1、關于動物細胞工程制藥 (2)第一張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月第四節轉基因動物一、轉基因動物的產生和發展轉基因動物(transgenic animal）:通過基因工程技術將外源DNA導入動物生殖細胞，干細胞，早期胚胎，并在受體動物染色體上穩定整合，并能夠穩定傳給子代的技術，稱為轉基因技術。通過轉基因技術所獲得的動物稱轉基因動物。第二張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月轉基因動物20世紀70年代中期，基因重組技術與細胞工程技術結合，產生了轉基因動物和轉基因植物。1974年,HJaenisch和MinZe首次報道向小鼠囊胚注射SV40 DNA后，生產的小鼠部分組織中檢測到了SV4

2、0 rDNA序列。1980年,Gordon等人通過向小鼠的單細胞胚胎原核注射純化的DNA-人胸苷激酶基因，獲得轉基因小鼠。這是一只得真正意義的第一只轉基因動物。第三張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月轉基因碩鼠1982年Palmiter等人將大鼠的生長激素基因導入小鼠受精卵的雄原核中,獲得比普通小鼠生長速度快24倍，震驚了世界。轉基因“碩鼠”（右）第四張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月生物反應器研發在此后幾年中，以改進經濟性狀為目的的轉基因動物研究成為熱點課題。但除轉基因魚外，多數轉基因動物并沒有達到預想的要求。第五張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月Gordon于1987

3、年獲得了分泌組織纖溶酶原激活因子tPA的轉基因小鼠。以后的數年內，轉基因羊、豬、牛的乳腺生物反應器便相繼問世，利用此生產出了多種生物藥物：凝血因子、凝血因子XIII、抗胰蛋白酶、tPA、紅細胞生成素（EPO）等。動物克隆技術、干細胞技術等與轉基因動物技術相結合，加快了動物生物反應器的研究與應用進程。第六張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月乳汁中分泌人凝血因子IX的轉基因山羊 美國轉基因豬，其體內含有人類的基因，乳汁含有人體蛋白fator。只需300600只這樣的母豬就能滿足全世界對這種蛋白的需求。第七張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月美國麻省生物技術公司（GTC，Biothera

4、peutics）利用轉基因動物技術開發、生產和商業化治療用蛋白質。ATryn是GTC生物治療公司開發的一種人抗凝血酶重組蛋白，它是第一個在世界上得到認可的轉基因動物生產的蛋白。 2006年6月宣布，美國GTC公司用轉基因山羊生產的人抗凝血酶“ATryn”（-antithrombin）獲得歐洲藥品評價局（EMEA）人用藥品委員會（CHMP）的批準推薦。 2009年2月，FDA首次批準由轉基因動物生產藥物-人抗凝血酶“ATryn”上市。 第八張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月二、轉基因動物技術的原理和方法（一）基本原理體外構建的重組DNA分子通過顯微注射，病毒載體轉移，胚胎干細胞轉染等方法

5、注入動物的受精卵或床前的胚胎細胞，然后將此受精卵或胚胎細胞植入子宮，使其發育成攜帶外源基因的轉基因動物第九張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月第十張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月外源目的基因的制備外源目的基因有效導入生殖細胞或胚胎干細胞選擇獲得攜有目的基因的細胞選擇合適的體外培養系統和宿主動物轉基因細胞胚胎發育及鑒定篩選所得的轉基因動物品系第十一張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月（二）外源目的基因轉入動物的早期胚胎方法1.顯微注射法 在光學顯微鏡下，利用顯微操作儀，直接把DNA注射到動物早期胚胎、胚胎干細胞、體細胞或卵母細胞中，然后生產動物個體的技術。第十二張，PPT共

6、七十八頁，創作于2022年6月microinjection經過顯微注射DNA發育而成的動物中，有少數整合了被注射的DNA分子，成為轉基因動物。目前是創造轉基因動物的最有效，最成功的途徑第十三張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月基質附著序列第十四張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月第十五張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月通過注射妊娠血清和人絨毛膜促進腺激素的激素療法使小 鼠超數排卵35個（一般情況下排卵5-10個） 交配后，從輸卵管內取出受精卵；轉基因樣品注射入受精卵中變大的雄性原核內將25-40個注射了轉基因的受精卵移植入代孕小鼠體內 ；受精卵發育成胚胎，并繁殖成轉基因小鼠

7、子代 ；從小鼠子代體內取出DNA樣品，進行雜交，鑒定轉基因的整合 與否及位子代小鼠間進行再交配，繁殖，觀察轉基因是否遺 傳及表達 。 DNA顯微注射法的基本程序第十六張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月第十七張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月第十八張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月優點： 轉基因范圍廣轉移基因大，可達數百kb；且轉基因不含任何病毒基因組片段，絕對安全 。非嵌合體已成功制備轉基因的鼠，兔，羊，豬缺點：整合機制不明確，無規律隨機整合，多拷貝整合導致轉基因不表達整合位點隨機會造成轉動物基因組的重排、突變、易位缺失等需顯微操作儀，技術性要求強。 成功率低第十九張，

8、PPT共七十八頁，創作于2022年6月2.反轉錄病毒感染法將目的基因重組到逆轉錄病毒載體上，制成高滴度病毒顆粒，人為感染著床前或著床后的胚胎，（也可直接將胚胎與能釋放逆轉錄病毒的單層培養細胞共同培養以達到感染目的）獲得轉基因動物的方法在培育轉基因禽類研究中有廣泛應用，是目前制備轉基因雞最有效和最成功的方法，主要集中在雞的良種培育及抗病毒感染研究方面。第二十張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月第二十一張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月如果在第一次卵裂之前外源DNA整合到胚胎基因組中，可獲得轉基因動物在第一次卵裂之后整合，會產生嵌合體，其第二代可能出現轉基因動物。 第二十二張，PPT

9、共七十八頁，創作于2022年6月（1）反轉錄病毒基因反式作用序列順式作用序列第二十三張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月（2）反轉錄病毒感染法的載體的構建復制型缺陷重組病毒載體的構建：只能產生病毒RNA 不編碼結構蛋白 提取病毒未整合的環狀形式DNA；將環狀DNA克隆到適當的載體中；選擇適當的酶將病毒結構蛋白編碼區切除；將外源目的基因克隆到載體中第二十四張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月（3）包裝細胞 在受體細胞中的重組病毒由于沒有包裝信號，能生產病病毒RNA和所有蛋白質，但不能包裝成病毒顆粒；病毒包裝細胞：染色體整合除序列的整個病毒基因組，為重組蛋白載體轉錄的RNA提供包裝蛋白

10、病毒載體轉化受體細胞后，載體上的包裝信號將使包裝蛋白把載體包裝成為侵染生的病毒顆粒。第二十五張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月（4）通過物理方法將重組DNA分子轉入包裝細胞利用反轉錄病毒DNA的LTR區域具有轉錄啟動子的特點，外源基因隨病毒RNA轉錄，并在載體上 序列的作用下，重組病毒轉錄的RNA和包裝細胞提供的包裝蛋白就可以組裝成有感染性的病毒顆粒病毒收獲后感染早期胚胎或直接感染受精卵。或構建好的DNA注射入囊胚腔中和重組病毒及輔助病毒共培養進行轉染第二十六張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月優點：同時感染大量胚胎整合率高，轉基因整合后能穩定地遺傳單拷貝整合型不需復雜設備 缺點

11、：外源基因難植入生殖系統，成功率低載量較小，一般只有8 kb，不能插入大片段，缺少鄰近的調控元件而影響轉基因表達；第二十七張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月3.胚胎干細胞方法胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES）是從早期胚胎內細胞團（ICM）分離出來的，能在體外培養的一種高度未分化的多能干細胞。含正常二倍體染色體的具有發育全能性的細胞?？梢栽隗w外進行人工培養，擴增，并能以克隆的形式保存。第二十八張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月胚胎干細胞介導法在小鼠上應用比較成熟，在大動物上應用較晚。豬的胚胎干細胞克隆系， 牛的胚胎干細胞。第二十九張，PPT共七十八頁，創作

12、于2022年6月ES細胞成為個體1.將ES細胞注入到動物的早期胚胎內，可產生嵌合體轉基因動物。第三十張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月2.通過核移植將ES導入去核的卵母細胞，在子宮種植發育成個體第三十一張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月胚胎干細胞轉基因過程第三十二張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月1.ES細胞的建立與維持動物的準備：受精后3.5天的母鼠分離鼠胚。胚胎的分離和初培養：3.5天孕鼠 鼠斷頸處死 解剖小鼠取出胚胎 體外培養胚胎 4-6天 后，離散ICM。 ICM的離散與ES的分離：分離ICM 酶解細胞團 培養離散細胞 ES細胞集落ES細胞的擴增：離散ES細胞

13、置四孔培養板中 培養 ES細胞的常規培養：ES細胞由四孔板轉至培養皿進 行常規培養第三十三張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月2.ES細胞的基因組操作 將外源基因移入到ES細胞基因組后，既能高效穩定表達，又不影響ES細胞的各種功能。 這就要求目的基因必須要定點參入，并且參入整合后，對原有基因結構及功能沒有影響或影響最小。第三十四張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月與整合位點兩端區域同源的兩段DNA序列（HB1和HB2）轉入的目的基因（TG）編碼抗G418的新霉素磷酸轉移酶基因（neor）兩個不的胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2）定點參入第三十五張，PPT共七十八頁，創作

14、于2022年6月3.轉基因ES細胞的篩選正負選擇法 正選擇法篩選出轉基因整合型ES細胞：重組DNA導入ES細胞，在含有G418的培養基中，沒有整合外源基因的細胞將全部死亡，只有整合了外源基因的細胞才可以存活下來。負選擇法篩選出特異整合型ES細胞：如果非特異性整合發生，則兩個tk基因或其中一個基因很大可能與TG和neor一起整合，這時用GCV篩選， tk基因表達的胸苷激酶能反GCV轉化成有毒的化合物，使細胞死亡。第三十六張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月第三十七張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月4.轉基因ES細胞的檢測第三十八張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月5.移植將胚

15、胎移植到假孕的代孕母鼠子宮內，繁育轉基因小鼠。第三十九張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月（6）獲得純合的轉基因鼠第四十張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月優點：整合率高同源重組實現定點整合，而非隨機整合缺點：不容易建立胚胎干細胞系長期培養，導入外源基因的胚胎干細胞會由于細胞分化使生產的動物成為嵌合體第一代是嵌合體，獲得轉基因動物的周期較長第四十一張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月4.精子載體導入法 將外源DNA與破壞細胞膜的精子一起孵育，精子可捕獲外源DNA，并通過受精過程將外源DNA導入受精卵。第四十二張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月意大利Lavitrano等

16、1989年首次報道利用精子作為載體獲得了轉基因小鼠。改進的方法是精子頭部纖維注射此法不僅可免去復雜而昂貴的設備，且可省去不少繁雜的操作和條件準備。但該法有些結果不穩定，不能重復,外源DNA分子可能會受到受精液中內切酶的作用而影響整合后的功能需在繼續改進第四十三張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月5.基因打靶 (gene targeting)包括基因敲除(Knock-out)：靶基因被滅活. 無功能的外源基因轉入細胞與基因組中同源序列進行同源重組，把具有功能的同源序列置換出來，造成功能基因的缺失或失活.基因敲入(Knock-in):引入不存在的新基因. 將外源有功能的基因轉入基因組中不存在

17、或已失活的細胞中與其基因組中同源序列進行同源重組，在細胞內獲得表達，基因替代：基因修正(gene repairment)第四十四張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月基因打靶的必備條件胚胎干細胞(ES細胞)能在體外培養，保留發育的全能性打靶載體Neo（新霉素）陽性篩選標志HSV-tk陰性篩選標志：單純皰疹病毒(herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase)第四十五張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月第四十六張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月基因敲除的技術路線如下：（1）構建重組基因載體（2）打靶載體導入ES細胞：重組置換（3）基因

18、敲除ES細胞注射入胚泡（4）胚泡植入假孕小鼠的子宮中（5）嵌合體的雜交育種第四十七張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月第四十八張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月第四十九張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月O型載體，序列插入型載體，這類載體與靶基因組同源重組配對，經過一次交換，前者插入后者，它發生單交換而將載體序列插入靶基因內，致使染色體DNA部分重復，可能破壞內在正?；蚨l生突變，也可代替原來缺陷基因，糾正遺傳特征，使靶基因特異失活。 型載體，也稱序列取代載體，外來載體DNA和靶細胞染色體DNA同源配對，經過兩次交換，前者取代后者，此類載體可與靶序列發生雙交換，以外源序列

19、取代靶序列，其基因組大小并無改變?；虼虬休d體第五十張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月第五十一張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月6. YAC (Yeast Artificial Chromosome)人工酵母染色體法transfer large gene/cluster gene (100kb):YAC具有自主復制序列、克隆位點和可在細菌和酵母菌中選擇的標記基因；還具有酵母菌染色體一些特點；可接受1001000kb的外源DNA片段 avoid DNA damage:YAC已成為人類基因組計劃和圖位克隆基因的重要工具；第五十二張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月方法顯微注射

20、核移植胚胎干細胞逆轉錄病毒基因敲除精子介導優點外源基因整合效率較高，不需要載體，目的基因的長度可達100Kb轉基因效率高；預測基因表達水平；可以使用定點整合技術外源DNA的整合率高； 整合在生殖細胞中的比例也很高。 可在整合點整合轉移基因的單個拷貝； 該方法簡單、方便 缺點精密儀器， 技術操作較難，易造成宿主動物基因組的插入突變供體細胞易衰老ES細胞株不易建立，長期培養后出現分化現象；生產的轉基因動物都是嵌合體 插入的基因有大小限度；嵌合性很高；外源DNA 在動物各種組織中的分布不均 應用具有一定局限性有些結果不能重復 第五十三張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月三、轉基因動物反應器動物

21、生物反應器（bioreactor）:目的片段在器官或組織中表達的轉基因動物生產克藥物蛋白質，用細胞基因工程需800-5000美元，而利用轉基因動物只需0.02-0.50美元。一種新藥從研制到上市通常需要10-15年，而轉基因動物乳腺生物反應器，生產周期僅為年左右 。第五十四張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月幾乎任何有生命的器官、組織或其中一部分都可經過人為馴化為生物反應器,從生產的角度考慮，生物反應器選擇的組織和器官要方便產物的獲得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此發展了乳腺生物反應器, 血液生物反應器和膀胱生物反應器等。其中，轉基因動物乳腺生物反應器的研究最為引人注目。第五十五張，PP

22、T共七十八頁，創作于2022年6月（一）動物乳腺反應器乳腺生物反應器的研制，就是通過基因轉移技術，將外源基因導入動物體內，通過乳腺特異啟動子的控制，獲得乳腺生產外源蛋白質的轉基因動物。藥用蛋白基因 表達細胞株 細胞核供體動物 受精卵 無核受精卵 組裝的核細胞 胚胎藥用蛋白 乳汁雌性 轉基因動物 動物幼崽 假孕動物受體動物第五十六張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月商業要求：1g/L乳腺是外分泌器官，乳汁不進入體內循環，不會影響到轉基因動物本身的生理反應，從轉基因動物的乳汁中獲取的目的基因產物，不但產量高、易提純，而且表達的蛋白經過了充分的修飾加工，具有穩定的生物活性，因此又被稱為動物乳腺

23、生物反應器2006年8月，歐洲藥品估計局（EMEA）批準了哺乳動物細胞乳腺生物反應器（改名為乳腺生物反應器） 第五十七張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月1、動物乳腺是一個封閉的系統：表達的蛋白絕大部分不會回到血液循環, 避免大量表達的外源蛋白對動物健康的危害。2、乳腺組織是一種有效的蛋白質合成器。奶牛一年生產乳蛋白250-300kg, 山羊生產乳蛋白25-30kg, 家兔生產乳蛋白也可達到3-5kg。3、乳腺組織可以對人體蛋白質進行正確的修飾和后加工，生物學活性接近天然產品。4、動物乳腺表達的外源基因可以遺傳，獲得生產有價值蛋白質的動物個體后,可以常規繁殖生產群體。第五十八張，PPT共

24、七十八頁，創作于2022年6月80年代，在鼠的乳腺組織高效表達了人AAT，開創了此研究的先河全世界有20-30家公司致力于開發動物乳腺生物反應器重組蛋白藥物，可進行商業生產的有近30種,包括人AAT、EPO、乳鐵蛋白、BSA、血紅蛋白，、和抗凝血酶、血纖維蛋白原、tPA等十余種稀有藥品，臨床試驗的有l0余種，研發階段的有上百種2006年6月，由美國Genzyme公司研制成功的第一個轉基因動物乳腺生物反應器生產的重組人抗凝血酶III（商品名：ATryn）已經獲準上市第五十九張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月第六十張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月第六十一張，PPT共七十八頁，創作

25、于2022年6月AAT轉基因羊，其乳汁中含有a-抗胰蛋白酶(AAT) ，可治療遺傳性肺氣腫病。每升羊奶售6000美元。英國PPL公司與德國拜耳公司生產第六十二張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月第六十三張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月我國乳腺反應器的研制1996年研制成功的能在乳腺中表達人凝血因子、EPO 的轉基因羊1998年獲得了能表達人BSA的轉基因奶牛2000年獲得了我國首例轉有人AAT的轉基因羊2005年研制的人乳鐵蛋白和人乳清BSA轉基因奶牛均獲得高效表達，含量分別達到3.4g/L和1.5g/L，標志了我國首次獲得可商業化生產的動物乳腺生物反應器重組人類蛋白第六十四張

26、，PPT共七十八頁，創作于2022年6月乳腺產品的缺點post-translational modifications human protein C不能正確的形成亞基 human antithrombin III未能完全的糖基化第六十五張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月轉基因高等哺乳動物乳液蛋白糖基化仍有別于人，可能導致抗原性的變化。歐盟人用醫學制品委員會（CHMP）曾對ATryn上市提出過反對意見，理由是臨床例數太少。另外，美國Genzyme公司重組人酸性-葡萄糖酶（商品名Myozyme），原本在轉基因兔奶中生產，最終換為CHO細胞生產并獲得FDA批準上市 第六十六張，PPT共七十

27、八頁，創作于2022年6月（二）血液血液生物反應器比較適合生產人血紅蛋白、抗體和生產非生物學活性狀態的融合蛋白而有活性的蛋白或多肽(如激素、細胞分裂素、組織血纖維溶酶因子等)由于進入了動物血液循環系統而影響動物的健康。到目前為止，已有多種通過轉基因動物生產的具有生物學功能的人血紅蛋白問世。第六十七張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月大家畜的血液容量較大,利用動物血液生產某些蛋白質或多肽等藥物己取得了一定進展。外源基因編碼產物可直接從血清中分離出來,血細胞組分可通過裂解細胞獲得。第六十八張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月促紅細胞生成素(EPO)：以轉基因豬生產。這種藥物存于轉基因豬的血液中。目前轉基因豬血球素合成的遺傳控制機制已十分清楚，用基因重組技術合成的EPO已在多個國家上市。第六十九張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月（三）尿液動物膀胱生物反應器體液容易收集；動物出生后即可表達；外源蛋白不進入血液循環膀胱尿乳頭頂端表面可表達一組尿血小板溶素的膜蛋白,這種蛋白在膀胱中表達具有專一性,而且它的基因是高度保守的,將外源基因插入5端調控序列中,就可以指導外源基因在尿中表達。 多用哺乳動物中保守性高的Uroplakin啟動子第七十張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月（四）精液豬等，精液是體積較大的液體，容易收集可在雄性動物中表達還處于研究狀態第七十一