1、怎樣選擇色譜柱現(xiàn)代高效液相色譜中，分離效果好壞很大程度上取決于色譜填料的選擇。但是色譜填料的選擇范圍很寬，要做合適的選擇，必須對此有一定的認(rèn)識和了解。1、正相色譜正相色譜用的固定相通常為硅膠（ Silica），以及其他具有極性官能團(tuán)，如胺基團(tuán)(NH 2,APS)和氰基團(tuán)（ CN ， CPS）的鍵合相填料。由于硅膠表面的硅羥基（ SiOH ）或其他團(tuán)的極性較強，因此，分離的次序是依據(jù)樣品中的各組份的極性大小，即極性強弱的組份最先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低，如：正乙烷（Hexane）, 氯仿Chloroform）, 二氯甲烷（ Methylene Chloride）等。

2、2、反相色譜反相色譜填料常是以硅膠為基礎(chǔ)，表面鍵合有極性相對較弱的官能團(tuán)的鍵合相。反相色譜所使用的流動相極性較強，通常為水，緩沖液與甲醇，已腈等混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強組合最先被沖出，而極性弱的組份會在色譜柱上有更強的保留。常用的反相填料有C18（ODS）、 C8（MOS ）、C4（ B）、C6H5（Phenyl）等。二、聚合物填料聚合物調(diào)料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要優(yōu)點是在PH 值為 1均可使用。相對與硅膠基質(zhì)的 C18 填料，這類填料具有更強的疏水性；大孔的聚合物填料對蛋白質(zhì)等樣品的分離非常有效。現(xiàn)在的聚合物填料的缺點是相對硅膠基質(zhì)填料，色譜柱柱效較低。

3、三、其他無機填料其它 HPLC 的無機填料色譜柱也已經(jīng)商品化。由于其特殊的性質(zhì)，一般僅限于特殊的用途。如石墨化碳也用于正逐漸成為反相色譜填料。這種填料的分離不同與硅膠基質(zhì)烷基鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎(chǔ)，不再需其它的表面改性，該柱填料一般比烷基鍵合硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強，石墨化碳可用于分離某些幾何導(dǎo)構(gòu)體，又由于 HPLC 流動相中不會被溶解，這類柱可在任何PH 與溫度下使用。氧化鋁也可用于 HPLC ，氧化鋁微粒剛性強，可制成穩(wěn)定的色譜柱柱床，其優(yōu)點是可在PH 高達(dá) 12 的流動相中使用。但由于氧化鋁與堿性化合物作用也很強，應(yīng)用范圍受到一定的限制，所以未能廣泛應(yīng)用，新型氧化

4、鋯填料也可用于 HPLC ，商品化的僅有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應(yīng)用 PH 范圍 1 14，溫度可達(dá) 100。由于氧化鋯填料幾年才開始研究，加之面臨的實驗難度，其重要用途與優(yōu)勢尚在進(jìn)行中。怎樣選擇填料粒度目前，商品化的色譜料粒度從 1um 到超過 30um 均有銷售，而目前分析分離主要用 3um、5um 和 10um 填料，填料的粒度主要影響填充柱的兩個參數(shù)，即柱效和背壓。粒度越小，填充柱的柱效越高；小于3um 的填料應(yīng)用，在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度，但不是唯一的因素。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那么選擇更小粒度的填料是很有用的， 3um 填料填充柱的柱數(shù)比相

5、同條件下的5um 填料的柱效提高近30% ；然而，3um 的色相譜的背壓卻是5um 的 2 倍。與此同時，柱效提高意味著在相同條件下可以選擇更短的色譜柱，以縮短分析時間，另外，可以采用低粘度的溶劑做流動相或增加色譜柱的使用溫度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色譜柱的壓力。一、如何保證良好的柱性能與柱壽命 認(rèn)證閱讀色譜柱使用說明書； 使用填充良好的色譜柱； 盡量減少壓力波動，避免機械及熱沖擊； 使用保護(hù)柱及在線過濾器； 經(jīng)常以強溶劑沖洗色譜柱； 充分過濾樣品及流動相，盡量避免雜質(zhì)微粒與強保留成分； 用穩(wěn)定的固定相（ C18 最穩(wěn)定）； 在中等 PH 值操作（ 68），用有機緩沖溶液； 色譜柱使用溫度

6、最好小于40； 硅膠基質(zhì)的的色譜柱，應(yīng)保持流動相的PH 值范圍在 3.08.0； 在水流動相與緩沖溶液中加200ppm 的疊氮鈉； 流動相中含有緩沖溶液，應(yīng)注意應(yīng) 955 的水及有機溶劑過渡，有機溶劑不能低于 5% ； 過夜或貯存時，沖洗掉鹽和緩沖液，用純有機溶劑流動相保存 （乙晴最好） 。HPLC名稱Silica固定相及應(yīng)用范圍別名功能基團(tuán)-OH正相反相離子對應(yīng)用非極性和中等極性以及非離子性有機化合物。SASC1-(CH 3)3在所有的烷基鍵合相中對非極性化合物保留最弱，典型用于中等極性和多官能團(tuán)化合物 .ButylC4-C4H9分離肽和蛋白質(zhì)，保留時間比 C8 和 C18 短。MOSC8，

7、-C8H17中等極性相中對中等化合物，小肽和蛋白質(zhì)，Octyl極性藥族化合物和環(huán)境樣品。ODSC18-C H37烷基鍵合相中對中等極性18化合物保留最強。廣泛用于藥物，甾族化合物，脂肪酸和環(huán)境樣品 .CPSCN ,Cyano-(CH ) CN對極性化合物有獨特的選擇性，適2 3合應(yīng)用于正相(propyl分離，當(dāng)用于反相系統(tǒng)時，其選擇性與C8 和Nitrile)C18 不同，在藥學(xué)領(lǐng)域和復(fù)雜混合物的分離中應(yīng)APSNH2-(CH2)3 NH2用廣泛。反相中分析糖類和其他極性化合物。弱陰離子交(Amino Propyl)換 ，陰離子和有機酸則應(yīng)用緩沖劑和有機改性劑 做流動相。正相中與硅膠的選擇性機改

8、性劑不同 ,分析芳香族效果很好。PhenylDiol-(CH3)C6H5-(CH 2)2O芳香族化合物反相時，分離肽和蛋白質(zhì)。正相時，與硅選擇SCXSAX強陽離子交換強陰離子交換CH2(CH2OH)2-(CH2)2C6H4SO3H-(CH2)3N+(CH3)3性 相似 ,但極性較弱。有機堿有機酸，核苷和核苷酸二、如何解決色譜柱使用過程中出現(xiàn)的問題1.保留值與分離度重現(xiàn)性不好原因分析問題原因表現(xiàn)不同色譜柱間差異填料、鍵合相不同保留因子（k），分離因子（）使用期間柱變化柱床破壞柱效（ N）鍵合相丟失保留因子（ k ），分離子（ ）硅膠基質(zhì)溶解柱效（ N）強保留分堆積堵塞保留因子（k ），柱效（N）

9、柱外效應(yīng)系統(tǒng)差異，進(jìn)樣量大、柱效（ N）進(jìn)樣閥與色譜柱之間、色譜柱與檢測器之間管路太長、檢測器流通池體積大、接頭死體積大等。分離效果變差流動相組分改變保留因子（k），柱效變化很小流速改變保留因子（k），分離因子（ ）溫度改變保留因子（k），柱效變化很小柱平衡慢柱超載重新平衡時間不夠樣品量太大保留因子（ k ），柱效變化很小保留因子（ k），柱效（ N）造成色譜峰（不對稱）拖尾的原因1.色譜柱本身填裝問題，篩板堵塞或填料塌陷；2.柱頭有污染；樣品超載；樣品溶劑不合適；5.柱外效應(yīng)；化學(xué)或二次保留（硅羥基）效應(yīng)；緩沖容量不足或不合適；重金屬污染。3.如何解決峰形拖尾的問題A與化學(xué)有關(guān)的拖尾問題1流

10、動相中，加入 30mM 的三乙胺（用與堿性化合物）或醋酸胺（用與酸性化合物），未知化合物加醋酸三乙胺；2如仍然拖尾，將三乙胺換為二甲基辛胺（或醋酸二甲基辛胺）；3降低進(jìn)樣量至 1ug。B與色譜柱有關(guān)的拖尾問題1如柱頭處有強保留的樣品組分積聚，反相柱可用20 倍柱體積的 96% 的二碌甲烷與 4% 甲醇，加 1% 氫氧化銨混合液沖洗，正向柱可用甲醇沖洗。2使用保護(hù)柱C與 HPLC 系統(tǒng)有關(guān)的峰拖尾和峰加寬1進(jìn)樣體積過大，（通常25uL）；2進(jìn)樣閥與色譜柱及檢測器之間的管路體積過大（最佳連接管應(yīng)20cm，內(nèi)徑為 0.007）；3檢測器流通池的體積過大。4如何儲存色譜柱1防止緩沖溶液和水溶液流動相產(chǎn)

11、生微生物，做到流動相用多少配多少，或在水流動相中加 200ppm 的疊氮鈉以抑制細(xì)菌成長 （一定當(dāng)心其毒性和潛在的爆炸性）；或在流動相中加 20% 的有機改性劑，也可抑制微生物生長，有機改性劑還有助于流動相脫氣。2盡可能將色譜柱貯存于100% 有機溶劑（乙晴最好）中，避免在緩沖溶液中保存。3使用緩沖溶液后的色譜柱，應(yīng)用15 20 倍柱體積的不含緩沖劑的同種水有機溶劑流動相沖洗色譜柱，后換成100% 有機溶劑儲存。4避免用純凈水沖洗鍵合致密的C18 柱。5將色譜柱的兩端用堵頭擰好，以免柱床填料干裂。如何選擇保護(hù)柱怎樣選擇保護(hù)柱，但又不能影響分離分析？這是色譜工作者經(jīng)常提出的一個問題。通常，在選擇

12、保護(hù)柱之前首先要考慮的是樣品是否清潔。對于大部分分析工作者來說，一只 1cm 長的保護(hù)柱，那么就應(yīng)選擇 2cm 或 3cm 長的保護(hù)柱。保護(hù)柱越長，自然所裝填的色譜填料就越多，則其越能避免污染物進(jìn)入分析色譜柱的機會。當(dāng)然，隨著保護(hù)柱的長度加長，樣品的保留時間會比使用短保護(hù)柱長。一般來說，保護(hù)柱的內(nèi)徑與分析色譜柱的內(nèi)徑相同或相當(dāng)即可。保護(hù)柱的填料裝填方式也很重要。目前有薄膜裝填法的保護(hù)柱，使用過程很簡單方便，而且可以在實驗室中進(jìn)行干裝。但是，其最大的缺點是不經(jīng)濟，特別是針對中國的具體情況，一次性使用相對費用較高。另外，薄膜裝填法的保護(hù)柱所裝填的色譜填料有限，只能提供有限的保護(hù)作用；不過也因為所裝填的色譜料較少，保護(hù)柱的長度也較短，所以對分析樣品的保留時間的影響也很小。另一種保護(hù)柱結(jié)構(gòu)其實質(zhì)是縮短了的色譜分析拄，設(shè)計方式上有直連式、手緊式或整體式。整體式設(shè)計是由色譜的生產(chǎn)廠商直接安裝在色譜分析柱上的，必須與色譜分析柱一同訂貨，可以非常方便地使用，但不能夠被修改。直連式結(jié)構(gòu)設(shè)計可在任何時候有色譜工作者來安裝連接，可以與任何品牌的色譜分析柱連接使用，而且還可以根據(jù)樣品的