1、文檔編碼 : CT6K3F2H2L6 HH8W5B6W3U6 ZQ3V9G7V6R3生 物 化 學 實 驗（上）試驗一 酶促反應動力學試驗底物濃度對酶活性的影響 pH 對酶活性的影響溫度對酶活性的影響華中科技高校生命科學與技術學院20XX級生物化學小老師 第一組酶促反應動力學綜合試驗試驗（一）堿性磷酸酶【試驗目的】1.明白底物濃度對酶促反應速率的影響Km 值的測定2.把握米氏方程、Km 值的物理意義及雙倒數作圖求Km 的方法；【試驗原理】1.米氏方程：1 式中： v 表示酶促反應速率,表示酶促反應最大速率,S表示底物濃度,Km 表示米氏常數；v=Vmax S/ （Km+S ,這個方程稱為Mic

2、haelis-Menten 方程,是在假定存在一個穩態反應條件下推導出來的,其中 Km 值稱為米氏常數, Vmax 是酶被底物飽和時的反應速度,S為底物濃度；由此可見 Km 值的物理意義為反應速度 v 達到 1/2Vmax 時的底物濃度（即Km=S ）,單位一般為 mol/L ,只由酶的性質準備,而與酶的濃度無關；可用 Km 的值鑒別不同的酶； 當底物濃度特殊大時,反應速度接近于一個恒定值；在曲線的這個區域,酶幾乎被底物飽和,反應相對于底物S 是個零級反應；就是說再增加底物對反應速度沒有什么影響；反應速度逐步趨近的恒定值稱為最大反應速度 Vmax ；米氏常數 Km 是酶促反應速度 v 為最大酶

3、促反應速度值一半時的底物濃度；這可通過用 S取代米氏方程中的 Km 證明,通過運算可得 v=Vmax /2 ；2. Km 值的測定主要接受圖解法,有四種：雙曲線作圖法（圖a）1/2時的底物濃度 s值即為 Km 值,以克分子濃度依據公式（ 1）,以 v 對s作圖,此時（M ）表示；這種方法實際上很少接受,由于在試驗條件下的底物濃度很難使酶達到飽和；實測一個近似值, 因而 1/2不精確； 此外由于 v 對S的關系呈雙曲線,試驗數據要求較多,且不易繪制； Lineweaver- Burk 作圖法雙倒數作圖法（圖 b）實際工作中,常將米氏方程（式（1）作數學變換,使之成為直線形式,測定要便利、精確得多

4、；其中之一即取（1）式的倒數,變換為Lineweaver- Burk 方程式：2 以1 對 .1作圖,即為y=ax+b 形式；此時斜率為,縱截距為；把直線外推與橫軸相S交,其截距即為；Hofstee 作圖法（圖略 ,不要求）把（ 2）式等號兩邊乘以 Vmax,得：3 以 v 對作圖,這時斜率為,縱截距為,橫截距為；Hanas 作圖法（圖略,不要求）把（ 2）式等號兩邊乘以 S, 得：4 以 v 對作圖,這時斜率為,縱截距為；（a）b Km 值；具體原理如本試驗主要以雙倒數法,即 Lineweaver- Burk 作圖法來測定堿性磷酸酶下：本試驗以堿性磷酸酶為例,用磷酸苯二鈉為其作用物,堿性磷酸

5、酶能分解磷酸苯二鈉產生酚和磷酸,在適宜條件下,精確反應15 分鐘；在堿性條件下酚可與酚試劑生成藍色化合物,以波長 660nm 比色；在確定條件下色澤深淺與光密度成正比；反應式如下：然后以光密度直接表示不同底物濃度時的酶反應速度（摸索分析這樣處理的原理及合理性）,即以光密度的倒數作縱坐標,以底物濃度的倒數作橫坐標,按 Lineweaver- Burk 作圖法來測定堿性磷酸酶 Km 值；【儀器與試劑】儀器：1. 恒溫水浴鍋；2. 721 型分光光度計；3. 試管；4. 吸量管；5. 移液槍；6. 燒杯；試劑：1. 酚試劑2. 2.5mM 磷酸苯二鈉基質液3. 堿性緩沖液（ pH10.0 ）4. 堿

6、性磷酸酶【留意事項】1. 加入堿性磷酸酶的量要精確,并且 提前進行預熱 ；2. 保溫時間要精確,不同試管加熱時間須保持一樣 ,留意計時方法；3、磷酸苯二鈉為 2.5mmol/L ,留意與后兩個試驗區分；4、使用分光光度計和移液槍時留意操作步驟；【試驗步驟】取 6 支試管按下表加入試劑：0 號管切勿加酶！2 3 4 5 0 1 2.5mM 磷酸苯二鈉（ mL ）1.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸餾水（ mL ）0.2 0.8 0.6 0.4 0.2 - 堿性緩沖液 （pH10.0）（mL）1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 混勻后, 37預溫 5 分鐘；留意：反應堿性

7、磷酸酶溶液應先放于水浴鍋中預熱達到 37,再滴加到試管中參與堿性磷酸酶液（mL ）- 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 混勻后, 37水浴 15 分鐘（精確計時）；留意： 1）加入堿性磷酸酶液要快速、精確；（用移液槍加）2）酶促反應溶液 總體積 2.2mL ；3）第 0 管不加酶,基本無反應；酚試劑（ mL ）1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 10%Na 2CO3 mL 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 混勻后, 37水浴 15 分鐘（精確計時）；留意： 1）酚試劑為顯色劑,同時為酶的變性劑,故加入酚試劑后酶促反應停止；以 0 號管調零,在2）Na2CO3 供

8、應堿性環境,加入 Na2CO 3后試劑才顯色, 37水浴使顯色充分；660nm 波特長比色；【結果處理】1將各管光密度和底物濃度記入下表: 2 3 4 5 管號1 O.D1 O.D2 O.D3 O.D（均值）1/O.D S 請自行運算 1/S 2以 1/O.D 為縱坐標, 1/s為橫坐標,按Lineweaver- Burk 作圖,求出堿性磷酸酶的Km值,并分析試驗結果；【試驗目的】試驗（二）PH對酶活性的影響明白 PH 對酶活性及酶促反應速度的影響,加深對酶特性的熟識；【試驗原理】大部分酶活力受其環境 pH 的影響；在確定的 pH 下,酶反應具有最大速度,高于或低于此值,反應速度下降,通常稱此

9、 pH 值為酶反應的最適 pH；不同的酶具有不同的最適 pH；【儀器與試劑】儀器：1. 恒溫水浴鍋；2. 試管和試管架；3. 移液槍及槍頭；4. 721 型分光光度計；5. 移液管；試劑：1、0.01M 磷酸苯二鈉；2、堿性磷酸酶液（pH=10）；3、不同 pH 緩沖液；4、酚試劑和 10% Na 2CO 3 溶液；【留意事項】1、堿性磷酸酶溶液應先放于水浴鍋中預熱 達到 37,再滴加到試管中參與反應2、留意磷酸苯二鈉為 0.01mmol/L ,與試驗一不同【試驗步驟】取六支干凈試管,編號后按表操作：管號0 1 2 3 4 5 0.01M 磷酸苯二鈉 （mL）0.3 0.3 0.3 0.3 0

10、.3 0.3 緩沖溶液蒸餾水pH 9 pH 10 pH 11 pH 12 pH 12 1.2mL1.0mL 1.0mL1.0mL1.0mL1.0mL混勻,置于37水浴 5min；留意：堿性磷酸酶溶液應先置于水浴鍋中預熱到 37, 再滴加到試管中參與反應堿性磷酸酶液（mL）- 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 混勻,再置于 37水浴 15min；酚試劑（ mL）1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 10%Na 2CO3 mL 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 混勻后,置于 37水浴中再次保溫 15min,然后以第 0 管調零點,用 660nm 波長比色；以各管 pH

11、 為橫坐標, 光密度為縱坐標繪制曲線,從曲線上可大致得出堿性磷酸酶的最適 pH；【結果處理】記錄現象（或比較吸光度值）分析；,以 pH 為橫坐標、吸光度為縱坐標制圖,依據圖象做出合理試驗（三）溫度對酶活性的影響【試驗目的】明白溫度對酶活性及酶促反應速率的影響,加深對酶特性的熟識；【試驗原理】每種酶都有其最適溫度,高于或低于此溫度酶的活性都降低；一般而言, 如酶處于過高的 溫度環境中, 會使酶活性永久丟失；而如處于極低溫度的環境中只會使酶活性受到抑制,一 旦溫度適宜,酶又會全部或部分的復原其活性；【儀器與試劑】儀器：1. 恒溫水浴鍋；2. 試管和試管架；3. 移液槍及槍頭；4. 721 型分光光

12、度計；5. 移液管；試劑：1堿性緩沖液：同試驗一中堿性緩沖液配制（pH=10 ）；20.01M 磷酸苯二鈉；3酚試劑；4堿性磷酸酶液；510% Na 2CO 3 溶液；【留意事項】1. 加入堿性磷酸酶的量要精確；2. 保溫時間要精確,留意計時方法；3. 將試管從水浴鍋中拿出后再加入酚試劑和碳酸鈉溶液,馬上搖勻之后在室溫下 放置 15min；【留意事項】1. 加入堿性磷酸酶的量要精確,并且提前放入不同溫度水浴鍋中進行 預熱 ；2. 對反應溫度的把握要嚴格,不同溫度下反應的時間必需保證 一樣 ,建議每隔一分鐘向裝有底物的試管中加入酶液,便于用秒表計時；3. 將試管從水浴鍋中拿出后再加入酚試劑和碳酸

13、鈉溶液,馬上搖勻之后在 室溫下放置 15min； 4、留意磷酸苯二鈉為0.01mmol/L ,與試驗一不同【試驗步驟】取 6 支干凈試管,參照下表加入試劑：0.01M 磷酸苯二鈉（ mL）0 1 2 3 4 5 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 堿性緩沖液（ mL ）1.2 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 混勻后,將 05 管分別置于室溫、 37、50、60、70和 80中水浴 5min ；留意：堿性磷酸酶溶液應先放于不同水浴鍋中預熱,再滴加到試管中參與反應堿性磷酸酶液（mL）- 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 混勻后,連續原溫度水浴加熱15min（精確計時）；酚

14、試劑（ mL ）1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 10%Na 2CO 3mL 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 混勻后,室溫放置15min 后,以第 0 管調零,用660nm 波長比色；再以溫度為橫坐標,光密度為縱坐標,繪制曲線；從曲線上可得出此試驗條件下堿性磷酸酶的最適溫度；【結果處理】記錄現象（或比較吸光度值）分析【摸索題】,以溫度為橫坐標、吸光度為縱坐標制圖,依據圖象做出合理1.反應時間 15min 是經過試驗得出的較好結果,試分析時間長了或短了會有何影響 .2.回答試驗原理中括號中的摸索題3.其次個試驗中兩次水浴的目的分別是什么,去掉其中一個行不行,為何？附

15、錄 儀器操作規范與留意事項移液槍使用留意事項：1. 不使用時,請豎直放置；2. 槍頭為一次性,可多次吸取同一種液體,不行吸取不同液體；3. 吸液時,拇指向下壓到有阻力,然后輕輕釋放（確定不能松開拇指）體因慣性沖入移液管；,防止液4. 吸液時,槍頭內不能有氣泡；規范操作： 取移液槍調至所需加液用量,套上槍頭, 大拇指摁下按鈕到剛有阻力時將槍頭伸入液體中,輕輕吸上液體,放出液體時按鈕按到底即可；移液管使用留意事項：1. 使用前必需清洗干凈,用吸水紙將尖端內外的水除去,然后用待吸溶液洗三 次,洗的時候,吸取液體約占管身的三分之一,將移液管潤洗即可；洗過的 溶液應從流液口放出棄之；2. 吸取溶液時,管

16、尖應深化液面10-20mm,并隨液面下降而下降,用洗耳球在移液管另一側將液體吸入管中, （切忌用嘴吸）吸液時,手應 慢慢放松洗耳球 ,防止讓移液管內液體上升太快導致液體沖入洗耳球中；另外不要讓液面升得太高,使管壁沾附過多的液體,以免在調定液面和排液時流下來,影響容量的精確度；3. 調定液面或放液時吸管均應 垂直放置 ,其流液口與容器內壁相接觸,接受容器須傾斜 30 ,移液管者始終保持垂直；為保證液體完全流出,要 等待約 3秒鐘 ,方可拿開；4 . 吸管內的溶液按規定方法排出后,移液管尖嘴的殘留液, 假如移液管上 沒有標明“ 吹” 的字樣 ,不能排到接受容器中,如有,就用洗耳球將剩余液體吹 入；

17、注：當吸取有毒或腐蝕性液體,可選用有安全泡的吸管,并使用吸具（如洗 耳球等）操作 移液管規范操作：使用移液管前,先看移液管上的標記,刻度線位置,檢查管頭是否損壞；潤洗時,先慢慢吸入移液管長度的1/3 左右,將移液管橫置,并轉動移液管使溶液接觸到刻度線以上的部分,進行潤洗；隨后將溶液由管下口棄去,并用洗耳球吹去殘余液體；反復潤洗三次；分光光度計使用步驟一.預熱使用前插上插頭；打開開關,預熱 20min；二.選定波長三調零：1.將黑色比色皿和參比液放入培養皿內,并將黑色培養皿拉入光路,按模式鍵調至 T,按 0%鍵將透光率調為 0；2.拉動伸縮桿,將參比液拉入光路,按 100%鍵,將透光率調為 10

18、0；3.再按模式鍵調至 A 模式,顯示屏顯示 0.00 即可；四樣品測定將待測樣品拉入光路,顯示屏上的示數即為光密度值；保持光路中的樣品不變,打開蓋子,再將蓋子蓋上,就再次讀出光密度值,重復測量三次,取其平均值,即為該樣品的光密度值；五試驗完畢清理儀器,將比色皿洗干凈,用濾紙吸干,再用擦鏡紙順一個方向擦干,放入盒子內；最終關閉電源,拔掉插頭；留意事項：1. 預熱和不測定時應將暗箱蓋打開,以延長光電管壽命2. 測定系列溶液時,應從稀到濃的次序3. 讀數應在 0.1-1.0 間. 4. 留意調零校準；5. 留意如分光計示數不穩固, 馬上檢查比色皿是否干凈, 波長是否為 660nm；使用比色皿留意事項：1. 比色皿應輕拿輕放,以免