1、-1-7上海大學生命科學學院第十章 酶作用機制和酶調整一、酶活性部位二、酶催化反應獨特性質三、影響酶催化效率相關原因四、酶催化反應機制實例五、酶活性調整控制六、同工酶第1頁第1頁-1-7上海大學生命科學學院一、酶活性部位活性中心：酶分子中結合底物并起催化作用少數氨基酸殘基，包括底物結合部位（決定酶專一性）、催化部位（決定酶所催化反應性質）。頻率最高活性中心氨基酸殘基：Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。不需要輔酶酶：活性中心是酶分子在三維結構上比較靠近少數幾種氨基酸殘基或是這些殘基一些基團。 需要輔酶酶：輔酶分子或輔酶分子某一部分結構往往就是活性中心構成部分。（一）酶活性部

2、位特點第2頁第2頁-1-7上海大學生命科學學院接觸殘基：R1、R2、R6、R8、R9、R163輔助殘基：R3、R4、R5、R164、R165結構殘基：R10、R162、R169非奉獻殘基：其它第3頁第3頁-1-7上海大學生命科學學院酶蛋白必需殘基非必需殘基活性中心活性中心外接觸殘基輔助殘基結構殘基結合殘基催化基團（1）接觸殘基：結合基團，催化基團。（2）輔助殘基：不與底物接觸，輔助酶與底物結合，幫助接觸殘基。上述兩類殘基構成酶活性中心。（3）結構殘基：維持酶分子三維構象，與酶活性相關，但不在酶活性中心范圍內，屬于酶活性中心以外必需殘基。上述三類殘基統稱酶必需基團（4）非奉獻殘基（非必需基團）也

3、許在免疫，酶活性調整，運送轉移，預防降解等方面起作用。 第4頁第4頁-1-7上海大學生命科學學院酶活性部位特點：（1）活性部位在酶分子總體中只占相稱小部分，往往只占整個酶分子體積1%-2% ；（2）酶活性部位是一個三維實體，含有三維空間結構。 活性中心空間構象不是剛性，在與底物接觸時表現出一定柔性和運動性。（鄒承魯研究酶變性工作）（3）通過誘導契合酶和底物結合；（4）酶活性部位是位于酶表面一個裂隙內，裂隙內是一個相稱疏水環境，從而有助于同底物結合；（5）底物通過次級鍵較弱力結合到酶上。第5頁第5頁-1-7上海大學生命科學學院（二）研究酶活性部位辦法（1）通過酶專一性：研究酶專一性底物結構特點、

4、酶競爭性克制劑結構特點等。（2）酶化學修飾法：比如1.用共價修飾試劑作用于酶，查明保持酶活力必需基團；2.親和標識（合成底物類似物）；3.SH保護劑使用。（3）X射線晶體衍射法（4）分子生物學辦法第6頁第6頁-1-7上海大學生命科學學院二、酶催化反應獨特性質（1）酶反應分為兩類：僅涉及電子轉移和涉及電子和質子兩者或者其它基團轉移。（2）催化作用是以氨基酸側鏈上功效基團和輔酶為媒介。（3）酶催化反應最適pH范圍通常狹小。（4）酶分子很大，而活性部位通常只比底物稍大一些，一個巨大酶結構對穩定活性部位構象是必要。（5）酶含有復雜折疊結構。第7頁第7頁-1-7上海大學生命科學學院三、影響酶催化效率相關

5、原因（一）底物和酶鄰近效應與定向效應鄰近效應：酶與底物形成中間復合物后使底物之間、酶催化基團與底物之間互相靠近，提升了反應基團有效濃度。定向效應：由于酶構象作用，底物反應基團之間、酶與底物反應基團之間正確取向效應。酶把底物分子從溶液中富集出來，使它們固定在活性中心附近，反應基團互相鄰近，同時使反應基團分子軌道以正確方位互相交疊，反應易于發生。第8頁第8頁-1-7上海大學生命科學學院鄰近效應與定向效應對反應速度影響：使底物濃度在活性中心附近很高酶對底物分子電子軌道含有導向作用酶使分子間反應轉變成份子內反應鄰近效應和定向效應對底物起固定作用 第9頁第9頁第10頁第10頁-1-7上海大學生命科學學院

6、（二）底物形變和誘導契合酶中一些基團可使底物分子敏感鍵中一些基團電子云密度改變，產生電子張力，減少了底物活化能。酶從低活性形式轉變為高活性形式，利于催化。底物形變，利于形成ES復合物。底物構象改變，過度態結構，大大減少活化能。第11頁第11頁-1-7上海大學生命科學學院ZnZnGlu270Tyr248Arg145底物 羧肽酶結合底物前后構象改變第12頁第12頁-1-7上海大學生命科學學院（三）酸堿催化酶分子一些功效基團起瞬時質子供體或質子受體作用。影響酸堿催化反應速度兩個原因酸堿強度(pK值）。組氨酸咪唑基解離常數為6，在pH6附近給出質子和結合質子能力相同，是最活潑催化基團。給出質子或結合質

7、子速度。咪唑基最快，半壽期小于10-10秒第13頁第13頁-1-7上海大學生命科學學院（四）共價催化酶作為親核基團或親電基團，與底物形成一個反應活性很高共價中間物。酶親核基團：Ser-OH，Cys-SH，His-N、Asp-COOH；底物親電中心：磷酰基（-P=O），酰基（-C=O），糖基（Glu-C-OH）一些輔酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也能夠參與共價催化作用。催化劑通過與底物形成反應活性很高共價過渡產物，使反應活化能減少，從而提升反應速度過程，稱為共價催化。第14頁第14頁-1-7上海大學生命科學學院（五）金屬離子催化金屬酶（metalloenzyme):含緊密結合金屬離子，Fe2+

8、、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co3+。金屬-激活酶（metal-activated enzyme):含松散結合金屬離子，Na+、K+、Mg2+、Ca2+。金屬離子參與四種主要催化路徑（1）通過結合底物為反應定向（2）通過本身價數改變參與氧化還原反應（3）屏蔽底物或酶活性中心負電荷（4）金屬離子通過水離子化增進親核催化。第15頁第15頁-1-7上海大學生命科學學院（六）多元催化和協同效應在酶催化反應中，經常是幾種基元催化反應配合在一起共同起作用。第16頁第16頁-1-7上海大學生命科學學院（七）活性部位微環境影響 疏水環境介電常數低，加強極性基團間作用。電荷環境在酶活性中心附近，往往有一電荷

9、離子，可穩定過渡態離子 第17頁第17頁-1-7上海大學生命科學學院四、酶催化反應機制實例（一）溶菌酶（lysozyme）NAG:N-乙酰氨基葡萄糖NAM:N-乙酰氨基葡萄糖乳酸第18頁第18頁 溶菌酶-底物復合物酶切位點第19頁第19頁溶菌酶活性中心與底物結合示意圖Asp52Glu35（極性區）（非極性區）第20頁第20頁溶菌酶催化反應機理C1+非極性區極性區HO - E環H2O（廣義酸堿催化）第21頁第21頁-1-7上海大學生命科學學院（二）RNase A RNase-底物復合物第22頁第22頁RNase活性中心酸堿催化機理第23頁第23頁核糖核酸鏈受Rnase水解位點第24頁第24頁-1

10、-7上海大學生命科學學院（三）羧肽酶 A 羧肽酶活性中心Zn2+中心作用第25頁第25頁-1-7上海大學生命科學學院羧肽酶活性中心必需基團與底物間結合第26頁第26頁-1-7上海大學生命科學學院ZnZn羧肽酶結合底物前后構象改變第27頁第27頁-1-7上海大學生命科學學院羧肽酶活性中心共價催化機理 145第28頁第28頁-1-7上海大學生命科學學院（四）絲氨酸蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）胰凝乳蛋白酶分子中催化三聯體構象His57Asp102Ser195Asp102His57Ser195His57102AspSer195A.酶分子中電荷中繼網B.加上底物后，從Ser轉移一個質子給His，帶正電荷咪唑基

11、通過帶負電荷Asp靜電互相作用被穩定Ser195102AspHis57底物第29頁第29頁-1-7上海大學生命科學學院氫鍵體系-電荷中繼網第30頁第30頁胰凝乳蛋白酶反應詳細機制（1）結合底物His57 質子供體形成共價ES復合物C-N鍵斷裂底物第31頁第31頁胰凝乳蛋白酶反應詳細機制（2） 氨基產物釋放四周體中間物崩潰水親核襲擊羧基產物釋放H2OR-NH2第32頁第32頁-1-7上海大學生命科學學院五、酶活性調整控制（一）別構調控概念：酶分子非催化部位與一些化合物可逆地非共價結合后造成酶分子發生構象改變，進而改變酶活性狀態，稱為酶別構調整(allosteric regulation)，含有這

12、種調整作用酶稱別構酶(allosteric enzyme)。別構酶促反應底物濃度和反應速度關系不符合米氏方程，呈S型曲線。凡能使酶分子發生別構作用物質稱為效應物(effector)，通常為小分子代謝物或輔因子。如因別構造成酶活性增長物質稱為正效應物(positive effector)或別構激活劑，反之稱負效應物(negative effector)或別構克制劑。別構調整普遍存在于生物界，許多代謝路徑關鍵酶利用別構調整來控制代謝路徑之間平衡，研究別構調控有主要生物學意義。第33頁第33頁A-非調整酶B-正協同別構酶 S形曲線 別構酶與米氏酶動力學曲線比較當底物濃度發生很小改變時，別構酶就極大地

13、控制著反應速度。在正協同效應中使得酶反應速度對底物濃度改變極為敏感。第34頁第34頁-1-7上海大學生命科學學院區別酶類型有兩種原則a. Koshland原則：CI（cooperativity index）協同指數：酶分子中結合位點被底物飽和90%和10%時底物濃度比值。亦稱飽和比值Rs(saturation ratio) Rs= 酶與底物結合達90%飽和度時底物濃度酶與底物結合達10%飽和度時底物濃度 Rs=81 米氏類型酶 Rs81 含有正協同效應別構酶 Rs81 含有負協同效應別構酶b.Hill系數： Hill系數=1 米氏類型酶 Hill系數1 含有正協同效應別構酶 Hill系數1 含

14、有負協同效應別構酶第35頁第35頁1-非調整酶2-正協同別構酶3-負協同別構酶 正、負協同別構酶與非調整酶動力學曲線比較含有負協同效應酶在底物濃度較低范圍內酶活力上升快，但再繼續下去，底物濃度雖有較大提升，但反應速度升高卻較小。使得酶反應速度對底物濃度改變不敏感第36頁第36頁天冬氨酸轉氨甲酰酶（ATCase）ATCaseATP+氨甲酰磷酸天冬氨酸CTP-UTPUMP氨甲酰天冬氨酸第37頁第37頁-1-7上海大學生命科學學院E.coliATCase亞基排列c:催化亞基（catalytic subunit）r:調整亞基（ regulative subunit）第38頁第38頁-1-7上海大學生命

15、科學學院ATCase半分子（c3r3)結構第39頁第39頁-1-7上海大學生命科學學院ATCase別構過渡作用低催化活性構象T(tense) - 態CCCCCC R R R R R RCCCCCC高催化活性構象R(relax) -態R RR RR RPALA第40頁第40頁-1-7上海大學生命科學學院PALA(N-磷乙酰-L-天冬氨酸)結合到ATCase活性中心模型第41頁第41頁ATCase變構效應動力學特性ATP（正效應劑）CTP（負效應劑）低催化活性構象T(tense) - 態CCCCCC R R R R R RCCCCCC高催化活性構象R(relax) -態R RR RR RVmax1

16、/2VmaxKm第42頁第42頁別構酶齊變模型SSSSSSSSSST狀態（對稱亞基）R狀態（對稱亞基）SSSS對稱亞基對稱亞基齊步改變第43頁第43頁-1-7上海大學生命科學學院別構酶序變模型SSSSSSSSSSSSSS亞基所有處于R型亞基所有處于T型依順序改變第44頁第44頁-1-7上海大學生命科學學院（二）酶共價修飾 一些酶能夠通過其它酶對其多肽鏈上一些基團進行可逆共價修飾，使其處于活性與非活性互變狀態，從而調整酶活性。這類酶稱為共價修飾酶。當前發覺有數百種酶被翻譯后都要進行共價修飾，其中一部分處于分支代謝路徑，成為對代謝流量起調整作用關鍵酶或限速酶。 由于這種調整生理意義廣泛，反應靈敏，

17、節約能量，機制多樣，在體內顯得十分靈活，加之它們常受激素甚至神經指令，造成級聯放大反應，因此日益引人注目。 AP1GEDCBHEa-bEc-dEc-g關鍵酶（限速酶）P2第45頁第45頁-1-7上海大學生命科學學院蛋白質磷酸化和脫磷酸化 蛋白激酶ATPADP蛋白質蛋白質Pn蛋白磷酸酶nPiH2O第一類：Ser/Thr型第二類：Tyr型 第一類：Ser/Thr型 第二類：Tyr型 第三類：雙重底物型第46頁第46頁反應類型 共價修飾 被修飾氨基酸殘基共價修飾反應例子磷酸化腺苷酰化尿苷酰化Tyr,Ser,Thr.HisTyrTyr甲基化GluS-腺苷-MetS-腺苷-同型 Cys第47頁第47頁A

18、TP ADP腎上腺素或胰高血糖素132102104106108葡萄糖456 級聯系統調控糖原分解示意圖意義：由于酶共價修飾反應是酶促反應，只要有少許信號分子（如激素）存在，即可通過加速這種酶促反應，而使大量另一個酶發生化學修飾，從而取得放大效應。這種調整方式快速、效率極高。腎上腺素或胰高血糖素1、腺苷酸環化酶（無活性）腺苷酸環化酶（活性）2、ATPcAMPR、cAMP3、蛋白激酶（無活性）蛋白激酶（活性）4、磷酸化酶激酶（無活性）磷酸化酶激酶（活性）5、磷酸化酶 b（無活性）磷酸化酶 a（活性）6、糖原6-磷酸葡萄糖1-磷酸葡萄糖葡萄糖血液ATP ADP（極微量）（大量）第48頁第48頁-1-

19、7上海大學生命科學學院（三）酶原激活體內合成出來酶，有時不含有生物活性，通過蛋白水解酶專一作用后，構象發生改變，形成活性中心，變成有活性酶。這個不具活性蛋白質稱為酶原（zymogen或proenzyme），這個過程稱為酶原激活。 該改變過程，是生物體一個調控機制。這種調控作用特點是，蛋白質由無活性狀態轉變成活性狀態是不可逆。第49頁第49頁-1-7上海大學生命科學學院牛胰蛋白酶第50頁第50頁胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽腸激酶活性中心胰蛋白酶原激活示意圖第51頁第51頁胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽腸激酶胰蛋白酶對各種胰臟蛋白酶激活作用胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶彈性蛋白酶原彈性蛋白酶羧肽酶原羧肽酶第52頁第52頁-1-7上海大學生命科學學院六、同工酶存在于同一個屬或不同種屬，同一個體不同組織或同一組織、同一細胞，含有不同分子形式但