1、生物分子的分離純化醫學分子生物學 第七章溫州醫學院檢驗醫學院Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics生物大分子（蛋白質、核酸、糖復合物等）生物分子（Biomolecule）泛指生物體特有的各類分子，是自然存在于生物體中的分子的總稱，是組成生命的基本單位。包括小分子（如脂類、激素、維生素等）Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics5）能人工合成與改造。生物分子是生物所特有的有機化合物，具有如下主要特征：1）結構復雜有序、具有特殊的層次；2）行使專一的功能；3）代謝是其存在的條件；4）生物分

2、子體系具有自我復制的能力；Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics一、生物大分子的制備 生物大分子指的是作為生物體內主要活性成分的各種分子量達到上萬或更多的有機分子。常見的生物大分子包括蛋白質、核酸、脂類、糖類。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics（1）分離純化方法千差萬別，沒有一種標準方法可通用于各種生物大分子的分離制備；（2）制備幾乎都是在溶液中進行的，難以準確估計和判斷pH值、溫度度等各種參數對溶液中各種組份的綜合影響 生物大分子的制備有以下主要特點：Zhejiang Prov

3、incial Key Lab of Medical Genetics生物大分子制備的一般步驟： 確定制備的目的和要求文獻調研和預備性實驗建立相應的可靠的分析測定方法材料的破碎和預處理分離純化方案的選擇和探索產物純度的鑒定產物的濃縮，干燥和保存。科研、開發或發現新的物質制備的關鍵要求達到一維電泳一條帶，二維電泳一個點，或HPLC和毛細管電泳都是一個峰最困難的過程掌握目的產物的理化性質特異性強準確度高靈敏度高使用快捷方便 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 制備生物大分子的分離純化方法多種多樣，主要是利用它們之間理化性質的差異。根據作用原

4、理生物分子的分離、純化可分為以下幾種類型：（1）根據分子極性大小和溶解度的不同，如溶劑提取技術、鹽析法、分配層析法、分級沉淀法等；（2）根據分子形狀和大小不同，如凝膠過濾層析等；（3）根據物質吸附性質不同，如選擇性吸附與吸附層析法等；（4）根據分子帶電性（電離性質）的差異，如離子交換層析、電泳、等電聚焦法等。（5）根據配體特異性，如親和層析。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics影響提取效果的因素（1）pH值 （2）鹽濃度（即離子強度） （3）溫度 （4）水解酶 （5）攪拌與氧化 （6）有機溶劑 Zhejiang Provincial K

5、ey Lab of Medical Genetics 生物大分子的分離純化 （1）鹽析法 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics（2）有機溶劑沉淀法 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics二、核酸的分離純化 核酸（nucleic acid）是遺傳信息的攜帶者，是基因表達的物質基礎(包括DNA與RNA)。 無論是進行核酸結構還是功能研究，首先需要對核酸進行分離和純化。 核酸樣品質量將直接關系到實驗的成敗。 DNA與RNA理化性質及細胞定位上的差異決定了兩者的最適分離與純化條件的不同Zh

6、ejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics分離純化的原則 一是保持核酸堿基序列的完整性。二是盡量清除其它分子的污染，保證核酸制品的純度。 意義：遺傳信息全部儲存在一級結構之中，核酸的一級結構還決定其高級結構的形式以及和其他生物大分子結合的方式。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics保持核酸的完整性 在整個操作過程中應盡量避免各種有害因素對核酸的破壞。 1）溫度不要過高(04)；(高溫破壞氫鍵) 2）控制pH值范圍(pH值4-10);(極端酸堿破壞磷酸二酯鍵) 3）保持一定離子強度; 4）減少

7、物理因素對核酸的機械剪切力.Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics核酸制備的技術路線Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics核酸的濃縮、沉淀與洗滌隨著提取試劑的逐步加入，去除雜質時的丟失，樣品中核酸的濃度會逐步下降，當不能滿足后續研究與診斷所需時應對樣品進行濃縮。沉淀是濃縮核酸的最常用且高效的方法，優點： 改變核酸的溶解緩沖液； 重新調整核酸的濃度； 去除溶液中某些鹽離子與雜質。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics核酸的鑒定與保

8、存（一）核酸的鑒定1. 濃度鑒定 核酸濃度的測定可通過紫外分光光度法與熒光光度法進行。 紫外分光光度法：該法是基于核酸分子中的堿基具有共軛雙鍵結構因而可以吸收紫外線，其最大吸收波長為260nm，這一物理特性。前提：核酸樣品要較純，無顯著蛋白質、酚、瓊脂糖及其他核酸污染。測定濃度應大于0.25 g/mlZhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics熒光光度法：核酸在熒光染料溴化乙錠（ethidium bromide，EB）嵌入堿基平面后，本身無熒光的核酸在UV激發下發出紅色熒光，且熒光強度的積分與溶液中核酸的含量呈正比。Zhejiang Provi

9、ncial Key Lab of Medical Genetics 純度鑒定 紫外分光光度法或熒光光度法皆可用于核酸制品的純度鑒定。紫外分光光度法：該法主要通過A260與A280的比值來判定有無蛋白質的污染。在TE緩沖液中，純DNA的A260/A280為1.8，純RNA的比值為2.0。比值升高與降低均提示不純。熒光光度法：用EB等熒光染料示蹤的核酸電泳結果可判定核酸制品的純度。DNA分子較RNA大得多，電泳遷移率低。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics(1) 對DNA DNA樣品溶于pH8.0的TE，4 或-20 保存；在-70可保存數

10、年 長期保存樣品中可加入1滴氯仿。(2) 對RNA RNA樣品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或雙蒸滅菌水中，-70 保存; 長期保存可以沉淀形式貯于乙醇中; 在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧釩核糖核苷復合物)凍貯于-70,可保存數年。（二）核酸的保存Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics盡管基因組DNA因來源、性質以及制備的目的不同，其分離純化的方法不盡相同，但有關分離純化的原則、主要步驟、主要技術、主要試劑及其作用原理是一樣的。基因組DNA分離純化的一般程序見圖7-4。真核基因組DNA的分離純化Zh

11、ejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics1、酚抽提法本法最初于1976年由Stafford及其同事提出，通過改良，以含EDTA、SDS及無DNA酶的RNA酶裂解緩沖液破碎細胞，經蛋白酶K處理后，用pH8.0的Tris飽和酚抽提DNA，重復抽提至一定純度后，根據不同需要進行透析或沉淀處理獲得所需的DNA樣品。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics裂解液中：EDTA：離子螯合劑，抑制DNase活性，降低細胞膜穩定性SDS：溶解細胞膜、核膜，乳化脂質、蛋白，并使其變性沉淀，同時變性DNase無

12、DNase的RNase可高效水解RNA而避免DNA的消化蛋白酶K：消化DNase和胞中的蛋白質酚：變性沉淀蛋白，抑制DNase活性pH 8.0的Tris溶液保證抽提時DNA進入水相，防止DNA變性Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics2、 甲酰胺解聚法該法操作步驟少，但耗時，所得DNA濃度低，適用于制備大片段DNA1987年Kupiec等報道了甲酰胺（formamide）解聚法，該法的細胞裂解與蛋白質水解同酚抽提法相似，但不進行酚的抽提，而是以高濃度的甲酰胺裂解DNA與蛋白質的復合物（即染色質），然后通過火棉膠袋的充分透析以除去蛋白酶K和

13、有機溶劑。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 3、玻棒纏繞法用該法收集高分子量DNA的沉淀始于20世紀30年代，現今使用的纏繞法是以1987年Bowtell的方法經改進而來。本法有兩個關鍵步驟：一是基因組DNA沉淀在細胞裂解液和乙醇的交界面；二是將DNA沉淀纏繞在帶鉤玻棒上。帶鉤玻棒將大片段DNA從無水乙醇中轉移至pH8.0的TE緩沖液中。該法以鹽酸胍裂解細胞，制備的DNA片段約有80kb，適用于同時從不同細胞或組織標本中提取DNAZhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics基因組D

14、NA片段的純化純化的原則與要求純化的方法有透析、層析、電泳及選擇性沉淀等。無論采用何種方法從何種支持介質中純化與回收所需要的DNA片段都要注意兩個原則：一是提高片段的回收率；二要清除回收的DNA樣品中的污染。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics回收率 為提高DNA片段的回收率，可通過提高DNA樣品的上樣量和選擇適宜的方法與材料而實現。2. 純度 常用的純化方法包括有機溶劑抽提法與商品化的柱層析法（column chromatography）。柱層析法采用的是陰離子交換層析的原理Zhejiang Provincial Key Lab of

15、 Medical Genetics從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段從瓊脂糖凝膠中純化DNA片段的方法主要有二乙基氨基乙基（diethyl aminoethyl，DEAE）-纖維素（cellulose）膜插片電泳法電泳洗脫法（透析袋及非透析袋電泳洗脫法）冷凍擠壓法低熔點瓊脂糖凝膠挖塊回收法等。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics從聚丙烯酰胺凝膠回收DNA片段從聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA的標準方法是壓碎與浸泡法。它是將含待回收DNA條帶的凝膠塊切出，用吸頭或接種針將其壓碎，然后以洗脫緩沖液浸泡，使DNA洗脫出來。該方法能很好地回收小于1 kb的

16、ss或ds-DNA，依分子量不同，其回收率從小于30%至大于90%不等。回收的DNA純度極高，無酶抑制劑，也無對轉染細胞或微注射細胞有毒的污染物，雖費時但操作簡單，是小片段DNA回收的較好方法。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics質粒DNA的提取與純化Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics質粒DNA的提取與純化的經典方法包括： 堿裂解法 煮沸裂解法 SDS裂解法等這些方法主要由質粒DNA的擴增、質粒DNA的釋放、質粒DNA的分離純化三個步驟組成Zhejiang Provincial

17、 Key Lab of Medical Genetics1、堿裂解法在NaOH提供的高pH（12.012.6）條件下，用強陽離子去垢劑SDS破壞細胞壁，裂解細胞，與NaOH共同使宿主細胞的蛋白質與染色體DNA發生變性，釋放出質粒DNA。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics盡管堿溶液能破壞DNA中的堿基配對，但CCC質粒DNA因纏繞緊密而不易解鏈，只要不在堿性條件下變性太久，當pH調至中性時，CCC質粒DNA就可重新恢復天然的超螺旋。該法操作簡單、重復性好且成本低，制備的質粒純度能滿足DNA測序與PCR等實驗要求，是使用最廣泛的方法Zh

18、ejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics2、SDS裂解法SDS裂解法是將細菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA處理以破壞細胞壁，去壁細菌再用SDS裂解，從而溫和地釋放質粒DNA到等滲液中，然后用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗滌質粒DNA 由于條件溫和，該法特別適用于大質粒DNA（15kb）的提取。但有一部分質粒DNA會與細胞碎片纏繞在一起而丟失，故產率不高。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics3、煮沸裂解法該法條件劇烈，只能用于小質粒DNA的制備煮沸裂解法是將細菌懸浮于含Triton

19、 X-100和溶菌酶的緩沖液中，Triton X-100和溶菌酶破壞細胞壁后，沸水浴裂解細胞的同時可破壞DNA鏈的堿基配對，并使宿主細胞的蛋白質與染色體DNA變性，但CCC質粒DNA因結構緊密不會解鏈。當溫度下降后，CCC質粒DNA可重新恢復其超螺旋結構。通過離心去除變性的蛋白質和染色體DNA，然后回收上清中的質粒DNA。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics質粒DNA的純化1、CsCl-EB法 利用CsCl形成的連續密度梯度，在過量EB存在的條件下，各種不同密度的物質經離心平衡后得以分開。2、聚乙二醇沉淀法 （一種分級沉淀法）3、柱層析

20、法 （樹脂）Zhejiang Provincial Key Lab of Medical GeneticsRNA極易被RNase水解，除胞內的RNase外，它還廣泛存在于人的皮膚、唾液、汗液及周圍的環境中；RNase分子結構中二硫鍵的存在使其生物學活性非常穩定，加熱煮沸及一般的變性劑均不能使其完全滅活，而且去除變性劑（denaturant）后，RNase的活性又可恢復。因此，在RNA的制備過程中，排除RNase的污染及強有力地抑制其活性是RNA制備成功與否的關鍵真核細胞RNA的分離純化Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 為獲得完整的R

21、NA分子，必須在總RNA提取分離的最初階段，盡可能地滅活胞內RNase的活性。選擇性地使用RNase的變性劑（如酚、氯仿及強烈的胍類變性劑）。蛋白酶K和能與蛋白質結合的陰離子去污劑如SDS、十二烷基肌氨酸鈉或脫氧膽酸鈉，并聯合使用RNase的特異抑制劑（如RNasin與DEPC等）能極大地防止內源性RNase對RNA的降解。此外，在變性液中加入-疏基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）等還原劑可以還原RNase中的二硫鍵，有利于RNase的變性、水解與滅活。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics由Chomczynski和Sacchi 于1987年提

22、出。它以含4mmol/L的(異)硫氰酸胍與0.1mmol/L的-巰基乙醇的變性溶液裂解細胞，然后在pH4.0的酸性條件下，用酚/氯仿抽提裂解溶液，最后通過異丙醇沉淀與75%的乙醇洗滌來制備RNA。 。本法具有簡便、快速、經濟、高效及提取的RNA質量高等優點，能在3小時內迅速處理多個標本 酸性異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法 分離總RNAZhejiang Provincial Key Lab of Medical GeneticsmRNA的分離純化與序列明確的rRNA、tRNA、snRNA、scRNA不同，真核生物的mRNA在細胞中含量少，種類多且分子量大小不一。除血紅蛋白及組蛋白的mRNA外，絕大多

23、數mRNA在其3末端帶有長短不同的poly（A）尾巴。依據mRNA的結構特征，利用堿基配對原則，通過oligo（dT）-纖維素或poly（U）-瓊脂糖凝膠的親和層析，可以很容易地從總RNA制品中分離純化mRNA。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics1、oligo（dT）-纖維素柱層析法2、oligo（dT）-纖維素柱離心法3、oligo（dT）-纖維素液相結合離心法4、磁性球珠分離法 該法聯合利用了oligo（dT）與poly（A）的互補配對、生物素（biotin）與鏈親和素（streptavidin）的結合特異性以及磁性分離原理，可對

24、poly（A）+RNA進行高效、靈敏及快捷的分離。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics5、其它方法Poly(U)-凝膠層析法: 利用 Poly(U)與 Poly(A)的互補配對原理Poly(U)-濾紙法: 將總RNA加到共價交聯有Poly(U)的濾紙上,經洗滌后加熱洗脫Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics三、蛋白質的分離與純化Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics蛋白質的分離純化是研究蛋白質化學組成、結構及生物學功能、新蛋白

25、質的發現和疾病分子診斷的基礎；分子克隆中，下游的處理和分析鑒定，基因工程產品的制備，也需要蛋白質的分離和純化。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics蛋白質分離純化的總目標是增加制品的純度（purity）或比活（specific activity），以增加單位蛋白質重量中靶蛋白的含量或生物學活性（比活常以活力單位數/毫克蛋白質表示），即從蛋白混合物中設法去除不要的雜蛋白和變性的靶蛋白，使靶蛋白的產量達到最高值。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics蛋白質分離純化的一般技術路線 Zhej

26、iang Provincial Key Lab of Medical Genetics 分離純化的總體原則 純化蛋白質總是希望純度和產率均高，例如純化某種酶，理想的結果是比活力和總回收率均高，但實際工作中二者不能兼得，通常在科研上希望比活力盡可能高，而犧牲一些回收率，在工業生產和分子診斷中則正相反。一是保證靶蛋白結構的完整，防止降解和活性蛋白質的變性；二是盡量滿足研究與診斷對靶蛋白純度的要求。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics蛋白質分離純化的條件蛋白質是一類結構復雜、有生物活性的生物大分子，離開天然的存在體系，其結構與活性變得極不穩定

27、，因此從生物材料中提純各種靶蛋白均需要特定的條件。應注意各種因素對靶蛋白的影響。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics緩沖液 鹽、金屬離子和螯合劑.3. 還原劑 4. 去垢劑5. 增溶劑 6. 蛋白酶抑制劑（pronase inhibitor）7. 蛋白質的環境因素 表面效應的影響溫度的影響儲存Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics蛋白質的分離純化方法蛋白質的分離純化是依據其溶解性、分子質量大小及形狀、電離性質和生物學功能的差異而進行的。分離純化的方法可分類如下：以溶解度的差異為依

28、據的方法：鹽析、分配層析、有機溶劑沉淀、選擇性沉淀和結晶等；以分子大小及形狀差異為依據的方法：差速離心、區帶離心、超濾、透析和凝膠過濾層析等；Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics以電離性質差異為依據的方法：電泳、離子交換層析等；以生物學功能專一性為依據的方法：親和層析。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics鹽析法：將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質溶液，使蛋白質表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導致蛋白質沉淀。 等電點沉淀法：凈電荷為零，分子之間的靜電排斥力最小，因而容易聚集形成沉

29、淀。該法適用于在等電點pH穩定的蛋白質。有機溶劑沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（保持低溫），破壞蛋白質的水化層，使蛋白質的溶解度降低而沉淀。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics凝膠過濾層析(gel filtration)凝膠色譜的機理是分子篩效應，在洗脫過程中，大分子不能進入凝膠內部，而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外；而小分子可以進入凝膠顆粒內部的多孔網狀結構，路徑長、流速慢，以至最后流出柱外。因此，混合樣品如同“過篩”一樣，因分子大小的不同得以彼此分開。 凝膠過濾層析亦稱凝膠色譜、排阻色譜或分子篩，是利用凝膠把分子大小不同的物質分離開的一

30、種方法。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics電 泳蛋白質在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質在電場中泳動而達到分離各種蛋白質的技術, 稱為電泳(elctrophoresis) 。電泳(elctrophoresis)Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics幾種重要的蛋白質電泳SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS）：常用于蛋白質分 子量的測定。每一個蛋白質分子都因為結

31、合了許多的SDS而帶有大量的負電荷，而蛋白質分子原有的電荷則可以忽略。由于所有的蛋白質顆粒都帶有大量的負電荷，而且它們的電荷密度也大體相同，因此，Eq值接近一個常數。所以該法主要利用了蛋白質分子量大小不同而分離蛋白質。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics等電聚焦電泳（isoelectric focusing，IEF） 通過蛋白質等電點的差異而分離蛋白質的電泳方法。pH梯度以兩性電解質ampholyte（脂肪族多胺和多羧同系物）在外電場作用下自然形成。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genet

32、ics 雙向凝膠電泳two-dimensional electrophoresis Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics方法原理優點缺點凝膠層析分子篩的排阻效應分辨力高、不會引起變性凝膠介質昂貴、處理量有限離子交換層析各組份與離子交換劑親和力不同分辨力高、處理量較大需酸堿處理樹脂、操作耗時電泳法等電點、分子量、電荷的差異分辨力很高、可連續制備儀器試劑昂貴鹽析法破壞水化膜和中和表面電荷操作簡便、成本低、重復性好、對蛋白有保護作用分辨率差、純化倍數低、沉淀中混雜鹽分選擇性沉淀等電點、熱變性、酸堿變性等沉淀作用選擇性較強、方法簡便、種類較多應

33、用范圍較窄有機溶劑沉淀脫水作用和降低介電常數操作簡便、分辨較強對蛋白質或酶有變性作用親和層析蛋白質與配體之間特殊的親和力分辨力很高局限性大高速與超速離心沉降系數或密度差異操作方便、容量大設備昂貴制備HPLC凝膠過濾、離子交換、反向色譜等分辯力很高、步驟少，儀器昂貴常用的蛋白質分離純化方法 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有成千上萬種不同的蛋白質，蛋白質的分離純化往往要采取多種方法聯合使用，并通過預實驗進行條件優化，逐步地制備高純度或高比活的靶蛋白，實現蛋白質分離純化的目標 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics蛋白質樣品的純度鑒定蛋白質的純度（purity）一般指是否含有其它雜蛋白，而不包括鹽、緩沖液離子、SDS等小分子在內，一定條件下的相對均一性。目前常用的