緩沖液(6X)： 0.25%溴酚藍，40% (w/v)蔗糖水溶液。操作步驟一、細菌的培養和收集將含有質粒pBS的DH5 a菌種接種在LB固體培養基(含50 p g/mlAmp ) 中，37C培養12-24小時。用無菌牙簽挑取單菌落接種到 5mlLB液體培養 基(含50p g/mlAmp )中，37C振蕩培養約12小時至對數生長后期。二、質粒DNA少量快速提取質粒DNA小量提取法對于從大量轉化子中制備少量部分純化的質粒DNA十分有用

7、。這些方法共同特點是簡便、快速，能同時處理大量試樣，所得 DNA有一定純度，可滿足限制酶切割、電泳分析的需要。、煮沸法1、將1.5ml培養液倒入eppendorf管中，4C下12000 g離心30秒。2、棄上清，將管倒置于衛生紙上幾分鐘，使液體流盡。3、將菌體沉淀懸浮于120mlSTET溶液中，渦旋混勻。4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml )，渦旋振蕩3秒鐘。5、將eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。6、用微量離心機4C下12000g離心10分鐘。7、用無菌牙簽從eppendorf管中去除細菌碎片。8、取20ml進行電泳檢查。注意1.對大腸桿菌可從固體培養基上挑

8、 取單個菌落直接進行煮沸法 提取質粒DNA。2.煮沸法中添加溶菌酶有一定限度，濃度高時，細菌裂解效 果反而不好。有時不同溶菌酶也能溶菌。3.提取的質粒DNA中會含有RNA, 但RNA并不干擾進一步實驗，如限制性內切酶消化，亞克隆及連接反應等。、堿法1、取1.5ml培養液倒入1.5mleppendorf 管中，4C下12000g離心30 秒。2、棄上清，將管倒置于衛生紙上數分鐘，使液體流盡。3、菌體沉淀重懸浮于100卩l溶液I中（需劇烈振蕩），室溫下放置 5-10分鐘。4、 加入新配制的溶液II200卩l，蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf 管數次，以混勻內容物（千萬不要振蕩），冰浴 5分

9、鐘。5、加入150p l預冷的溶液III，蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩 10秒，使沉淀混勻，冰浴中5-10分鐘，4C下12000g離心5-10分鐘。6、上清液移入干凈eppendorf管中，加入等體積的酚/氯仿（1:1）， 振蕩混勻，4C下12000g離心5分鐘。7、將水相移入干凈eppendorf管中，加入2倍體積的無水乙醇，振蕩 混勻后置于-20C冰箱中20分鐘，然后4C下12000g離心10分鐘。8、 棄上清，將管口敞開倒置于衛生紙上使所有液體流出，加入1ml70 % 乙醇洗沉淀一次，4C下12000g離心5-10分鐘。9、 吸除上清液，將管倒置于衛生紙上使液體流盡，真空干燥10分鐘

10、 或室溫干燥。10、將沉淀溶于20p lTE緩沖液（pH8.0，含20p g/mlRNaseA ）中，儲 于-20C冰箱中。注意1.提取過程應盡量保持低溫。2.提取質粒DNA過程中除去蛋白 很重要，采用酚/氯仿去除蛋白效果較單獨用酚或氯仿好，要將蛋白盡量除 干凈需多次抽提。3.沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低溫條件下放置時間稍 長可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用異丙醇（一般使用等體積），且沉 淀完全，速度快，但常把鹽沉淀下來，所以多數還是用乙醇。（三）、Wizard少量DNA純化系統Promega公司的Wizard少量DNA純化系統可快速有效的抽提質粒 DNA， 整個過程只需15分鐘。提取的

11、質粒可直接用于DNA測序、酶切分析和體外 轉錄等。該系統中所含試劑和柱子可以用于 50次1-3ml質粒培養液的分離 和純化，試劑包括10ml細胞懸浮液，10ml細胞裂解液；10ml中和液， 50mlWizard少量DNA純化樹脂，50ml柱洗液（使用前加95%乙醇至120ml ） 和50支Wizard微型柱。1、1-3ml過夜培養細胞液4C下12000g離心1-2分鐘。2、去除上清液，菌體細胞懸浮于200p l細胞懸浮液中，充分混合， 并移入eppendorf管中。3、加200p l細胞裂解液，顛倒離心管數次，直到溶液變清亮。4、加200p l中和液，顛倒離心管數次。5、4C下12000g離心

12、5分鐘，取上清液于新的eppendorf管中。6、加1mlWizard少量DNA純化樹脂，顛倒離心管數次以充分混勻。7、取一次性注射器，取出注塞，并使注射筒與Wizard微型柱連接， 用移液槍將上述混合液加入注射筒中，并用注塞輕推，使混合物進入微型 柱。8、將注射器與微型柱分開，取出注塞，再將注射筒與微型柱相連，加 入2ml柱洗液，并用注塞輕推，使柱洗液進入微型柱。9、取出微型柱置于eppendorf管中，離心2分鐘以除去微型柱中的柱 洗液。10、將微型柱放在一個新eppendorf管中，加50“ 1TE （或水）于微型 柱中，靜止1分鐘后，4C下12000g離心20秒。11、丟棄微型柱，將e

13、ppendorf管中的質粒DNA貯于4C或-20C冰箱。 注意樹脂使用前應充分混勻，如有結晶，可將樹脂用 25- 37C水浴處理10分鐘。三、質粒DNA的大量提取和純化在制作酶譜、測定序列、制備探針等實驗中需要高純度、高濃度的質 粒DNA，為此需要大量提取質粒DNA。大量提取的質粒DNA 一般需進一步純 化，常用柱層析法和氯化絕梯度離心法。（一）、堿法1、取培養至對數生長后期的含pBS質粒的細菌培養液250ml，4C下 5000g離心15分鐘，棄上清，將離心管倒置使上清液全部流盡。2、將細菌沉淀重新懸浮于50ml用冰預冷的STE中（此步可省略）。3、同步驟1方法離心以收集細菌細胞。4、將細菌沉

14、淀物重新懸浮于5ml溶液I中，充分懸浮菌體細胞。5、加入12ml新配制的溶液II，蓋緊瓶蓋，緩緩地顛倒離心管數次， 以充分混勻內容物，冰浴10分鐘。6、加9ml用冰預冷的溶液III，搖動離 心管數次以混勻內容物，冰上放置15分鐘，此時應形成白色絮狀沉淀。7、4C下5000g離心15分鐘。8、取上清液，加入50mlRNA酶A （10mg/ml ），37C水浴20分鐘。9、加入等體積的飽和酚/氯仿，振蕩混勻，4C下12000g離心10分鐘。10、 取上層水相，加入等體積氯仿，振蕩混勻，4C下12000g離心 10 分鐘。11、取上層水相，加入1/5體積的4mol/LNaCl和10%PEG（分子量6

15、000 ）, 冰上放置60分鐘。12、4C下12000g離心15分鐘，沉淀用數ml70%冰冷乙醇洗滌，4C下 12000g離心5分鐘。13、真空抽干沉淀，溶于500mlTE或水中。注意1.提取過程中應盡量保持低溫。2.加入溶液II和溶液III后操 作應混和，切忌劇烈振蕩。3.由于RNA酶A中常存在有DNA酶，利用RNA酶耐熱的特性，使用時應先對該酶液進行熱處理（8OC1小時），使DNA酶失活。（二）、Wazard大量DNA純化系統堿法大量提取DNA往往需要很長的時間.Promega公司的Wiazrd大量 DNA純化系統既簡單又快速，只需要離心和真空抽干，這個系統可以從500ml 培養液中在3小

16、時以內獲得1mg以上的高質量的質粒DNA（200-20000bp）。 該系統不需要酚和氯仿抽提，純化后的 DNA溶于水或TE緩沖液中，不含任 何鹽份，可以直接用于DNA序列分析和酶切反應，也可以用于在 核酸酶抑 制劑（如RNasin ）存在的條件下進行體外轉錄反應等。該系統中含有的試 劑和柱子可以用于10次100-500ml質粒培養液的分離和純化，試劑包括： 150ml細胞懸浮液，150ml細胞裂解液，150ml中和液，lOOmlWizard大量 DNA純化樹脂，125mlWizard柱子洗脫溶液和10支Wizard帶有存儲離心管 的柱子。1、100-500ml細胞培養液置離心管中，22-25

17、C下5000g離心10分鐘， 所得細胞沉淀充分懸浮于細胞懸浮液中。2、加15ml細胞裂解溶液并輕輕混合，可以反復倒置混合，但不能用 渦旋振蕩，細胞裂解完全時，溶液會變清，這一步需要 20分鐘。3、加15ml中和溶液，立即反復倒置離心管數次，并使之混勻。4、14000g，22-25C離心 15 分鐘。5、小心地將上清液吸出并移至一個新離心管中。6、 加0.5倍體積的異丙醇，混合均勻，14000g22- 25C下離心15分鐘。7、棄上清，懸浮DNA沉淀于2mlTE緩沖液中。這一步中也許有的沉淀 不能溶解。8、加10mlWizard大量DNA純化樹脂溶液，并渦旋混合。9、每一個樣品，使用一支Wiza

18、rd大量柱子，柱子的頭插在真空器上（Promega產品，與此配套）。10、將樹脂/DNA混合液轉入柱子中，真空抽取樹脂/DNA混合液。11、將樹脂/DNA混合液抽干后，加13ml柱子洗脫溶液至離心管中，對 管底部的樹脂/DNA進行洗脫（柱子一邊旋轉一邊加入洗脫液），并加入柱 子中。12、真空抽干所加入的洗脫。13、再加12ml柱子洗脫液進柱子并抽干。14、加入5ml80 %乙醇漂洗柱中的樹脂，柱子真空抽干后將柱子放入用 戶提供的離心管中，2500rpm （ 1300g ）離心 5 分鐘。15、取出柱子，真空抽干5分鐘，再將柱子放入系統中所提供的離心 管中，2500rpm （ 1300g ）離心5分鐘。16、在柱子中加入1.5ml65- 70C預熱過的滅菌重蒸水或TE, 1分鐘后 2500rpm （ 1300g ）離心柱子/離心管5分鐘。17、取出柱子，離心管中溶液即為提取的質粒 DNA，可以直接放在離心 管中，蓋上蓋子，儲存在4C或-20C備用。注意1.在使用之前，系統所提供的柱子洗脫液按1: 1加入125ml