1、基因工程一、基因工程的概念基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴格的設計，并通過體外DNA重組和轉基因等技術，賦予生物以新的遺傳特性，從而創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的額，因此又叫做DNA重組技術。基因工程的別名基因拼接技術或DNA重組技術操作環境生物體外操作對象基因操作水平DNA分子水平基本過程剪切T拼接f導入f表達實質（原理）基因重組結果改造的方向克服遠緣雜交不親和的障礙，定向改造生物的遺傳特性二、基因工程的基本工具1、限制性核酸切酶“分子手術刀”2、DNA連接酶-分子縫合針”3、基因進入受體細胞的載體“分子運輸車”1“分子手術刀

2、”限制性核酸內切酶（限制酶）（1）存在：主要存在于原核生物中。word專業資料（2）特性：特異性，一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并且能在wordword專業資料（5）識別序列的特點：呈現堿基互外對楸無論是奇數個械基還是偶數個堿基都可以找到一條中心制練如圖,中軸線兩惻的雙鏈DNACCGC上的硫基是反向對稱重財洌的。如皿CG以中心線為CCAGGA臥兩側破基互補對稱；以為軸倆側做基互補GGTCCT中軸線對稱中軸線6)切割后末端的種類：DNA分子經限制酶切割產生的DNA片段末端通常有兩種形式在它識別序列的黏性末端和平末端。當限制酶中軸線兩側將DNA的兩條鏈分別切開時，產生的是黏性末端，當限制

3、酶在它識別序列的中軸線處切開時，產生的則是平末端。2“分子縫合針”一DNA連接酶(1)作用：將限制酶切割下來的DNA片段拼接成DNA分子。(2)類型種類EcoliDNA連接酶T4噬菌體來源大腸桿菌功能特性只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來縫合兩種末端，但連接平末端之間的效率較低相同點：都連接磷酸二酯鍵G1AATTCI-tt-l-i-iICTTA3“分子運輸車”載體載體具備的條件：能在受體細胞中復制并穩定保存。具有一個至多個限制酶切點，供外源DNA片段插入。具有標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。最常用的載體是質粒，它是一種裸露的、結構簡單的、獨立于細菌擬核之外，并具有自

4、我復制能力的雙鏈環狀DNA分子。其他載體：入噬菌體的衍生物、動植物病毒。(4)載體的作用:作為運載工具，將目的基因送入受體細胞。在受體細胞對目的基因進行大量復制。【解題技巧】(1)限制酶是一類酶，而不是一種酶。限制酶的成分為蛋白質，其作用的發揮需要適宜的理化條件，高溫、強酸或強堿均易使之變性失活。在切割目的基因和載體時要求用同一種限制酶，目的是產生相同的黏性末端。獲取一個目的基因需限制酶剪切兩次，共產生4個黏性末端或平末端。不同DNA分子用同一種限制酶切割產生的黏性末端都相同，同一個DNA分子用不同的限制酶切割，產生的黏性末端一般不相同。限制酶切割位點應位于標記基因之外，不能破壞標記基因，以便

5、于進行檢測。基因工程中的載體與細胞膜上物質運輸的載體不同。基因工程中的載體是DNA分子，能將目的基因導入受體細胞；膜載體是蛋白質，與細胞膜的通透性有關。的基因導入受體細胞；膜載體是蛋白質，與細胞膜的通透性有關。基因工程中有3種工具，但工具酶只有2種。例1限制酶Muni和限制酶EcoRI的識別序列及切割位點分別是CIAATTG-和GJAATTC。如圖表示四種質粒和目的基因，其中，箭頭所指部位為限制酶的識別位點，質粒的陰影部分表示標記基因。適于作為圖示目的基因載體的質粒是()冃的基因CTTAAGCTTAAGGAATTCGAATTC含口的基因的DNA片段Muni畑RlEcgRACBDMuni畑RlE

6、cgRACBD限制酶的應用特點（1）在獲取目的基因和切割載體時通常用同種限制酶，以獲得相同的黏性末端。但是如果用兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端相同時，在DNA連接酶的作用下目的基因與載體也可以連接起來。（2）為了防止載體或目的基因的黏性末端自己連接，可用不同的限制酶分別處理目的基因和載體，使目的基因兩側及載體上具有兩個不同的黏性末端五種酶的比較作用底物作用部位形成產物限制性切酶DNA分子磷酸二酯鍵黏性末端或平末端DNA連接酶DNA片段磷酸二酯鍵重組DNA分子DNA聚合酶脫氧核苷酸磷酸二酯鍵子代DNADNA解旋酶DNA分子堿基對間的氫鍵脫氧核苷酸單鏈RNA聚合酶核糖核苷酸磷酸二酯鍵核糖核苷酸

7、單鏈三、基因工程的操作步驟1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構建3、將目的基因導入受體細胞4、目的基因的檢測與鑒定1、目的基因的獲取獲取目的基因的方法：（1）直接分離法從基因文庫中獲取目的基因將含有某種生物不同基因的許多DNA短片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。包括基因組文庫和cDNA文庫。直接從基因組中獲取目的基因最常用的方法是：“鳥槍法”。（2）人工合成法化學合成法：片段較小，核苷酸序列已知的目的基因，直接利用DNA合成儀用化學方法合成，不需要模板。反轉錄法：以RNA為模板，在逆轉錄酶作用下合成目的基因DNA（cDNA）（4）利用PCR技

8、術擴增目的基因PCR技術：是一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術。由于PCR過程在高溫下進行，因此需要使用熱穩定的DNA聚合酶。目的：通過指數式擴增獲取大量的目的基因前提：要有一段已知目的基因的脫氧核苷酸序列，以便合成引物。2基因表達載體的構建基因工程的核心（1）目的：使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發揮作用。日的基因啟動了：為RNA聚合酶識別和結合部位,驅動轉錄mRNA日的基因啟動了：為RNA聚合酶識別和結合部位,驅動轉錄mRNA終止子：使轉錄終止的特殊結構的DNA片段標記基因:為鑒定受體細胞是否含有目的基因載體（質粒）+DNA分子”基

9、因表達丿載體組成1、一種限制性核i酸內切酶首動子插人基因（3）基因表一個切口兩個切口兩個黏性末端獲取目的基園VDNA連接酶If重組DNA分子（重組質粒）達載體的構建過程：I表達載休層k蔓制原點，抗生索抗性基因i-io基因表達栽體模式圖3將目的基因導入受體細胞目的基因進入受體細胞，并且在受體細胞維持穩定和表達的過程，稱為轉化。轉化的關鍵是目的基因整合到受體細胞染色體基因組中。物種類植物細胞動物細胞微生物細胞用方法農桿菌轉化法顯微注射技術感受態細胞法:體細胞體細胞受精卵原核細胞金榜P1854目的基因的檢測與鑒定誤區警示（1）標記基因的作用篩選、檢測目的基因是否導入受體細胞，常見的有抗生素抗性基因、

10、發光基因（表達產物為帶顏色的物質）等。（2）受體細胞常用植物受精卵或體細胞（經組織培養）、動物受精卵（一般不用體細胞）、微生物（大腸桿菌、酵母菌）等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰島素則必須用真核生物酵母菌（需質網、高爾基體的加工、分泌)；一般不用支原體，原因是它營寄生生活；一定不能用哺乳動物成熟的紅細胞，原因是它無細胞核，不能合成蛋白質。基因表達載體中，啟動子(DNA片段)泊起始密碼子(RNA);終止子(DNA片段)#終止密碼子(RNA)。基因表達載體的構建是最核心、最關鍵的一步，在體外進行。(4)目的基因與載體的連接方式有多種，如目的基因目的基因、目的基因載體、載體載體等例3.下列有關基因工

11、程操作的敘述中，正確的是()AA用同種限制酶切割載體與目的基因可獲得相同的黏性末端B以蛋白質的氨基酸序列為依據合成的目的基因與原基因的堿基序列相同C檢測到受體細胞含有目的基因就標志著基因工程操作的成功D用含抗生素抗性基因的質粒作為載體是因為其抗性基因便于與外源基因連接例4金榜P187T2四、基因工程的應用與蛋白質工程含義：乳腺生物反應器是指將外源基因在哺乳動物的乳腺中特異表達利用動物的乳腺組織生產藥物蛋白。工程菌是指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達的菌類細胞株系。兩者區別：比較項目乳腺生物反應器工程菌基因結構動物基因的結構與人類基因的結構基本相同細菌或酵母菌等生物基因的結構與人類基因的

12、結構有較大差異合成的藥物蛋白與天然蛋細菌細胞沒有質網、高爾基體等細胞基因表達白質相同器，產生的藥物蛋白可能沒有活性22蛋白質工程與基因工程的比較（金榜P189）受體細胞動物的受精卵微生物細胞導入目的基因的方式顯微注射法感受態細胞法生產條件不需嚴格滅菌，溫度等外界條件對其影響不大需嚴格滅菌，嚴格控制工程菌所需的溫度、pH、營養物質濃度等外界條件藥物提取從動物乳汁中提取從微生物細胞中提取區別與聯系蛋白質工程基因工程過程word專業資預期蛋白質功能f設計預期的蛋白質結構f推測應有的氨基酸序列f找到相對應的脫氧核苷酸序列料獲取目的基因f構建基因表達載體f將目的基因導入受體細胞f目的基因的檢測與鑒定wo

13、rdword專業資料實質定向改造或生產人類.所需的蛋白質定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類所需的生物類型或生物產品結果可生產自然界沒有的蛋白質只能生產自然界已有的蛋白質聯系蛋白質工程是在基因工程基礎上延伸出來的第二代基因工程基因工程中所利用的某些酶需要通過蛋白質工程進行修飾、改造蛋白質工程是指以蛋白質分子的結構規律及其與生物功能的關系作為基礎，通過基因修飾或基因合成，對現有蛋白質進行改造，或制造一種新的蛋白質，以滿足人類的生產和生活的需求。3、基因工程的應用：金榜P1894、基因治療：(1)概念：指利用正常基因置換或彌補缺陷基因的治療方法。方法：基因置換、基因修復、基因增補、基因失活等。如：腺

14、苷酸脫氨酶(ADA)基因缺陷癥的基因治療。基因治療的途徑體外基因治療：先從病人的體獲得某種細胞進行培養，然后在體外完成基因轉移，再篩選成功轉移的細胞擴增培養，最后重新輸入患者體。如腺苷酸脫氨酶基因的轉移。體基因治療：用基因工程的方法，直接向人體組織細胞中轉移基因的治病方法。5、基因診斷概念:又稱DNA診斷，是采用基因檢測的方法來判斷患者是否出現了基因異常或攜帶病原體。方法：DNA分子雜交技術。它的基因原理是：互補的DNA單鏈能夠在一定條件下結合成雙鏈，即能夠雜交，這種結合是特異的，即嚴格按照堿基互補配對的原則進行。當用一段已知基因的單鏈作探針(常用同位素、熒光分子等進行標記)與變性后的單鏈基因組DNA接觸時，如果兩者的堿基完成配對，互補地結合成雙鏈，表明被測基因組DNA中含有已知的基因序列。誤區警示基因治療后，缺陷基因沒有改變。基因治療是把正常基因導入受體細胞中，以表達正常產物從而治療疾病，對原來細胞中存在缺陷的基因沒有清除或改變。對蛋白質分子進行改造，其本質是改變其基因組成。如果對蛋白質直接改造，即使改造成功，被改造的蛋白質分子還是無法遺傳。DNA分子作探針進行檢測時應檢測單鏈，即將待測雙鏈DNA分子打開。(4