1、實(shí)驗(yàn)五轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)1、檢測(cè)外源基因在植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄，對(duì)外源基因表達(dá)調(diào)控進(jìn)行研究，掌握引物的選擇、cDNA的合成、RT-PCR檢測(cè)的原理與方法。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、材料： 轉(zhuǎn)基因植物的RNA或mRNA制備物。 非轉(zhuǎn)化的植株材料總RNA或mRNA制備物2、設(shè)備：PCR儀、移液器、PCR管等。3、試劑：10RT緩沖液、dNTP、逆轉(zhuǎn)錄酶、 引物（隨機(jī)引物，Oligo dT; 特異引物)、 10One Step RNA PCR Buffer、25 mM MgCl2、10 mM dNTP、RNase Inhibitor (40 U/l)、AMV-Optimized Taq1 l、AMV R

2、Tase XL (5 U/l)、上游特異Primer (20 M)*1、下游特異Primer (20 M)*2、RNase Free H2O。實(shí)驗(yàn)材料、設(shè)備及試劑實(shí)驗(yàn)操作步驟：1）RNA提取： 關(guān)鍵 防止RNA降解RNA提取的成功與否是RT-PCR檢測(cè)中最重要的步驟。2、cDNA第一鏈的合成： 取1個(gè)0.2ml的PCR管，依次加入下列試劑：10PCR Buffer 1 l RNase Free dH2O 5.75 l dNTP 1 l RNase Inhibitor 0.25 l AMV RTase Transcriptase 0.5 l oligo dT-Adaptor primer 0.5

3、 l RNA 1l Total 10l實(shí)驗(yàn)步驟反應(yīng)條件： 42 30min 99 5min 5 5min3、PCR反應(yīng)取一個(gè)0.2ml的PCR管，依次加入下列試劑：10PCR Buffer 4 l滅菌蒸餾水 9l 10 mM dNTP .5 lTaq酶 0.1 l 上游特異Primer (20 M)*1 0.2 l下游特異Primer (20 M)*2 0.2l Total 16 l將（1）的反應(yīng)結(jié)果稀釋20倍，取10 l 加入到（2）管中，輕輕搖勻。反應(yīng)條件：94 2min94 30s55 30s 72 1min72 7min30Cycles目前研究轉(zhuǎn)基因植物外源基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的常用方法1、R

4、T-PCR (RNA) 2、Northern blot (RNA) 3、real-time PCR (RNA ） 結(jié)果與分析利用凝膠成像分析儀對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行拍照和結(jié)果記錄；觀察膠上是否有預(yù)擴(kuò)增的主要產(chǎn)物帶。對(duì)比目的基因產(chǎn)物的電泳譜帶分子量和譜帶的特異性，確定和描述譜帶特征。 RT-PCR擴(kuò)增得到的810bp的目的基因產(chǎn)物的電泳結(jié)果1、將實(shí)驗(yàn)結(jié)果粘到實(shí)驗(yàn)報(bào)告上。2、 如何選擇RT-PCR的反轉(zhuǎn)錄引物。3、結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，試論應(yīng)用RT-PCR研究外源基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的優(yōu)缺點(diǎn)。 實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)一、質(zhì)粒三種提取方法的比較為什么要用對(duì)數(shù)期的菌液提取質(zhì)粒 ？因?yàn)閷?duì)數(shù)期菌的 生長(zhǎng)狀況和數(shù)量最佳,有利于提取質(zhì)粒 溶液

5、、溶液的作用？溶液 50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl，pH=8.0 葡萄糖增稠，使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性。這一步溶液中還可以加入RNase，不受EDTA影響，并且可以在后續(xù)步驟中被除去 溶液 0.2M NaOH / 1% SDS 破細(xì)胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。 溶液 3M 醋酸鉀 / 2M 醋酸 這一步的K置換了SDS（十二烷基磺酸鈉）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸鉀）沉淀；SDS易與蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)

6、也沉淀了，同時(shí)基因組DNA也被PDS共沉淀 溶菌酶的作用作用?沸水加熱的作用?利用溶菌酶和TritonX-100破壞細(xì)胞壁,加熱可使蛋白質(zhì)和染色體DNA變性.將實(shí)驗(yàn)電泳結(jié)果粘到實(shí)驗(yàn)報(bào)告上，并對(duì)結(jié)果分析。比較三種提取方法的區(qū)別？實(shí)驗(yàn)二、醋酸鋰法轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞觀察并描述培養(yǎng)狀況，統(tǒng)計(jì)單菌落個(gè)數(shù)。比較酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化與大腸桿菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的區(qū)別。酵母菌屬于真核生物 ,大腸桿菌是細(xì)菌屬于原核生物 .酵母轉(zhuǎn)化在室溫，大腸桿菌轉(zhuǎn)化在冰上酵母轉(zhuǎn)化用醋酸鋰，大腸桿菌轉(zhuǎn)化用氯化鈣酵母轉(zhuǎn)化用穿梭質(zhì)粒，大腸桿菌轉(zhuǎn)化用普通質(zhì)粒穿梭質(zhì)粒是指一類(lèi)人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記，因而可以在兩種不同類(lèi)群宿主中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。 比如說(shuō)通常能夠在哺乳動(dòng)物，酵母或者其他細(xì)菌復(fù)制表達(dá)的質(zhì)粒，同時(shí)可以在大腸桿菌內(nèi)復(fù)制。這樣利于對(duì)質(zhì)粒的分子生物學(xué)操作和大量制備。 實(shí)驗(yàn)三、侵染菌種對(duì)除菌抗生素的敏感性頭孢酶素100200300400500600頭孢唑啉鈉-頭孢哌酮鈉-頭孢曲松鈉-+頭孢噻肟鈉-+-：表示無(wú)抑制作用