1、2014年全球結核發病率來源：WHO 2015年工作報告2014年中國新發病例：8261552014年中國結核發病率：68/100 000近幾年我國結核發病率逐年下降，但仍然屬于結核高負擔國家2014年全球結核發病率來源：WHO 2015年工作報告202014年全球耐藥結核發病率來源：WHO 2015年工作報告新發結核病例中的耐藥結核比例WHO估算2014年中國耐藥結核發病數新發病例：43000復發病例：8200我國屬于耐藥結核 高負擔國家2014年全球耐藥結核發病率來源：WHO 2015年工作報告高負擔國家的耐藥結核發現我國當前耐藥結核防控的問題：不充分的耐藥病人發現，不充足的耐藥病人治療5

2、.56%納入治療高負擔國家的耐藥結核發現我國當前耐藥結核防控的問題：5.56結核診治出現偏差！過多依賴X-光片或其他影像學檢查，忽略了以痰標本為基礎的微生物診斷過多依賴未經驗證、或不能作為診斷依據的測試，比如血清學檢查只參考傳統的微生物檢測結果因為這些檢測的不可靠性，WHO 不得不采取非常規手段，特別提出反對這些測試的建議全球結核控制不理想的問題出在哪里？結核診治出現偏差！全球結核控制不理想的問題出在哪里？可診斷活動期結核感染無法區分活動期結核與潛伏期結核傳統技術現代技術影像學涂片鏡檢培養皮膚菌素試驗IGRA分子診斷結核診斷的常見技術可診斷活動期結核感染無法區分活動期結核與潛伏期結核傳統技術現

3、依據抗酸染色為基礎的結核初篩的不可靠性敏感性為50%結核/非結核分枝桿菌不能區分（NTM可能占到40%）以培養為基礎的結核確診和藥敏對治療的影響2個月才獲得藥敏結果，導致患者脫落2個月后調整治療方案，導致耐藥患者的漏診和傳播無法更早確診耐藥結核患者當前臨床診治的難點依據抗酸染色為基礎的結核初篩的不可靠性當前臨床診治的難點我國結核診斷現狀結核診斷新技術2015 WHO結核診斷指南更新我國結核診斷現狀結核診斷新技術2015 WHO結核診斷指南更利福平耐藥檢測對MDR-TB診療足夠嗎？與培養對比（12 項研究，699 例樣本）共納入15項已發表研究和7項未發表研究，涵蓋5922例樣本，大多數研究（5

4、9%）來自結核高負擔地區。高負擔國家的耐藥結核發現Xpert MTB/RIFGuo, Y et al.Xpert 檢測兒童痰液，明顯優于涂片；恒溫擴增 試紙條法2014 (94): 428.5%污染），不容易受污染影響，同時可更早獲得利福平耐藥結果.2014 (94): 428.中國CDC推薦可用于基層實驗室美國將Xpert MTB/RIF陰性結果用作解除隔離決策的依據結核及耐藥結核初始診斷Xpert MTB/RIF三種分子生物學診斷技術對結核診斷價值的比較.來源：WHO 2015年工作報告手工操作步驟繁多，復雜的結果判讀近幾年我國結核發病率逐年下降，但仍然屬于結核高負擔國家與培養對比（16

5、項研究，709 例樣本）結核診斷新技術IGRAT-SpotQuantiFeronNAAT技術等溫擴增檢測技術線性探針基因芯片熔解曲線巢式PCR血清學檢測利福平耐藥檢測對MDR-TB診療足夠嗎？結核診斷新技術IGRIGRA原理：機體感染過結核分枝桿菌，T-淋巴細胞會在再次接觸結核分枝桿菌時，產生和分泌特異性的細胞因子IFN-操作步驟：反轉10次混勻37C條件下孵育16-24小時2000-3000g離心15分鐘用移液管取血漿每個孔內放50ul結合液加入50ul血漿，室溫孵育120分鐘洗板至少6次每個孔內加100ul底物，室溫孵育30分鐘加入50ul反應終止液450nm波長下讀取吸光度使用專用軟件計

6、算結果操作步驟：密度梯度離心分離外周血單個核細胞（PBMCs）洗滌PBMCs將PBMCs與特異抗原一同加入到預包被抗-干擾素抗體的培養孔37C孵育16-20小時洗滌培養孔加標記二抗孵育1小時洗滌培養孔加顯色液用蒸餾水終止反應用肉眼判斷結果QuantiFERON-TBT-SPOT.TB采血量：132月）的兒童陽性率更高檢測異煙肼耐藥的靈敏度低于培養（約85%）在中低收入國家，尤其是結核高負擔國家，不推薦使用IGRA我國當前耐藥結核防控的問題：Director, Stop TB,Xpert 陰性=排除結核只參考傳統的微生物檢測結果分子信標靶序列雜交體每個探針用不同的熒光染料標記，允許同時檢測。PC

7、R的目標是rpoB基因的81 bp區域： 5個探針結合到野生型，而不是突變體目標SPC半巢式實時熒光PCR（Xpert） WHO與FIND支持研發成果痰標本與處理液1：2混合吸取2ml處理樣品到反應盒將反應盒放入檢測模塊（手工操作完成）標本自動清洗過濾超聲裂解DNA提純DNA和PCR反應試劑混合半巢式實時熒光定量核酸擴增檢測打印檢測報告獲得檢測結果時間：1小時45分鐘系統內自動完成中華結核和呼吸雜志.分子信標靶序列雜交體每個探針用不同的熒光Its a development that the world has been waiting for, for literally decades.

8、Its something that has the potential of truly revolutionizing the way we deal with TB today.WHO Endorsement of Xpert MTB/RIFThe Test that is Changing the WorldDr. Mario Raviglione. Director, Stop TB, WHO 2011年WHO評估完成后正式推薦Its a development that the woWHO全力推薦XpertWHO全力推薦Xpert各類分子診斷技術比對（液體培養/DST為金標準）線性

9、探針基因芯片恒溫擴增（試紙條法）RNA恒溫擴增LAMP熔解曲線Xpert MTB/RIF是否WHO推薦耐藥結核診斷否否否否否結核及耐藥結核初始診斷儀器通量12（手工）20或48（自動）6或12（選用雜交儀可同時做12個樣品）單個通量取決于擴增儀純手工操作961-80出報告時間6小時6小時2小時2小時2小時2-3小時2小時試劑儲存條件部分試劑需冷凍部分試劑需冷凍部分試劑需冷凍部分試劑需冷凍室溫儲存部分試劑需冷凍室溫儲存涂陽培陽樣本MTB靈敏度無無84.1%5 84.6%698.2%780%898%3涂陰培陽樣本MTB靈敏度無無59.8%561.9%655.6%781%868%3-88.8%2耐藥

10、靈敏度RIF：93.1%-98%1INH： 85%3RIF：91.8%-94.6%4INH： 70.2%-78.1%4無無無RIF 95%3陳琛等. 分子線性探針測定法杖結核病診斷中的研究進展. 中國防癆雜志. 2016(38): 218.Xichao Ou et al. A feasibility study of the Xpert MTB/RIF test at the peripheral level laboratory in China. International Journal of Infectious Disease. 2015 (31): 41.WHO. Xpert MT

11、B/RIF assay for the diagnosis of pulmonary and extrapulmonary TB in adults and children Policy Update.Guo, Y et al. Rapid, accurate determination of multidrug resistance in M. tuberculosis isolates and sputum using a biochip system. International Journal of Infectious Disease. 2009 (13): 914.Xichao

12、Ou et al. A multicenter study of Cross-Priming Amplification for tuberculosis diagnosis at peripheral level in China. Tuberculosis. 2014 (94): 428.黃芳等. 三種分子生物學診斷技術對結核診斷價值的比較. 中華結核和呼吸雜志. 2015 (38): 680.WHO. The use of a commercial loop-mediated Isothermal amplification assay (TB-Lamp) for the detecti

13、on of tuberculosis. May 2013.王冰冰. 熒光PCR熔解曲線法在結核分枝桿菌耐藥檢測中的臨床應用. 國際檢驗醫學雜志. 2015(35): 608. 各類分子診斷技術比對（液體培養/DST為金標準）線性探針文獻：3種分子診斷方法比對無論涂陽培陽還是涂陰培陰，Xpert的檢出率均最高樣本：根據“結核病診斷和治療指南”，收集2014年4-7月西安市結核病胸部腫瘤醫院收治的經病理確診或細菌性確診的肺結核患者痰標本共378份。文獻：3種分子診斷方法比對無論涂陽培陽還是涂陰培陰，Xper利福平耐藥檢測對MDR-TB診療足夠嗎？INH單耐藥的患者通常不會考慮立即改變治療方案，與此

14、相反，對RIF單耐藥的患者，無論INH是否耐藥，都會采取與耐多藥患者相同的治療方案1。約90%利福平耐藥的結核患者同時異煙肼耐藥，也就是耐多藥結核患者2。Sven O. Friedrich et al,. Suitability of Xpert MTB/RIF and Genotype MTBDRplus for Patient Selection for a Tuberculosis Clinical Trial. Journal of Clinical Microbiology. 2011 (49):2827-2831. Xichao Ou et al. A feasibility st

15、udy of Xpert MTB/RIF test at the peripheral level laboratory in China. International Journal of Infectious Diseases. 2015 (31):41-46.“結核+利福平耐藥”對多耐結核控制產生的效果最為顯著。即便補充異煙肼耐藥，能提升的效果有限利福平耐藥檢測對MDR-TB診療足夠嗎？INH單耐藥的患者通WHO推薦Xpert用于肺外結核的初始診斷樣本類型對比（研究數，樣本量）綜合靈敏度 %（綜合 95% CI）綜合特異性 %（綜合 95% CI）淋巴結組織與培養對比（14 項研究，84

16、9 例樣本）84.9（72-92）92.5（80-97）與復合參考標準對比（5 項研究，1 篇未發表研究）83.7（74-90）99.2（88-100）腦脊液與培養對比（16 項研究，709 例樣本）79.5（62-90）98.6（96-100）與復合參考標準對比（6 項研究，512 例樣本）55.5（51-81）98.8（95-100）胸水與培養對比（17 項研究，1385 例樣本）43.7（25-65）98.1（95-99）與復合參考標準對比（7 項研究，698 例樣本）17（8-34）99.9（94-100）洗胃液與培養對比（12 項研究，1258 例樣本）83.8（66-93）98.1

17、（92-100）其他組織與培養對比（12 項研究，699 例樣本）81.2（68-90）98.1（87-100）共納入15項已發表研究和7項未發表研究，涵蓋5922例樣本，大多數研究（59%）來自結核高負擔地區。WHO推薦Xpert用于肺外結核的初始診斷樣本類型對比（研WHO推薦Xpert用于結核的初始診斷WHO 數據: 靈敏度66%, 特異性 98% 南非經驗: 2011年6月-2012年5月，484 例患者, 年齡中位數24個月，痰液都是非誘導痰 63% 的樣本體積132月）的兒童陽性率更高 Xpert MTB/RIF: 靈敏度 62.5% (25, 91), 特異性 99.1% (98,

18、 99.9)涂片: 靈敏度 33% (8, 7)，特異性99.5% (98, 99.9)Xpert 檢測兒童痰液，明顯優于涂片；檢測糞便標本性能同樣優異痰 液糞 便易于使用的樣本處理器 (0.6g, 1.2g, 拭子)糞便（0.6 g）的性能和呼吸道標本效果相當，且非侵入式樣本更適合兒童WHO推薦Xpert用于結核的初始診斷WHO 數據: 靈敏快速、即時的分子診斷實現檢測就治療韓國，國立首爾大學醫學院2011年1月-2013年5月681例患者Xpert MTB/RIF可將從接診到開始抗結核治療的平均時間從21天縮短為6天快速、即時的分子診斷實現檢測就治療韓國，國立首爾大學醫學院南非全國使用Xp

19、ert逐步替代涂片，耐藥結核負擔明顯下降2016 CATA, 南非NHLS優先項目負責人Wendy Stevens教授分享南非經驗南非全國使用Xpert逐步替代涂片，耐藥結核負擔明顯下降20QFT低采血量，更具優勢南非經驗: 2011年6月-2012年5月，484 例患者, 年齡中位數24個月，痰液都是非誘導痰我國屬于耐藥結核 高負擔國家與培養對比（17 項研究，1385 例樣本）南非經驗: 2011年6月-2012年5月，484 例患者, 年齡中位數24個月，痰液都是非誘導痰5%污染），不容易受污染影響，同時可更早獲得利福平耐藥結果.痕量血液不影響檢測性能 52% (CI 44, 60) ，

20、離心也不影響檢測性能57% (CI 28, 82)與復合參考標準對比（6 項研究，512 例樣本）5 ml，低于Xpert MTB/RIF樣本體積要求在中低收入國家，尤其是結核高負擔國家，不推薦使用IGRAFriedrich et al,.2011年WHO評估完成后正式推薦手工操作步驟繁多，復雜的結果判讀37C孵育16-20小時與培養對比（12 項研究，699 例樣本）5個探針結合到野生型，而不是突變體目標Xpert 陰性=排除結核Xpert 檢出率是260/1175，與液體培養 相當277/1175恒溫擴增 試紙條法2015 WHO結核診斷指南更新利福平耐藥檢測對MDR-TB診療足夠嗎？與培

21、養對比（12 項研究，699 例樣本）未來：Xpert Ultra 替代培養近幾年我國結核發病率逐年下降，但仍然屬于結核高負擔國家適用于可開展傳統涂片的實驗室結核及耐藥結核初始診斷美國將Xpert MTB/RIF陰性結果用作解除隔離決策的依據未來：Xpert Ultra 替代培養2個月后調整治療方案，導致耐藥患者的漏診和傳播Guo, Y et al.我國屬于耐藥結核 高負擔國家南非在礦區及礦區周邊社區使用Xpert對重點人群進行篩查對比（研究數，樣本量）中國CDC推薦可用于基層實驗室tuberculosis isolates and sputum using a biochip system.

22、DNA和PCR反應試劑混合半巢式實時熒光PCR（Xpert） WHO與FIND支持研發成果只參考傳統的微生物檢測結果2個月才獲得藥敏結果，導致患者脫落2011年1月-2013年5月利福平耐藥檢測對MDR-TB診療足夠嗎？WHO全力推薦Xpert南非在礦區及礦區周邊社區使用Xpert對重點人群進行篩查QFT低采血量，更具優勢與培養對比（12 項研究，699 例南非用Xpert檢測肺外結核經驗(約翰內斯堡研究，n=1175)Xpert 檢出率是260/1175，與液體培養 相當277/1175 Xpert 靈敏度59% (CI 53, 65) ，特異性92% (CI 90, 94). 膿、抽吸物的

23、的靈敏度最高，然后是(腹水，然后是胸水).濃稠樣本的靈敏度最高87% (CI 76, 94)，清液樣本靈敏度較低 48% (CI 36, 61). 痕量血液不影響檢測性能 52% (CI 44, 60) ，離心也不影響檢測性能57% (CI 28, 82) Xpert 相比液體培養（10.5%污染），不容易受污染影響，同時可更早獲得利福平耐藥結果.Xpert檢測膿和抽吸物的特異性低于呼吸道樣本，但這些都是真陽性樣本類型WHO 報告靈敏度 淋巴結組織和抽吸物85% CSF80%胸水44%胃液84%其他組織81%南非用Xpert檢測肺外結核經驗(約翰內斯堡研究，n=11未來：Xpert Ultra

24、 替代培養Xpert MTB/RIF 痰液的檢測下限為50-165 CFU/ml，2小時出結果檢測靶標：rpoB基因，5個探針檢測突變，25 ul DNA用于PCR反應涂陰標本的靈敏度60-80%替代涂片的策略Xpert Ultra 痰液檢測下限為 5-25 CFU/ml新的樣本處理試劑盒（50ul DNA用于PCR反應）檢測靶標：IS16110、IS1081和ropB基因片段4個探針檢測突變優化的試劑盒流體技術和PCR循環（熔解曲線）70分鐘出結果替代培養的策略野生型FIND基金和約翰內斯堡的醫療機構合作，10個國家進行多中心評估未來：Xpert Ultra 替代培養Xpert MTB/R我

25、國結核診斷現狀結核診斷新技術2015 WHO結核診斷指南更新我國結核診斷現狀結核診斷新技術2015 WHO結核診斷指南更WHO 2015 結核診斷策略執行框架分子診斷Xpert MTB/RIF：WHO推薦可檢測成人和兒童的痰液、痰沉淀、部分肺外結核標本；檢測利福平耐藥的靈敏度為95%線性探針：WHO推薦其可用于檢測利福平耐藥相關基因突變，以及氟喹諾酮耐藥檢測；檢測異煙肼耐藥的靈敏度低于培養（約85%）潛伏性結核診斷無金標準WHO推薦中-高收入國家可采用IGRA，不建議低收入國家用IGRA替代皮膚菌素試驗WHO不建議血清學檢測進行肺結核、肺外結核診斷IGRA不應用于活動性結核診斷WHO 2015

26、 結核診斷策略執行框架分子診斷WHO 2015 結核診斷策略執行框架參比實驗室區域/地級實驗室基層實驗室患者發現、治療、隨訪及監測，開發并提供參考方法和標準，管理各級實驗室患者發現、治療、隨訪篩查，患者發現、轉診和治療涂片鏡檢、Xpert MTB/RIF涂片鏡檢、Xpert MTB/RIF、 條件允許時用固體培養和線性探針檢測涂陽痰液涂片鏡檢、Xpert MTB/RIF、 固體培養和線性探針檢測涂陽和培養陽性痰液、液體培養、DST檢測一線和二線抗結核藥物實驗室功能實驗室分級適用檢測WHO 2015 結核診斷策略執行框架區域/地級實驗室基層實美國將Xpert MTB/RIF陰性結果用作解除隔離決

27、策的依據美國國家結核控制協會（NTCA）美國公共衛生檢驗協會（APHL）Xpert 陰性=排除結核美國將Xpert MTB/RIF陰性結果用作解除隔離決策的依謝 謝 大 家！謝 謝 大 家！我國結核診斷現狀結核診斷新技術2015 WHO結核診斷指南更新我國結核診斷現狀結核診斷新技術2015 WHO結核診斷指南更WHO全力推薦XpertWHO全力推薦XpertWHO推薦Xpert用于結核的初始診斷WHO 數據: 靈敏度66%, 特異性 98% 南非經驗: 2011年6月-2012年5月，484 例患者, 年齡中位數24個月，痰液都是非誘導痰 63% 的樣本體積132月）的兒童陽性率更高 Xper

28、t MTB/RIF: 靈敏度 62.5% (25, 91), 特異性 99.1% (98, 99.9)涂片: 靈敏度 33% (8, 7)，特異性99.5% (98, 99.9)Xpert 檢測兒童痰液，明顯優于涂片；檢測糞便標本性能同樣優異痰 液糞 便易于使用的樣本處理器 (0.6g, 1.2g, 拭子)糞便（0.6 g）的性能和呼吸道標本效果相當，且非侵入式樣本更適合兒童WHO推薦Xpert用于結核的初始診斷WHO 數據: 靈敏南非全國使用Xpert逐步替代涂片，耐藥結核負擔明顯下降2016 CATA, 南非NHLS優先項目負責人Wendy Stevens教授分享南非經驗南非全國使用Xpe

29、rt逐步替代涂片，耐藥結核負擔明顯下降20南非用Xpert檢測肺外結核經驗(約翰內斯堡研究，n=1175)Xpert 檢出率是260/1175，與液體培養 相當277/1175 Xpert 靈敏度59% (CI 53, 65) ，特異性92% (CI 90, 94). 膿、抽吸物的的靈敏度最高，然后是(腹水，然后是胸水).濃稠樣本的靈敏度最高87% (CI 76, 94)，清液樣本靈敏度較低 48% (CI 36, 61). 痕量血液不影響檢測性能 52% (CI 44, 60) ，離心也不影響檢測性能57% (CI 28, 82) Xpert 相比液體培養（10.5%污染），不容易受污染影響

30、，同時可更早獲得利福平耐藥結果.Xpert檢測膿和抽吸物的特異性低于呼吸道樣本，但這些都是真陽性樣本類型WHO 報告靈敏度 淋巴結組織和抽吸物85% CSF80%胸水44%胃液84%其他組織81%南非用Xpert檢測肺外結核經驗(約翰內斯堡研究，n=11QFT低采血量，更具優勢2011年WHO評估完成后正式推薦共納入15項已發表研究和7項未發表研究，涵蓋5922例樣本，大多數研究（59%）來自結核高負擔地區。不充分的耐藥病人發現，不充足的耐藥病人治療約90%利福平耐藥的結核患者同時異煙肼耐藥，也就是耐多藥結核患者2。37C條件下孵育16-24小時南非用Xpert檢測肺外結核經驗(約翰內斯堡研究，n=1175)Xpert MTB/RIF可將從接診到開始抗結核治療的平均時間從21天縮短為6天未來：Xpert Ultra 替代培養2014年中國新發病例：826155Mario Raviglione.與培養對比（12 項研究，699 例樣本）但說明目前該技術沒有WHO評估并進行推薦所必須的多中心評估的數據優化的試劑盒流體技術和PCR循環（熔解曲線）Journal of Clinical Microbiology.