1、天然藥物分離技術及結構表征一、經典分離技術 二、色譜分離技術 三、大孔樹脂分離技術四、膜分離技術五、分子蒸餾技術 第三講 植物化學成分的分離 中藥經過各種方法提取后所得的提取液仍是包含諸多成分的混合物，需要進一步的分離精制和純化處理，才能得到所需成分或單體化合物。但提取液一般體積較大，所含成分濃度較低，因此為了提高濃度，有利于分離精制，首先需要對提取液進行濃縮。濃縮可通過蒸發或蒸餾來完成，所采用的方法視溶劑和有效成分的性質而定，具體的方法有常壓蒸發、減壓蒸餾、薄膜蒸發、反滲透法、超濾法等。第一章 經典分離技術1.常壓蒸餾法 適用于溶劑沸點低、有效成分受熱不易分解的提取液的濃縮，如氯仿、乙醚、石

2、油醚等的提取液。操作注意事項：處理乙醚提取液時，需用電熱板或沒有明火的其他裝置水浴加熱，禁止用明火或電爐加熱。2.減壓蒸餾法適用于溶劑沸點高，有效成分受熱易分解的提取液的濃縮。一般當溶劑沸點超過70時，在可能條件下應采用減壓濃縮。 3.薄膜蒸發法 特別適用于濃縮以水或稀醇作溶劑的提取液，該法使溶液以液膜狀態迅速通過加熱管，由于受熱表面積大，從而縮短了加熱時間，提高了濃縮效率。如果提取液濃縮到小體積放置后，有固體或結晶析出，可將析出物濾出，供進一步分離；濾液再濃縮，放置，再觀察和處理，直到母液蒸干為止。如含葉藥材用70%乙醇提取，在回收乙醇至含醇量近15% -20%時，置于冰箱中，絕大部分葉綠素

3、可沉淀出來。濾除后，可進一步濃縮至近稠膏狀時，趁熱轉移至較小的圓底燒瓶內，水浴加熱，直接減壓抽氣，使提取物發泡成干燥疏松狀，待進一步處理。總之，濃縮過程中應注意盡量避免不必要的損失，防止熱敏性成分被破壞。濃縮后的提取液就可以根據中藥成分的性質如溶解度、在兩相溶劑中的分配比、分子大小、吸附性、解離程度等的差異選擇恰當的方法進行進一步的分離和精制。中藥化學成分常規分離精制方法主要有系統溶劑分離法、兩相溶劑萃取法、沉淀法、結晶法、鹽析法、透析法、分餾法、升華法等。 常用的溶劑與中藥化學成分的對應關系 二、適用范圍此法是早年研究天然產物有效成分的一種最主要的方法，主要用于分離提純含有極性不同的各種化學

4、成分的中藥提取液。目前仍是作為研究成分不明天然產物的最常用方法之一。但此法在微量成分、結構性質相似成分的分離純化上受到很大限制。三、優缺點此法操作手續繁瑣，對化學性質不穩定，容易引起分解、異構化的天然產物應特別注意。它對各類化學成分的分離操作往往都是憑經驗摸索進行的。當100時，達到基本分離只需做一次簡單萃取；當10010時，則需萃取10-12次才能達到分離；當1時，即表示KAKB 兩種成分性質非常相近，無法利用此法達到分離目的。因此在實際工作中，應選擇值大的溶劑系統，以簡化分離過程，提高分離效率。亦可根據值的大小選擇適當的萃取方法。 二、各種萃取技術（一）簡單萃取法儀器裝置: 少量萃取一般在

5、分液漏斗中進行；中量萃取可在較大的下口瓶中進行；工業生產中的大量萃取，多在密閉萃取缸內進行。操作技術 （ 1）小量萃取操作過程 （ 2）萃取劑的選擇 有機溶劑萃取劑: 如果從水提液中萃取親脂性成分，一般選用苯、氯仿或乙醚等親脂性有機溶劑；如果從水提液中萃取中等極性成分，一般選用乙酸乙酯、丁醇等弱親脂性有機溶劑或在氯仿、乙醚中加入適量乙醇以增大其親水性。用于pH梯度萃取法的萃取劑 （3）萃取劑的用量 （4）水提液的濃度要求:其濃度最好在相對密度1.1-1.2之間，過稀則萃取劑用量太大，過濃則兩相不易充分接觸，影響萃取效率。 （二）逆流連續萃取法 逆流連續萃取法是利用兩種互不相溶的溶劑相對密度的不

6、同，以相對密度小的溶劑相作為移動相（或分散相），相對密度大的溶劑相作為固定相（或連續相），使移動相逆流連續穿過固定相，借以交換溶質而達到分離的一種連續萃取技術。 1.儀器裝置3.優缺點逆流連續萃取法操作簡便，萃取較完全，適合各種密度的溶劑萃取。此法克服了簡單萃取法操作的麻煩，避免了乳化現象的發生。（三）逆流分溶法 逆流分溶法（ CCD）是以分配定律為基礎，將混合物經儀器操作，在兩相溶劑系統中進行反復多次的振搖、靜置、分離和轉移等萃取步驟，使分配系數不同的成分達到分離的一種新型分離方法。 CCD法又稱為逆流分配法、逆流分布法或反流分布法。 工作原理 在多個分液漏斗中裝入相對密度小的固定相，然后在

7、 0 號漏斗中加入相對密度大的流動相，振搖使充分混合，靜置分層后，分出流動相移入1號漏斗，并在0號漏斗中重新補加新鮮的流動相，分別充分振搖混合。重復上述操作反復多次，混合物中各成分即在兩相溶劑相對做逆流移動，由于它們在兩相溶劑中的分配系數不同而不斷進行分配，經多次轉移后，每一成分都應在某一管中有自己的最高濃度，從而達到分離目的。 CCD法分離過程示意操作技術是影響分離效果的重要因素 a.操作前需將選定的兩相溶劑系統充分振搖，使之充分混合后，放置，待兩相溶劑完全分層后使用；b.被分離混合物的濃度不宜過高，因為在稀溶液中其分配系數比較穩定，易達到理想的分離效果； c.操作多采用兩相溶劑等體積的方式

8、進行； d.分離操作結束后，通常可取試樣（每管中兩溶劑相的液體）用薄層色譜或紙色譜等方法檢查，根據各管內兩溶劑相中含有成分的情況合并相同部分。 適用范圍 CCD法具有很強的分離混合物各組分的能力，特別適合于分離中等極性、分離因子較小及不穩定的物質，甚至對一些用色譜法不能分離的高分子化合物如多肽、蛋白質等都已進行成功分離。但此法不適于分離微量成分、試樣極性過大或過小，或分配系數受溫度或濃度影響過大及易于產生乳化現象的溶劑系統。 優缺點 CCD法是一種高效率、多次、連續的兩相溶劑萃取分離方法，具有操作條件溫和、試樣易于回收等優點，但操作較繁，消耗溶劑多，在大體積的溶劑中混合物中的微量成分易損失，而

9、且反復多次振動溶劑系統易產生乳化現象。1. 儀器裝置輸液部分。包括微型泵、移動相溶劑儲槽和試樣液注入器。萃取部分。由300-500 根內徑約2mm 、長度為20-40mm 的萃取管連接而成。收集檢出部分。包括檢出器及分步自動收集儀。2.操作技術（ 1 ）操作時，首先將選擇好的兩相溶劑中的固定相全部充入萃取管內，然后將待分離的樣品溶于兩相溶劑（ 1:1）中，并從加樣口注入，再由微型泵注入移動相，移動相在萃取管中形成液滴，固定相在液滴和管壁間形成薄膜與液滿接觸，移動相與固定相不斷地進行有效接觸、摩擦形成新表面，促使溶質在兩相溶劑中實現充分的分配，獲得很好的分離效果。為避免被分離物質的氧化，在實際操

10、作中可采用氮氣驅動流動相。最后從萃取管中流出的移動相通過檢出器進行分部收集，完成液滴逆流分配的全過程。（ 2）影響液滴逆流分配的主要因素包括溶劑因素、送液速度、輸液管口徑，因為這些直接影響了能否形成大小適宜的移動相液滴及液滴間的間隔，從而影響分離效果。（ 3）溶劑系統的選擇與逆流分配法基本相同，但要求能在短時間內分離成兩相，并能生成有效的溶液。 沉淀法 沉淀法是在天然藥物的提取液中加入某些試劑，與其中成分發生沉淀反應生成沉淀或降低其溶解性而從溶液中析出，從而獲得有效成分或去除雜質的方法。采用沉淀法分離化合物，若生成沉淀的是有效成分，則要求沉淀反應必須可逆；若沉淀物為雜質，則沉淀反應可以是不可逆

11、反應。常用的沉淀法有下列幾種。一、酸堿沉淀法1.原理此法是利用某些成分在酸（或堿）中溶解，繼而又在堿（或酸）中生成沉淀的性質達到分離的方法。這種沉淀反應是可逆的，可使有效成分與其他雜質分離。2.適用范圍此法適用于分離提純酸性、堿性或兩性有機化合物，如黃酮、蒽醌類酚酸性成分、一些生物堿、蛋白質等。 例如，欲從混合物中分離提純出難溶于水的游離生物堿，可先加酸，使之生成生物堿鹽而溶于水，用乙醚提取以除去混合物中游離出的有機酸，再加堿堿化，使生物堿又重新游離，從溶液中沉淀析出，再用有機溶劑提取回收得到純化了的生物堿（酸/堿法） 欲分離提純一些具有酚羥基而又難溶于水的黃酮類化合物，則可先加堿液，使之成鹽

12、溶解，經酸化后又可游離析出沉淀（堿/酸法）； 蛋白質等兩性物質，則通過調節pH至蛋白質的等電點使其沉淀，從而達到提取和純化的目的。 二、試劑沉淀法 1.原理 此法利用一些成分能與某些試劑產生沉淀的性質或利用某些成分在不同溶劑中溶解度的差異，通過加入特定試劑或溶劑，使生成沉淀，與其他成分分離。 2.適用范圍 （ 1）與試劑發生沉淀反應而分離 如生物堿沉淀試劑能使生物堿類生成沉淀自酸性溶液中析出；雷氏銨鹽可與水溶性季銨堿生成難溶于水的生物堿雷氏復鹽沉淀析出；膽甾酸能與甾體皂苷生成沉淀；明膠、蛋白質溶液能沉淀鞣質等。 （2）加入試劑后改變混合液的極性、減小某些成分的溶解度而沉淀分離 如在藥材濃縮的水

13、提取液中加入數倍量高濃度乙醇，使之沉淀而除去多糖（如淀粉）、黏液質、蛋白質等水溶性雜質（水提醇沉法）； 在藥材濃縮的乙醇提取液中加入數倍量水稀釋，放置使之沉淀而除去樹脂、葉綠素等水不溶性雜質（醇提水沉法）； 利用皂苷難溶于丙酮或乙醚的性質，在藥材濃縮的乙醇提取液中加入數倍量乙醚（醇提醚沉法）或丙酮（醇提丙酮沉法），可使皂苷沉淀析出，而脂溶性的樹脂等雜質則留在母液中。三、鉛鹽沉淀法 1.原理 此法是利用中性醋酸鉛和堿式醋酸鉛在水或稀醇溶液中能與許多天然藥物化學成分生成難溶性的鉛鹽或鉛絡合物沉淀的性質，使有效成分與雜質分離。此法既可使雜質生成鉛鹽沉淀除去，又可以使有效成分生成鉛鹽沉淀。 2.適用范

14、圍 中性醋酸鉛可用于沉淀天然藥物成分中的有機酸、蛋白質、氨基酸、黏液質、鞣質、樹脂、酸性皂苷、部分黃酮苷、蒽醌苷、香豆素苷和某些色素等具有羧基、鄰二酚羥基的酸性或酚性物質；堿式醋酸鉛沉淀范圍更廣，除上述物質外，還能沉淀某些大分子中性成分如中性皂苷、糖類，某些異黃酮及其苷，某些堿性較弱的生物堿等。3.操作過程（1）第一步：醋酸鉛沉淀的形成通常將中藥的水或醇提取液先加入醋酸鉛溶液至不再沉淀為止，靜置后濾出沉淀，再于濾液中加堿式醋酸鉛飽和溶液至不再發生沉淀為止。 （ 2）第二步：脫鉛處理脫鉛的方法有3種，分別為硫化氫法、中性硫酸鹽法和陽離子交換樹脂法。 通常使用硫化氫法，將鉛鹽沉淀懸浮于水或稀醇中，

15、通入硫化氫氣體，使其分解并使鉛轉為不溶性的硫化鉛沉淀（脫鉛） 結晶與重結晶法 結晶法是分離純化固體成分的重要方法之一，通常情況下大多數天然藥物化學成分在常溫下是固體物質，具有結晶的通性。若物質能夠形成結晶，則代表其純度達到了相當程度。獲得結晶并制備成單體純品，是鑒定天然產物成分、研究其分子結構的重要一步。 一、基本原理(根據物質溶解度差別進行分離) 結晶與重結晶法是利用不同溫度可引起物質溶解度改變的性質來分離混合物中的不同成分。不是結晶狀態的固體物質處理成結晶狀態的操作稱為結晶。此時，形成的晶體一般還含有較多的雜質。不純的結晶進一步精制成較純的結晶的過程稱為重結晶。結晶是否形成及形狀與溶劑的性

16、質有關，溶劑不同結晶形狀及熔點往往有較大差異，甚至難以形成結晶。溫度、濃度及pH值等對結晶的形成有很大關系。注意：一般水溶性化合物較難析出結晶（鹽除外），脂溶性化合物較易析出結晶。 二、溶劑的選擇 選擇合適的溶劑是結晶法的關鍵。1.理想的溶劑必須具備的條件不與被提純的成分發生化學反應；對被提純成分的溶解度隨溫度不同有顯著差異，熱時溶解度大，冷時溶解度小； 對可能存在的雜質無論冷熱溶解度都很大或很小（冷熱都能溶的雜質，在降溫時被提純的物質析出結晶后，仍留在母液中；冷熱都不溶的雜質，可趁熱過濾以除去）； 溶劑的沸點不宜過高或過低（過高時，附著于晶體表面的溶劑不易除去；過低時則溶解度冷熱時變化不大，

17、不利于析晶）； 能給出較好的結晶； 無毒或毒性小。2.溶劑的選擇方法查閱有關資料及參閱同類型化合物的結晶條件，另一方面也可進行一些探索，參考“相似相溶”的規律加以考慮。 若無資料可查，且不清楚被提純物的溶解性能，需通過小量試驗來摸索。 取少量試樣（約0.1g）置小試管中，用滴管逐滴加入溶劑，觀察試樣在冷熱時的溶解情況。 若試樣在1ml冷的溶劑中全部溶解或大部分溶解，則此溶劑的溶解度太大，不適宜做結晶溶劑； 若試樣不溶或大部分不溶，但加熱至沸騰（沸點低于100的，則應水浴加熱）時完全溶解，冷卻，析出大量結晶，這種溶劑一般認為可用；若樣品不全溶于1ml沸騰的溶劑中時，則可逐次添加溶劑，每次約加0.

18、5ml，并加熱至沸騰。若加入的溶劑總量達3-4ml時，樣品在沸騰的溶劑中仍不溶解，表示這種溶劑不適用；反之，若樣品能溶解在3-4ml沸騰的溶劑中，則將它冷卻，觀察有無結晶析出，還可用玻璃棒摩擦試管壁或用冰水冷卻，以促使結晶析出。若仍未析出結晶，則這種溶劑也不適用；若有結晶析出，則以結晶析出的多少來選擇溶劑。按照上述方法逐一試驗不同的溶劑，將試驗結果加以比較，從中選擇最佳的溶劑。 3.混合溶劑的使用當選擇不到適當的單一溶劑時，可選用兩種或兩種以上溶劑組成的混合溶劑，要求低沸點溶劑對被提純物的溶解度大，高沸點溶劑對被提純物的溶解度小，這樣在放置時，沸點低的溶劑較易揮發，比例逐漸減少，易達到過飽和狀

19、態，利于結晶的形成。選擇溶劑的沸點不宜太高，要適中，可在60左右。沸點太低溶劑損耗大，亦難以控制；太高則不便濃縮，同時不易除去。一般常用的混合溶劑有乙醇-水、醋酸-水、丙酮-水、吡啶-水、乙醚-甲醇、乙醚-丙酮、乙醚-石油醚、苯-石油醚等。三、結晶分離技術1.一般操作過程 制備結晶溶液的原則是過飽和(1)一般將較純樣品-小體積-置室溫或冰箱中過夜；(2)若無結晶，在加熱下將化合物溶于少量溶劑中（逐漸加入）使完全溶解后，過濾，置室溫過夜。 (3)若還不產生結晶，可再次加熱至澄清，置冰箱過夜。(4)還難以形成結晶，可更換溶劑。 二元混合溶劑 結晶(1)將純物熱溶于沸點較高的溶劑中（對化合物溶解不大

20、），然后再逐滴加入另一種沸點較低的有機溶劑（溶解度大），至完全澄清為止，室溫或冰箱中靜置。 (2)也可先選用溶解度較好的溶劑將純物溶解，再在室溫下滴加適量難溶性溶劑，直至溶液出現渾濁，緩緩加熱使其完全澄清，靜置過夜。 2.結晶條件的控制 趁熱過濾得到的濾液應長時間靜置，逐漸冷卻，避免溫度驟降使析晶過快而帶出雜質。 若濾液久置仍無結晶析出，可采取的方法有：松動瓶塞，使溶劑自動揮發，可望得到結晶； 或加入少量晶種（同種分子），誘導晶核形成使結晶立即增長； 或用玻璃棒摩擦玻璃容器內壁，產生微小顆粒代替晶核，以誘導方式形成結晶； 或用玻璃棒蘸取過飽和液，在空氣中使之揮發除去部分溶劑后，再摩擦玻璃器壁；

21、 或用少許干冰或置于冰箱以降低結晶溫度；或加有機可溶性鹽類鹽析。 因雜質的存在會阻礙結晶的形成，可通過選擇適當的溶劑，或用活性炭除去有色雜質，或采用氧化鋁、硅膠、硅藻土等吸附色譜法使雜質盡可能除去。 有些化合物本身不易結晶，可將其制備成結晶性衍生物。如生物堿可制成鹽，有機酸制成鉀、鈉、鈣、銨鹽，羥基化合物制成乙酰化衍生物或苯甲酰衍生物，羰基化合物可以制成脎或腙類化合物等。分離后，再用化學方法處理使其恢復成原來化合物。3.結晶純度的判斷每種化合物結晶都有一定形狀（針晶、方晶等）、色澤、熔點和熔程，這些可作為純度的初步判定（注意同一純物質在不同溶劑中結晶、晶形、熔點可能不同）。通常可依據結晶外觀的

22、色澤是否均勻、晶形一致程度和是否具有一定的熔點和較小的熔距，并結合薄層色譜或紙色譜技術，經數種不同展開系統展開是否均能得到單一近圓形的斑點來判斷結晶的純度。 必要時，可制備衍生物，采用高效薄層色譜、氣相色譜、高效液相色譜來進一步確定結晶的純度。 鹽析法和透析法 一、鹽析法 原理: 鹽析法是指在天然產物的水提液中，加入大量的無機鹽，使其達到一定濃度或飽和，促使有效成分在水中的溶解度降低而沉淀析出，與其他水溶性較大的雜質分離。 常用作鹽析的無機鹽類:包括氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。其中硫酸銨具有鹽析能力 強、飽和溶液濃度大、溶解度受溫度影響小、不引起蛋白質變性等優點，而多用于蛋白質等高分子物

23、質的鹽析分離。 應用:如把硫酸鎂加入到三七的水提液中至飽和狀態，可使三七皂苷乙成分沉淀析出，從而達到提取分離的目的；又如從黃藤中提取巴馬汀，或從三顆針中提取小檗堿，都可用氯化鈉或硫酸銨鹽析制備。 二、透析法 原理:透析法是利用提取液中小分子物質或能在水、乙醇提取液中解離成離子的物質可通過透析膜，而大分子物質（如多糖、蛋白質、鞣質、樹脂等）不能通過透析膜的性質，借以達到分離的一種方法。 應用:此法常用于分離純化皂苷、蛋白質、多肽、多糖等大分子成分，以除去無機鹽、單糖、雙糖等小分子雜質。 透析法示意操作技術將濃縮的中藥水提液或乙醇提取液緩緩加入透析膜袋中，防止膜破裂，懸于盛有蒸餾水的容器內，水浴加

24、溫透析，并保持一定液面。透析過程中經常更換透析袋外的蒸餾水，以保持膜內外有較大濃度差。判定透析是否完全，可用定性反應檢查膜內藥液有效成分或指標成分。 第二章 色譜分離技術必備知識 吸附色譜 分配色譜 離子交換色譜 凝膠色譜 大孔吸附樹脂色譜 高效液相色譜 第一節 必備知識色譜法的概念:色譜法又稱為層析法、色層法及層離法，是一種現代的物理化學分離分析方法。色譜法的分類 按色譜原理不同分類: 吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠過濾色譜。 按操作形式不同分類: 平面色譜 薄層色譜（TLC）、紙色譜（ PC） 、柱色譜（ CC）（吸附柱色譜、分配柱色譜、離子交換柱色譜、凝膠柱色譜等）和毛細管電泳色

25、譜等。 按流動相不同分類: 液相色譜（ LC） 液-固色譜（LSC）、液-液色譜（LLC） 、氣相色譜（ GC） 氣-固色譜（GSC）；氣-液色譜（GLC） 和超臨界流體色譜（SFC）。 第二節 吸附色譜 一、吸附色譜原理(根據物質的吸附性差別進行分離 ) 吸附色譜是利用吸附原理，即利用吸附劑對中藥混合物中各種成分吸附能力的差異，而使混合物中各成分得以分離的色譜方法。 吸附劑的吸附作用主要由固體表面的作用力、氫鍵絡合、靜電引力、范德華力等產生， 吸附劑對各成分吸附能力的大小主要取決于吸附劑本身的結構和性質、被吸附成分的結構和性質以及展開劑的極性大小。 二、吸附色譜基本構成要素 吸附色譜有3個基

26、本構成要素，它們是被分離成分、吸附劑（固定相）及展開劑（流動相）。（一）吸附劑基本要求: 一般來說，吸附劑要有較大的表面積和適宜的活性、與移動相溶劑及被分離各成分不起化學反應、顆粒均勻，并且在所用各種溶劑中不溶解。2. 種類親水性吸附劑：氧化鋁、硅膠、聚酰胺、氧化鎂、硅酸鎂、碳酸鈣和硅藻土等。親脂性吸附劑：活性炭。其中最常用的吸附劑是硅膠、氧化鋁和聚酰胺。 3. 吸附能力(相似者易于吸附 ) 親脂性吸附劑對極性小的化合物吸附能力強，親水性吸附劑對極性大的化合物吸附能力強。一般來說，吸附劑從氧化鋁、氧化鎂、活性炭、硅酸鎂、硅膠、硅酸鈣到硅藻土吸附能力逐漸減弱。 親水性吸附劑的吸附能力與含水量關系

27、密切，含水量越大，吸附能力越弱，為提高親水性吸附劑的吸附能力，必須去除所含水分。在一定溫度下加熱去除吸附劑中水分，提高其吸附能力，使其活性增高，稱為吸附劑的活化。反之，在吸附劑中加入一定量的水分，降低其活性稱為脫活化。 吸附劑的活性根據含水量的多少分為5個級別（ 級、級、級、級和級）。活性級別越小，含水量越少，吸附能力越強；活性級別越大，含水量越多，吸附能力就越弱。4. 分離材料的性能及適用范圍 分離材料是有機化合物分離純化時所使用的基本物質（吸附劑，載體，填料）的總稱。用適當的溶劑從藥用植物原料中提取出的提取物，一般都要經過一系列的分離純化過程，才能得到單體化合物。在分離純化過程中，幾乎都要

28、選擇使用各種類型的分離材料，可以說植化研究所取得的諸多成果與分離材料的不斷創新發展有著十分密切的聯系。分離材料的選擇正確與否，直接影響著分離效果。為了正確認識和掌握各種分離材料的性能、特點及適用范圍，以便分離純化工作的實際應用，現將各種分離材料作一簡要介紹。常用吸附劑簡介 （ 1）硅膠為極性吸附劑，極易吸水，含水量在17%以下才能作為吸附劑。吸附能力來源于化合物形成的氫鍵。活化溫度一般在100-120烘2小時。 常用硅膠有硅膠H（不含黏合劑）、硅膠G（含有黏合劑煅石膏）、硅膠GF245（含煅石膏，另含有一種無機熒光劑）。硅膠GF254在254nm 紫外光下呈強烈黃綠色熒光背景，在熒光背景下通過

29、紫外光照射成分斑點為暗斑，常用于用一般顯色手段不易顯色的成分分離。 硅膠顯弱酸性，適用于中性或酸性成分分離。1、層析紙組成及性質 層析紙是紙層析的支撐物，組成成分主要是纖維素。 層析紙的表面吸附與毛細作用可吸收20-25%的水分，使液-液分配層析在層析紙進行成為可能。 層析紙分為（按層速）快速、中速、慢速三種。適用范圍 適合于親水性成分的分離：糖、甙、氨基酸、有機酸等，一般用于定性分析，很少用于制備性分離。 (2) 氧化鋁 氧化鋁（極性吸附劑）為較早使用的分離材料之一，作為吸附劑，在有機化合物尤其是在生物堿的分離純化中有較好的效果。分類及制備 堿性氧化鋁：直接由Al(OH)3高溫脫水而得pH約

30、為9，160200目柱層析 , 200目以上薄層層析 中性氧化鋁：堿性氧化鋁加入蒸餾水，加熱不斷攪拌，傾出上清液，反復處理至水提取液pH約為7.5，抽干水，烘干活化即得。 酸性氧化鋁：堿性氧化鋁加2倍量水，在加適量鹽酸，使該溶液呈酸性，pH23，傾出酸水，用蒸餾水洗至溶液呈剛果紅，弱紫色，抽濾加熱活化得。 氧化鋁的活性 氧化鋁具有較強的吸水特性，故根據空氣溫度及放置時間的不同，其中水分的含量多不相同，而含水量的多少直接影響到氧化鋁的吸附力（活性），含水量高活力越弱。含水量（%） 活度0 級3 級6 級10 級15 級一般將要活化的氧化鋁，鋪在盤內使厚度在3厘米左右，置于烘箱中，在180左右加熱

31、6小時，即得活性為級氧化鋁，實際使用時，可根據需要，加入適量水分，以獲得所需活度的氧化鋁。氧化鋁分離使用范圍 一般用于薄層層析（TLC）和柱層析的分離中，其中：(1)堿性氧化鋁主要適用于碳氧化合物、生物堿、甾族化合物（不適用醛、酮、酯有機酸）。(2)中性氧化鋁主要適用于中性堿, 脂溶性化合物（也不適用于酸性）。(3)酸性氧化鋁主要適用于有機酸的分離純化（不用于堿性有機物）。注意:由于氧化鋁吸附力強，在使用氧化鋁進行分離時，損失量較大，并且常常能與被分離物質發生不同程度的化學反應、氧化，消除及異構化。在使用時一定要了解待分離物的特性。 硅膠、氧化鋁為極性吸附劑，有以下特點： 對極性物質具有較強的

32、親和能力，極性強的溶質將被優先吸附。 溶劑極性越弱，則吸附劑對溶質將表現出較強的吸附能力。溶劑極性增強，則吸附劑對溶質的吸附能力即隨之減弱。 溶質即使被硅膠、氧化鋁吸附，但一旦加入極性較強的溶劑時，又可被后者置換洗脫下來。 (3) 活性碳 屬于非極性吸附劑，對極性物質吸附力弱，而對非極性物吸附力強。適合于水溶性成分的分離。其吸附力不象氧化鋁、硅膠那樣易于控制。一般多是根據實際要求進行活化處理（120烘2-4小時） 。可使用1N HCl或NaOH進行處理，再以水處理至中性，以除去無機離子。活性碳是一種較強的吸附劑，對空氣中的CO2等的吸附力很大，而使其活性降低。活性碳類型 粉末（比表面大，加壓）

33、; 顆粒狀（比表面小，常壓）; 錦綸活性碳（活性較低，比表面較大）活性碳分離適用范圍 粉狀活性碳：吸附力較強適用于極性較大的化合物。 顆粒狀活性碳：吸附力適中，適用對極性不大的化合物的分離。 錦綸活性碳：吸附力弱，適用于極性小的化合物的分離。 實際工作中，主要用于柱層析分離及色素和非極性雜質的吸附。粉末活性炭在具體運用中，也常拌入3040%的硅藻土進行，以增加流速。(4) 大孔吸附樹脂： 廣泛用于天然產物的分離，在水溶性成分的分離方面，顯示出獨特效果。白色球星顆粒狀，粒度為2060目，通常為非極性和中等極性兩類。理化性質穩定，不溶于酸、堿及有機溶媒。特性及分離原理 :大孔吸附樹脂為吸附性和篩選

34、性原理相結合的分離材料，它本身具有吸附性，是由于范德華引力的結果。篩選性是由于其本身的多孔性結構所決定。因為有這些特性，使得有機化合物尤其是水溶性化合物的提純得以大大簡化。 大孔吸附樹脂的應用范圍 主要用于水溶性化合物的分離純化。如皂苷、黃酮苷等化合物。還廣泛用于工業廢水、廢液的凈化等方面。優點：用于工業化或大規模提取，具有成本低、再生容易、收率較好等特點。預處理及再生 (5)聚酰胺 聚酰胺是由酰胺聚合而成的一類高分子物質。不溶于水及常用的有機溶劑，對酸穩定性差，對堿較穩定。 吸附能力來源于與化合物形成的氫鍵。 （二）展開劑1. 基本要求 色譜展開用的溶劑一般需要重蒸餾或經過其他方法純化處理，

35、以除去干擾色譜的微量雜質，是一種溶劑或兩種及兩種以上的溶劑組成的溶劑系統。主要作用是解吸附。2. 種類親脂性有機溶劑：石油醚、環己烷、四氯化碳 親水性有機溶劑：丙酮、乙醇、甲醇等。 3. 解吸附能力 展開劑解吸附能力的大小與選擇展開劑的極性和被分離成分的極性大小有關。 即被分離成分的極性大，展開劑的極性也要大，根據相似相溶的原理，這樣成分才能隨著展開劑移動而展開分離；反之，分離極性小的成分就要選擇極性小的展開劑。 4. 常用溶劑極性大小 從石油醚、環己烷、四氯化碳、苯、甲苯、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、乙醇、甲醇到水極性依次增大。（三）被分離成分若用親水性吸附劑，被分離成分極性大者吸附

36、牢固，解吸附就困難，色譜中展開的速度慢；反之，吸附能力弱，解吸附就容易。化合物極性大小判斷原則一般如下：分子中母核相同，極性基團越多，極性越大；分子中雙鍵、共軛雙鍵越多，極性越大；同系物中，分子量越小，極性越大；在同一母核中不能形成分子內氫鍵的化合物比能形成分子內氧鍵的化合物極性大。三、吸附色譜的操作技術 吸附色譜操作形式: 吸附薄層色譜、吸附柱色譜。（一）吸附薄層色譜操作技術 1. 吸附薄層板的制備 2. 點樣:溶解樣品的溶劑最好與展開劑極性相近，易揮發；吸取樣液的毛細管管口要平整；點樣位置距薄層板底1-1.5cm，斑點直徑不超過2-3mm；點樣量要適度。 3. 展開: 4. 顯色 專屬性顯

37、色劑，未知成分一般可選用碘蒸氣熏或噴5%濃硫酸-乙醇液顯色；具腐蝕性的顯色劑只能用在硅膠G板上。 5. 比移值 比移值（Rf值）表示的是某一化合物經過展開后在薄層板上的相對位置。計算方法是原點到色斑中心的距離除以原點到溶劑前沿的距離，或為斑點移動的距離與溶劑移動的距離之比。Rf值越大表示該化合物展開的速度越快；反之，展開速度慢。一般來說Rf值與板的厚度成正比。6. 應用 薄層層析在中藥研究中是一種常用的分析手段，科研工作中也是一種最常用的分離分析方法。TLC可用于成分的分離，定性、定量檢查，同時為其他的分析手段提供一定的分離依據。 （二）吸附柱色譜操作技術1. 吸附柱色譜的制備（ 1）吸附柱色

38、譜的含義吸附柱色譜是指將吸附劑（通常為100目-200目左右）裝入色譜柱中用于分離化合物的操作技術。（ 2）制備方法干法裝柱: 直接用小漏斗將吸附劑均勻裝入柱內的方法。濕法裝柱: 將吸附劑裝入盛有洗脫液的柱內，或將吸附劑與洗脫液混合成混是液再裝入柱中。 （3）操作要點: 裝柱前柱底要墊一層脫脂棉以防吸附劑外漏。 干法裝柱時要用橡皮槌輕輕敲打色譜柱，使吸附劑裝填連續均勻、緊密，然后用洗脫劑洗脫并保持一定液面； 濕法裝柱時注意打開下端活塞，洗脫劑應始終保持一定的液面高度。 為了增強分離效果，提高分離速度，可在柱面覆蓋一層處理干凈的均勻的細沙。2. 上樣（ 1）將樣品溶于少量的洗脫劑中加于色譜柱頂端

39、的操作。（ 2）操作要點: 將樣品溶于開始的洗脫劑中制成體積小、濃度高的溶液； 上樣時注意沿著柱內壁慢慢加入，始終保持吸附劑上端表面平整； 上樣量為吸附劑的1/60-1/30。3.洗脫檢查 洗脫劑的選用可通過薄層色譜篩選，一般TLC展開時Rf值為0.2-0.3的溶劑系統是最佳的洗脫系統，采用梯度洗脫法洗脫；用薄層色譜或紙色譜做定性檢查，合并同一組分溶液。 硅膠、氧化鋁柱色譜注意事項 硅膠、氧化鋁吸附柱色譜過程中，吸附劑的用量一般為試樣量的30-60倍。試樣極性較小、難以分離者，吸附劑用量可適當提高至試樣量的100-200 倍。 硅膠、氧化鋁吸附柱色譜，應盡可能選用極性小的溶劑裝柱和溶解試樣，以

40、利試樣在吸附劑柱上形成狹窄的原始譜帶。 洗脫用溶劑的極性宜逐步增加，但跳躍不能太大。實踐中多用混合溶劑，并通過巧妙調節比例以改變極性，達到梯度洗脫分離物質的目的。 為避免發生化學吸附，酸性物質宜用硅膠、堿性物質則宜用氧化鋁進行分離。通常在分離酸性（或堿性）物質時，洗脫溶劑中分別加入適量醋酸（或氨、吡啶、二乙胺），常可收到防止拖尾、促進分離的效果。吸附柱色譜也可用加壓方式進行，溶劑系統可通過TLC進行篩選。但因TLC用吸附劑的表面積一般為柱色譜用的二倍左右，故一般TLC展開時使組分RF值達到0.2-0.3的溶劑系統可選用為柱色譜分離該相應組分的最佳溶劑系統。 （三）聚酰胺色譜操作技術1. 聚酰胺

41、色譜的制備 (1)聚酰胺色譜的類型:聚酰胺薄層色譜和聚酰胺柱色譜兩大類。 (2)聚酰胺色譜的制備方法:聚酰胺薄層色譜又叫聚酰胺片，無需制備，可直接購入預制商品。聚酰胺柱色譜的制備操作與吸附柱色譜類似，常用濕法裝柱，即取聚酰胺粉用水浸泡1h后，攪勻裝柱。2. 分離操作技術（1）聚酰胺薄層色譜分離成分按薄層色譜操作方法進行，聚酰胺片可再生反復使用。（2）聚酰胺柱色譜分離成分操作，洗脫液必須以水為基本溶劑進行洗脫。 3.聚酰胺色譜的分離原理 聚酰胺吸附原理圖解 影響聚酰胺吸附力的主要因素影響聚酰胺吸附力的主要因素如下 (1)形成氫鍵的能力與溶劑有關。一般聚酰胺在水中與化合物形成氫鍵的能力最強，在有機

42、溶劑中較弱，在堿性溶劑中最弱。因此溶劑對聚酰胺的洗脫能力的次序為：水甲醇或乙醇丙酮稀氫氧化鈉水溶液或稀氨水甲酰胺或二甲基甲酰胺。(2)與被分離成分的結構有關。與聚酰胺形成氫鍵的基團越多，吸附力越強。如間苯三酚間苯二酚苯酚。形成氫鍵基團所處的位置不同，被聚酰胺吸附的強弱也不同。如對位及間位的吸附力大于鄰位。芳香化程度越高，吸附力越強。能形成分子內氫鍵的化合物則吸附力減弱。4. 聚酰胺色譜的應用聚酰胺對黃酮類、酚類、醌類成分的分離效果較好，并廣泛應用于生物堿、萜類、甾體、糖類等極性化合物與非極性化合物的分離。聚酰胺對鞣質的吸附幾乎不可逆，吸附力特強，因而特適于植物粗提取液的脫鞣處理。聚酰胺薄層色譜

43、適用范圍較廣，特別適用于分離含游離酚羥基的黃酮及苷類。常用于分離黃酮及苷類的展開劑有乙醇-水（ 3:2）、水-乙醇-乙酰丙酮（4:2:1）、丙酮-水（ 1:1）、水飽和的正丁醇-醋酸（ 100:1）等。聚酰胺柱色譜的樣品分離量大，適于制備性分離。第三節 分配色譜一、分配色譜原理分配色譜是利用分配原理，即混合物中各成分在固定相（S）和移動相（M）之間的分配系數（ K）的差異使混合物中各成分得以分離的色譜方法。分配系數為在一定的溫度和壓力下，溶質在兩相間分配達到平衡時，溶質在固定相和移動相之間分配的濃度的比值。 二、分配色譜基本構成要素分配色譜有4個基本構成要素，它們是支持劑、固定相、流動相和被分

44、離成分。（一）支持劑1. 基本要求支持劑又稱載體，在分配色譜中僅作為載負固定相的介質。基本要求為：中性多孔的粉末，無吸附作用，不溶于所用的溶劑中；可吸收一定量的固定液，不影響流動液的通過；不影響溶劑的性質和組成。2. 種類硅膠：含水17%(以上無吸附作用，可作為載體。吸水量可達50%以上。硅藻土：惰性多用。可吸收其質量的100%的水分。纖維素：惰性，常用。 （二）固定相 1.種類極性和親水性溶劑：水、各種水溶液（酸、堿、鹽與緩沖液）、甲醇、甲酰胺等。親脂性溶劑：硅油、液體石蠟、石油醚等。 2.選用原則當分離親水性成分時，選用極性和親水性溶劑為固定相；分離親脂性成分時，選用親脂性溶劑為固定相。（

45、三）流動相 1.種類親脂性溶劑：石油醚、苯、鹵代烴類、脂類、酮類等或其混合物。極性和親水性溶劑：水、各種水溶液及和水相混溶的有機溶劑。 2. 選用原則當分離親水性成分時，選用親脂性溶劑為流動相；分離親脂性成分時，選用極性和親水性溶劑為流動相。（四）被分離成分一般情況下，若被分離成分的極性大，選用極性大的固定相和極性小的流動相；若被分離成分的極性小，則選用極性小的固定相和極性大的流動相。 三、分配色譜的類型按操作形式分為紙色譜、分配薄層色譜和分配柱色譜。 2. 按相的選擇極性不同分為正相色譜和反相色譜。正相色譜是指固定相的極性大于流動相極性的分配色譜，在正相色譜中極性小的成分先被展開或洗脫；反相

46、色譜是指固定相的極性小于流動相極性的分配色譜，在反相色譜中極性大的成分先被展開或洗脫。四、分配柱色譜的操作技術 1. 含義:將吸附有固定液的載體裝入色譜柱中進行分離和檢查混合物成分的色譜方法。 2. 分配柱色譜的主要組成支持劑：含水17%以上的硅膠、硅藻土和纖維素粉。加壓柱色譜中所用的載體顆粒直徑更小，小于常壓柱色譜中所用載體顆粒直徑的10 倍以上。固定相：通常為水。流動相：常用的是含水的有機溶劑。 3. 分配柱色譜的類型（1）按是否加壓分為常壓柱色譜和加壓柱色譜，根據對流動相加壓從小到大的順序可分為快速色譜、低壓液相色譜、中壓液相色譜和高壓液相色譜。（2）按相極性不同分為正相分配柱色譜和反向

47、分配柱色譜。 4. 分配柱色譜的操作技術 （1）裝柱用濕法裝柱。裝柱時先將固定相溶劑（如水或其他極性溶劑）加入支持劑中，攪拌混合均勻，然后上柱。在色譜柱中預先加入已用固定相溶劑充分飽和的流動相溶劑。注意不斷輕敲管壁，使其均勻緊密。（2）上樣及洗脫過程與吸附柱色譜相同。分配柱色譜所用的溶劑系統，可用相應的紙色譜或分配薄層條件進行選擇。所用的洗脫液必須事先用固定相飽和，否則會破壞分配系統，影響分高效果。（3）收集洗脫液檢查結果與吸附柱色譜操作相同。第四節離子交換色譜 一、離子交換色譜原理(根據物質離解程度不同進行分離) 根據離子交換樹脂中的酸性和堿性基團離子在水溶液中能與溶液中的其他離子起交換作用

48、，利用交換能力的差異分離不同類型的離子化合物的色譜方法。離子交換劑的交換反應可用下式表示： 二、離子交換色譜基本構成要素離子交換色譜（IEC）基本構成要素有固定相、流動相和被分離成分。（一）固定相固定相是離子交換劑，有離子交換樹脂和硅膠化學鍵合離子交換劑兩類。常用的是離子交換樹脂。離子交換樹脂的種類2. 離子交換樹脂的性能（1）交聯度是表示離子交換樹脂中交聯劑的百分含量。如上海樹脂廠生產的聚苯乙烯強酸型陽離子交換樹脂，產品牌號為732（強酸1X7），其中1X7 即表示交聯度是7%。交聯度提示了樹脂孔隙的大小，交聯度大，形成的網狀結構緊密，孔隙網眼小，能交換的離子小，大離子不易進入樹脂顆粒的內部

49、。一般商品樹脂的交聯度有1%-16%。（2）交換容量表示離子交換樹脂的交換能力。（二）流動相常用具一定pH和離子強度的緩沖溶液，如磷酸鹽緩沖液。有時也可加入少量有機溶劑提高選擇性，如揮發性有機酸（甲酸、醋酸）、堿等做成的緩沖液。（三）被分離成分被分離成分必須具有一定的離子強度。三、影響離子交換的主要因素1.交換離子的影響:只要能形成離子即可與離子交換樹脂進行交換。離子化程度越高越容易交換。2. 溫度的影響:一般來說，溫度越高，離子交換越快，越容易交換；反之，不易交換。3. 溶劑的影響:在水或含水溶劑中容易進行交換，在極性小的溶劑中離子交換困難。4.交換溶液濃度的影響:交換溶液濃度不宜過高，否則

50、會使交換能力大大降低，交換溶液濃度越低交換速度越快。四、離子交換色譜的操作技術 1. 樹脂的預處理: 方法將市售樹脂浸在蒸餾水中1-2天，使其充分膨脹后，裝在色譜柱中，再按下述方法處理。市售的陽離子交換樹脂均為鈉型，要轉為氫型備用。陰離子交換樹脂市售的為氯型，可轉為氫氧型備用。 2.裝柱: 樹脂與水充分攪拌均勻，并排盡氣泡，樹脂與水同時倒入色譜管中，裝好柱后樹脂層中不應有空氣，以免影響交換容量。 3. 上樣交換: 將樣品溶液通過離子交換樹脂柱進行交換。 4.洗脫: 選擇適當的溶劑洗脫，洗脫的原則是選擇比已交換的離子更活潑的離子溶液把交換的離子替換下來。隨著洗脫劑的移動，樣品的離子成分在柱上反復

51、進行著交換-洗脫-再交換-再洗脫的過程，從而使交換能力不同的離子化合物分先后流出。5.收集檢查: 分段定量收集洗脫液，定性檢查合并單一成分化合物的溶液，再進行進一步的精制。6. 樹脂的再生（ 1）含義樹脂的再生是指離子交換樹脂在使用后失去交換能力，通過處理恢復交換能力的過程。（ 2）方法再生的方法基本與預處理相同。樹脂如不用時，可加水浸泡保存。其操作裝置見圖。五、離子交換色譜的應用離子交換色譜是20世紀70年代發展起來的一種新的分析技術。主要用于能產生離子型的成分如氨基酸、肽類、生物堿、有機酸、酚類等成分的分離，并廣泛應用于醫藥、環保（如水質的測定）、食品等多種行業。用陽離子交換樹脂分離去除生

52、物堿酸水液中非生物堿部分，主要流程如下： 離子交換樹脂法分離物質的模型 第五節凝膠色譜 一、凝膠色譜的概念以多孔凝膠作為固定相的柱色譜形式稱為凝膠色譜。二、凝膠色譜原理(根據物質分子大小差別進行分離) 凝膠色譜原理是分子篩分離物質的原理。因凝膠顆粒具三維的網狀結構，在水中可膨脹，并有許多一定大小的網眼，當溶液通過凝膠顆粒時，溶液中分子直徑小于網眼的成分可進入凝膠內部，而分子直徑大于網眼的成分則被排阻在凝膠顆粒之外，按分子由大到小的順序流出分離。因此凝膠色譜又稱為分子排阻色譜、凝膠過濾色譜、凝膠滲透色譜等。 凝膠色譜原理圖 1小分子物質； 2大分子物質； 3凝膠顆粒假定從柱上加入試樣算起，至某個組分集中流出時所需溶劑體積為Ve,（稱為洗脫體積），則Ve與組分分子量之間有下列關系。 因K1,K2均為常數，故洗脫體積（Ve）取決于分子量（M）的大小。M越大，則Ve越小；M越小，則Ve 越大。由此進一步說明了凝膠濾過的洗脫規律。一般，分離條件一定時，Ve重現性很好，可用來表示物質的洗脫性質。三、凝膠色譜基本構成要素固定相、流動相以及被分離成分的溶液。（一）固定相1. 種類固定相是多孔凝膠。主要有葡聚糖凝膠（Sephadex G）和羥丙基葡聚糖凝膠（Sep