1、關于免疫細胞的分離技術第1頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 免疫系統的組成免疫系統免疫器官中樞: 胸腺、骨髓周圍：淋巴結、脾臟、粘膜 相關淋巴組織等免疫細胞：淋巴細胞、單核-巨噬細胞 、 粒細胞、DC、肥大細胞、 NK細胞免疫分子：抗體、補體、細胞因子、MHC、 TCR、粘附分子等第2頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 Innate immunity 固有免疫 定義：人類在種系進化過程中形成的、經遺傳獲得 的免疫，遇病原體后首先并迅速起防衛作 用的免疫應答組成：皮膚、粘膜及其產物、細胞（NK細胞、單 核-吞噬細胞、DC、NKT、中性粒細胞、T 細胞

2、、B1細胞）等特點：先天具有、無潛伏期、無特異性、無記憶性 作用時間：0-96小時第3頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 Adaptive immunity 獲得性(適應性)免疫 定義：機體在生活過程中，因接觸抗原性物質而獲 得的免疫。T、B細胞識別病原體成分后產 生的免疫應答 特點：后天獲得、有潛伏期、特異性，記憶性 參與細胞：T細胞和 B細胞 起作用時間：晚，一般在感染后4-5天發揮作用第4頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四一、免疫細胞的種類與特征第5頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 免疫細胞的分類根據免疫細胞在免疫應答中

3、的作用可分為三類免疫活性細胞(immunocompetent cells)抗原提呈細胞(antigen-presenting cells, APC)其他細胞凡參與免疫應答或與免疫應答有關的細胞，通稱為免疫細胞（immunocyte），其中包括淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、NK細胞、樹突狀細胞DC、肥大細胞、粒細胞等第6頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四第7頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 免疫細胞的起源與分化第8頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四免疫活性細胞具有特異性抗原受體、在接受抗原刺激下發生克隆性活化、增值和分化，產生適

4、應性免疫應答（adaptive immune response)的細胞。這類細胞是機體產生特異性免疫應答的基礎，包括T細胞、B細胞第9頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四抗原提呈細胞（antigen presenting cell, APC）加工處理抗原，將抗原肽提呈給抗原特異性淋巴細胞的一組免疫細胞。血液中主要的APC細胞主要包括單核細胞、樹突狀細胞、B細胞第10頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四其他細胞自然殺傷(NK)細胞，肥大細胞，嗜酸性粒細胞，嗜中性粒細胞，嗜堿性粒細胞，血小板等NK細胞肥大細胞嗜酸性粒細胞嗜中性粒細胞嗜堿性粒細胞血小板第11頁

5、，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四免疫細胞的特征1、免疫細胞的形態學特征 理化性狀 生物學特性第12頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四免疫細胞的特征2、免疫細胞的表面分子特征：白細胞分化抗原指血細胞分化成熟為不同譜系、分化的不同階段以及細胞活化過程中,出現或消失的細胞表面標記分子聚類分化群(分化抗原，cluster of differentiation，CD)：應用單克隆抗體鑒定為主的方法，將來自不同實驗室的單克隆抗體所識別的同一分化抗原稱為CD抗原CD抗原常用于鑒定和檢測淋巴細胞表面標志第13頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四人

6、CD分組分 組 CD（舉例）T細胞 CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD28、CD152(CTLA4)、 CD154(CD40L)、CD272(BTLA)、CD278(ICOS)、CD294(CRTH2)B細胞 CD19、CD20、CD21、 CD40、CD79a(Ig)、CD79b (Ig)、 CD80 (B7-1)、CD86 (B7-2) 、CD267(TACI)、CD268(BAFFR)、 CD269(BCMA)、CD307(IRTA2)髓樣細胞 CD14、CD35(CR1)、CD64 (FcRI)、CD256(APRIL)、 CD257(BAFF)、CD312(EMR2) 血小

7、板 CD36、CD41(整合蛋白IIb)、CD42aCD42d、CD51(整合蛋白v) 、 CD61 (整合蛋白3) 、CD62P(P選凝素)NK細胞 CD16 (FcRIII) 、CD56(NCAM-1)、CD94、CD158(KIR)、 CD161(NKR-P1A)、CD314(NKG2D)、CD335(NKp46)、 CD336(NKp44)、CD337(NKp30) 非譜系 CD30、CD32(FcRII)、CD45RA、CD45RO、CD46(MCP)、 CD55(DAF)、CD59、CD252(OX40L)、 CD279(PD1)、 CD281CD284(TLR1-TLR4)、CD

8、289(TLR9)、 CD305(LAIR-1)、 CD306(LAIR-2)、CD319(CRACC) 第14頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四人CD分組分 組 CD（舉例）黏附分子 CD11a-CD11c、CD15、CD15s(sLx)、CD18 (整合蛋白2) 、 CD29 (整合蛋白1)、CD49aCD49f、CD54(ICAM-1)、 CD62E(E整合蛋白)、CD62L (L整合蛋白)、CD324(E-cadherin)、 CD325(N-cadherin)、CD326(EpCAM)細胞因子/ CD25(IL-2R)、CD95(Fas)、CD116-CDw13

9、7、CD178(FasL)、 趨化因子受體 CD183(CXCR3)、CD184(CXCR4)、CD195(CCR5)、 CD261CD264(TRAIL-R1TRAIL-R4)內皮細胞 CD105(TGF-RIII)、CD106(VCAM-1)、CD140(PDGFR)、 CD144(VE鈣黏蛋白)、CD299(DCSIGN-related)、 CD309(VEGFR2)、JAM1(CD321)、JAM2(CD322) 碳水化合物結構 CD15u、CD60aCD60c、CD75、CDw327CDw329(siglec6、7、9)樹突狀細胞 CD85(ILT/LIR)、CD273(B7DC)、

10、CD274CD276(B7H1-B7H3) 、 CD302(DCL1)、CD303(BDCA2)、CD304(BDCA4)干細胞/祖細胞 CD133、CD243 基質細胞 CD292(BMPR1A)、CD293(BMPR1B)、 CD331CD334(FGFR1FGFR4)、CD339(Jagged-1)紅細胞 CD233CD242 第15頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四二、免疫細胞的分離技術 （一）外周血單個核細胞分離 （二）T淋巴細胞及其亞群的分離 （三）B淋巴細胞及其亞群的分離 （四）Mo/M分離技術 （五） NK細胞的分離技術 第16頁，共76頁，2022年，5

11、月20日，9點50分，星期四免疫細胞分離基本原理 不同細胞密度不同 不同細胞表面生物學特性不同 不同細胞表面分化抗原不同第17頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四根據不同的實驗目的可以采取下列不同的分離方法免疫細胞的分離技術1、密度梯度離心法2、黏附分離法（尼龍毛法、貼壁法、親和板法）3、磁性分離法4、熒光激活分離法5、其他分離法（花環沉降法）第18頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四（一）外周血單個核細胞分離 外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）包括淋巴細胞和單核細 胞 Ficoll分離液

12、法主要用于分離外周血中的單個核細 胞，是根據不同細胞密度不同的分離法第19頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四不同細胞密度不同 單個核細胞（淋巴細胞和單核細胞）的密度 為1.077左右 人的紅細胞密度為1.093，1.077 粒細胞密度為1.092， 1.077 血小板密度 1.077 第20頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四肝素抗凝靜脈血與等量Hanks液或PBS混勻沿管壁緩慢疊加于Ficoll分層液面上水平離心2000 rpm 20 min離心后管內分三層，用毛細血管插到云霧層，吸取單個核細胞洗滌細胞兩次RPMI1640重懸細胞臺盼蘭染液混合計數細

13、胞活力檢測：死的細胞可被染成蘭色，活細胞不著色活細胞數活細胞百分率100總細胞數 方法用本法分離PBMC，一般純度在90以上，收獲率可達8090，活細胞百分率在95以上第21頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四（二）T淋巴細胞及其亞群的分離第22頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四T淋巴細胞亞群T細胞的發育階段分類 表達TCR的類型分類 是否表達CD4或CD8 T細胞功能分類 第23頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四T淋巴細胞亞群T細胞的發育階段分類 初始T細胞 naive T cells 未經抗原刺激的成熟T細胞，表達CD45RA

14、效應T細胞 effector T cells 表達高親和力IL-2R，介導免疫效應記憶T細胞 memory T cells 表達CD45RO，介導再次免疫應答第24頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四T淋巴細胞亞群表達TCR的類型分類 TCR+ T細胞 TCR+ T細胞 第25頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四T淋巴細胞亞群是否表達CD4或CD8 CD4+ T細胞 CD8+ T細胞 第26頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四T淋巴細胞亞群T細胞功能分類 輔助性T細胞 Helper T cells , Th 效應T細胞 Effecto

15、r T cells , TE細胞毒T細胞 Cytotoxic T lymphocytes, CTL遲發性變態反應T細胞Delayed T cells，Td初始T細胞Naive T cells 調節性T細胞Regulatory T cells，Tr記憶T細胞Memory T cells，Tm抑制性T細胞Suppressor T cells，Ts 第27頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四輔助性T細胞 Helper T cells , Th Th1: 細胞免疫 Th2：體液免疫Th17：炎癥反應第28頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四輔助性T細胞 Help

16、er T cells , ThTGF-+IL-6第29頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四輔助性T細胞 Helper T cells , Th濾泡輔助性T細胞（Tfollicularhelper，Tfh）通過細胞因子IL-10和IL-21來調節B細胞的功能 第30頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的分化Foxp+T調節細胞可以從胸腺直接分化，也可在TGF-作用下從Foxp3-T細胞分化。調節性T細胞Regulatory T cells，Tr第31頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四玫瑰花結

17、法（E花環沉降法） 尼龍毛柱分離法 淘洗法免疫磁珠法流式細胞術分選法（二）T淋巴細胞及其亞群的分離第32頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四人T淋巴細胞表面表達CD2分子，即綿羊紅細胞受體， B細胞則無。在適當的條件下，可與綿羊紅細胞（SRBC）結合，形成玫瑰花結（rosette）,因為紅細胞環繞T細胞，形似花環，所以又稱E-花環（E-rosette）該實驗常用于臨床檢測人外周血T淋巴細胞的數量和比例，由此可間接反映機體的細胞免疫功能狀況 玫瑰花結法第33頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四淋巴細胞 + SRBC懸液 37C水浴 10 min 低溫低速離

18、心 T細胞形成E花環而沉于管底 懸液中為B細胞。 方法 第34頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四混合單個核細胞懸液在通過尼龍毛柱時，B細胞、漿細胞、單核細胞和一些輔助細胞被選擇性粘附于尼龍毛上，而T細胞不與尼龍毛粘附的特性，這是獲得富含T細胞群的有效方法尼龍毛柱分離法第35頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四簡單，快速，經濟，尼龍毛可反復利用可分離大量細胞細胞不會被激活，可用于功能測定純度不高耗時優點 缺點 第36頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四也叫親合板結合分離法 (immune panning isolation）。利用親合

19、層析和抗體固相包被原理，將相應抗體結合于塑料平板上，由于各種淋巴細胞亞群具有不同抗原性的特點和表面標志，加細胞懸液后，凡抗原陽性的細胞則與相應的固相抗體結合，抗原陰性的細胞可從未吸附的細胞懸液中獲取同理若用特異性抗原交聯于塑料板上，則可分離得到具有特異抗原受體的淋巴細胞。但淋巴細胞受體與特異抗原或抗體連接后有可能引起細胞激活，因此，凡欲去除細胞懸液內某一細胞亞群時，本法更合適 淘洗法第37頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四親和板分離淋巴細胞示意圖第38頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四利用T淋巴細胞表面某種標志性抗原與包被在固相載體上的特異性單抗結合

20、，將T細胞與其他細胞分離的方法T淋巴細胞淘洗分離原理第39頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四羊抗兔Ig包被平皿CD4 一抗培育T細胞，倒入平皿，4孵育1小時；收集未粘附的CD4-T細胞PBS漂洗非特異吸附的CD4-T細胞收集粘附的CD4+T細胞，可以用刮板刮取并在顯微鏡下觀察 方法 （以CD4+T細胞為例）第40頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四免疫磁珠法分離細胞是基于細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面抗原的細胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結合而沒有磁性，不在磁場中

21、停留，從而使細胞得以分離 免疫磁珠法（Magnetic activated cell sorting, MACS）第41頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四第42頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四NS陽性選擇法（正選）第43頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四NS陰性選擇法（負選） 第44頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四第45頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四免疫磁珠細胞分選裝置第46頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四第47頁，共76頁，2022年，5月20日，9點

22、50分，星期四將特異性抗T細胞表面分子的單克隆抗體與磁性小珠形成免疫磁珠，用這種免疫磁珠從PBMC中結合T細胞在磁場中，結合T細胞的免疫磁珠固定了，未結合的其它細胞被洗脫下來撤離磁場，再從免疫磁珠上洗脫 T細胞 免疫磁珠法 陽性選擇T細胞 第48頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四將多種特異性抗非T細胞表面分子的單克隆抗體與磁性小珠形成免疫磁珠，用這種免疫磁珠從PBMC中結合非T細胞在磁場中，結合其它細胞的免疫磁珠固定了，未結合的T細胞被洗脫下來免疫磁珠法 陰性選擇T細胞 第49頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四CD4+ T Cell Isolatio

23、n Kit II Non-CD4+ T cells in PBMC, i.e., CD8+ T cells, / T cells, B cells, NK cells, dendritic cells, monocytes, granulocytes, and erythroid cells, are indirectly magnetically labeled by using a cocktail of biotin-conjugated antibodies against CD8, TCR /, CD19, CD56, CD14, CD16, CD36, CD123, and CD2

24、35a (glycophorin A). These cells are subsequently magnetically labeled with Anti-Biotin MicroBeads for depletion. Thereby, highly pure CD4+ T cells are obtained. 免疫磁珠法 陰性選擇CD4+ T細胞實例 PBMC before separation Untouched CD4+ T cells第50頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四熒光激活細胞分離法(fluorescence activated cell sor

25、ter, FACS)第51頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四FACS用途：用流式細胞儀對單個細胞進行快速定量分析與分選的一門技術原理：包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發出散射光和熒光，經探測器檢測，轉換為電信號，送入計算機處理，輸出統計結果，并可根據這些性質分選出高純度的細胞亞群，分離純度可達99%第52頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四第53頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 方法 （以CD4+ T細胞為例）PBMC用PBS洗滌，低溫離心棄上清；加入含AB血清的PBS封

26、閉，4孵育10分鐘；加入適量的PerCP-CD3，APC-CD4抗體，4孵育30分鐘；PBS洗滌，低溫離心棄上清并用RPMI 1640重懸；流式細胞術分選；第54頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四（三）B淋巴細胞及其亞群的分離如果僅考慮PBMC中T細胞和B細胞，那么所有從PBMC中分離T淋巴細胞的方法實際上也可用于分離B淋巴細胞。第55頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四B細胞表面標志 SmIg、Fc受體、補體受體、EB病毒受體，部分CD分子是B細胞的重要表面標志，其中以SmIg為B細胞所特有，是鑒定B細胞可靠的指標 CD19/CD5分子：可將B細胞區

27、分為B1細胞和B2細胞，B1細胞為CD19和CD5雙陽性，而B2細胞僅為CD19陽性，B2細胞為通常所指的B細胞 第56頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四終濃度5 mM L-leucine methyl ester (L-LME)重懸PMBC，混勻，室溫35s離心，400 g，10 min，棄上清，PBS洗滌細胞重懸于25 ml RPMI 1640培養基，過尼龍毛柱，去除細胞團塊玫瑰花結法去除T細胞抗CD19或CD20單抗標記，流式細胞儀檢驗B細胞純度去除Mo/M法第57頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四將特異性抗B細胞表面分子CD19的單克隆抗體免

28、疫磁珠與PBMC混合，用這種免疫磁珠從PBMC中結合B細胞在磁場中，結合B細胞的免疫磁珠固定了，未結合的其它細胞被洗脫下來撤離磁場，再從免疫磁珠上洗脫 CD19+B細胞 免疫磁珠法 陽性選擇B細胞 第58頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四將多種特異性抗非B細胞表面分子的單克隆抗體與磁性小珠形成免疫磁珠，用這種免疫磁珠從PBMC中結合非B細胞在磁場中，結合其它細胞的免疫磁珠固定了，未結合的B細胞被洗脫下來免疫磁珠法 陰性選擇B細胞 第59頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四B Cell Isolation Kit II Non-B cells, i.e.

29、, T cells, NK cells, monocytes, dendritic cells, granulocytes, platelets, and erythroid cells, are indirectly magnetically labeled using a cocktail of biotinylated CD2, CD16, CD14, CD36, CD43, and CD235a (glycophorin A) antibodies. These cells are subsequently magnetically labeled with Anti-Biotin M

30、icroBeads for depletion. Highly pure B cells are obtained by depletion of magnetically labeled non-B cells.PBMC before separation Untouched B cells免疫磁珠法 陰性選擇B細胞實例 第60頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四（四） Mo/M分離技術 單核-巨噬細胞包括骨髓中的前單核細胞、外周血中的單核細胞、以及組織內的巨噬細胞(M)。M來源于血液中的單核細胞，而單核細胞又來源于骨髓中的前體細胞。第61頁，共76頁，2022年，5月2

31、0日，9點50分，星期四Mo/M細胞表面標志 表面標志抗原：CD14，但CD14也表達在粒細胞。 CD14主要強表達在單核-巨噬細胞，弱表達在粒細胞上第62頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四 無血清RPMI 1640培養液將PBMC 2106 cell/ml重懸；75 ml培養瓶中加入10 ml細胞懸液，于培養箱內37孵育1小時；吸盡培養液，RPMI 1640培養液漂洗2遍，去除非黏附細胞；細胞刮片輕輕刮取黏附的單核細胞。黏附法第63頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四快速，方便純度和得率均較低易引起Mo/M激活，引起基因表達和分泌蛋白優點 缺點 第6

32、4頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四將特異性抗單核細胞表面分子CD14的單克隆抗體免疫磁珠與PBMC混合，用這種免疫磁珠從PBMC中結合單核細胞在磁場中，結合單核細胞的免疫磁珠固定了，未結合的其它細胞被洗脫下來撤離磁場，再從免疫磁珠上洗脫 CD14+單核細胞 免疫磁珠法 陽性選擇單核細胞 第65頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四將多種特異性抗非單核細胞表面分子的單克隆抗體與磁性小珠形成免疫磁珠，用這種免疫磁珠從PBMC中結合非單核細胞在磁場中，結合其它細胞的免疫磁珠固定了，未結合的單核細胞被洗脫下來免疫磁珠法 陰性選擇單核細胞 第66頁，共76頁，2

33、022年，5月20日，9點50分，星期四Monocyte Isolation Kit II Non-monocytes, such as T cells, NK cells, B cells, dendritic cells, and basophils, are indirectly magnetically labeled using a cocktail of biotin-conjugated antibodies against CD3, CD7, CD56, CD19, CD16, CD123, and CD235a (Glycophorin A), as well as Anti-Biotin MicroBeads. Highly pure unlabeled monocytes are obtained by depletion of the magnetically labeled cells.PBMC before separation Untouched Monocytes免疫磁珠法 陰性選擇單核細胞第67頁，共76頁，2022年，5月20日，9點50分，星期四PBMC用PBS洗滌，低溫離心棄上清加入含AB血清的PBS封閉，4孵育10分鐘加入適量的FITC-CD14抗體，4孵育30分鐘PBS洗滌，低溫離心棄上