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文檔簡介

1、實驗八硝酸還原酶活性測定一、目的硝酸還原酶是植物氮素代謝中的關(guān)鍵酶之一，它與作物吸收利用氮肥有關(guān)， 對作物的產(chǎn)量和品質(zhì)有影響。因而可以把硝酸還原酶的活力當作植物營養(yǎng)或農(nóng)田 施肥的指標之一，也可作為品種選育的指標之一。通過本實驗可初步掌握測定硝 酸還原酶活性的原理與方法。二、原理硝酸還原酶能將NO3-還原成NO2-NO, + NADH + 小衛(wèi)里%& + NAD, + 哄產(chǎn)生的no2-的量與硝酸還原酶的活性相關(guān)。通過測定反應液中產(chǎn)生的no2- 含量，即可確定酶活性大小。NO2-含量可用磺胺顯色法測定。NO2-與磺胺及a-萘胺在酸性條件下生成紅 色偶氮化合物其反應如下：酶活性可用單位鮮重組織在單位

2、時間內(nèi)產(chǎn)生的亞硝酸量來表示: 亞硝酸態(tài)氮微克數(shù)/克鮮重組織1小時。三、實驗材料、儀器和試劑實驗材料 植物的根、莖、葉，本實驗選用白蘿卜葉片儀器（1）分光光度計（2）離心機（3）真空泵和真空干燥器（4）恒溫水浴鍋（5）恒溫箱（6）刻度吸管（lml、2ml、5ml）（7）試管 （8）天平 （9）三角瓶（50ml）3 .試劑（1）亞硝酸鈉標準液：稱取0.1000g亞硝酸鈉（AR），用蒸餾水溶解并定容 至100ml。然后吸取5ml再用蒸餾水定客至1000m1。即為濃度5p g / ml的亞硝 酸鈉標準液。0.lmol - L-ipH7.5 磷酸緩沖液0.2 mol - L-1的硝酸鉀溶液1 %對氨基苯

3、磺磷酸2%a 萘胺30%三氯乙酸四、操作步驟標準曲線的制作取6支試管，編號，按下表操作操作項目管號123456NaNO2淀標準液(ml)00.40.81.21.62.0蒸餾水(ml)2.01.61.20.80.40NaNO2含量（p g）0246810磺胺(ml)各4a 萘胺各4搖勻在30C水浴中保溫20分鐘。然后在520ml波長下比色測定消光值。以亞硝酸鈉含量為橫坐標，消光值為縱坐標繪制標準曲線。酶反應和酶活性測定將白蘿卜葉片洗靜，剪成0.5cm2h的小片，混勻后稱三份，每份0.5 1.0g, 分另放人50ml的三角瓶中，編號按下表加試劑搖勻，置真空于燥器中，抽氣10分鐘。然后將三角瓶放人恒溫箱，在30C暗條件 下保溫30分鐘。取出后向2, 3號瓶中分別加人l ml 30%三氯乙酸終止反應，將 反應液離心(3000rmp 10分鐘)或過濾。分另吸取2ml反應液于三只試管中各加4ml 1%磺胺和0.2 % a萘胺。搖勻在30C水浴中保溫20分鐘。然后在520ml波長下比色測定消光值。五、結(jié)果與計算酶活性(亞硝酸鈉p g / g鮮重 h)=亞硝酸鈉微克數(shù)(|J g)X稀 釋倍數(shù)/樣品重(g)X時間(h)六、注意事項酶促反應在暗條件下進行，以防光照下葉綠體

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