1、Arg54保守位點對嗜熱玫瑰紅球菌肌氨酸氧化酶的底物適應性和催化效率的影響肌氨酸氧化酶(sarcosine oxidase，SOX，EC.1.5.3.1)是一種黃素氧化酶，催化肌氨酸的甲基脫除反應從而生成甘氨酸，其輔因子是黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)或黃素單核苷酸(flavin mononucleotide，FMN)1-2。近年來，SOX已被廣泛應用于臨床測試中，與肌酸酐酶、肌酸酐酶一起測定人體中肌酐含量3。此外，在食品工業中，基于SOX的生物傳感器和探針已被用于在葡萄酒發酵中測定有機酸和甘油的含量4-5。在之前的報道中，芽孢桿菌屬(Ba

2、cillussp.)的SOX(BSOX)基因(GenBank：A Y626822.2)在大腸桿菌中高效表達6-7，但由于疏水基團容易暴露，較長的儲存時間往往導致二級結構的破壞和最終聚集，導致該酶的熱穩定性較差8。為篩選出具有良好耐熱性的菌株，從來源于美國黃石公園堿性溫泉極端嗜熱菌TherommicrobiumroseumDSM 51599的全基因組中篩選出一個假設的SOX基因(GenBank：ACM06094.1)，命名為TrSOX。將TrSOX基因插入含有L-鼠李糖誘導的啟動子的pRhamTM質粒中，并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達，但大部分重組酶為包涵體。之后又通過隨機誘變，篩選到穩定

3、性低的可溶性突變體(F235V/F339L)10。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)WB600是重組表達外源蛋白較為便利的宿主細胞11-12，所以為嘗試提高目的蛋白的可溶性，將TrSOX基因插入到pMA5質粒中，然后在該系統中表達，結果表明TrSOX的可溶性表達水平升高并表現出明顯的耐熱性和有機溶劑耐受性13。為進一步提高TrSOX在枯草芽孢桿菌WB600中的表達水平，構建了含有木糖誘導啟動子的pMA5-Pxyl質粒并設計了S320R突變體來降低TrSOX14的表面疏水性。此外，TrSOX已被證明是一種手性特異性N-甲基脫除酶，能夠識別N-甲基-L-氨基酸類化合物和其他N-甲基非

4、氨基酸化合物13-14。在之前的工作中，TrSOX還被證明可以促進N-甲基氮農藥的降解15，并且對環境的毒害較少，這為酶法降解此類農藥開創了先河。N-甲基脫除反應對科研工仍然是一個巨大的挑戰，雖然人們已經研究了許多化學方法16-17，但是所有這些化學反應都需要極端的反應條件，反應速度較慢，而且所用試劑大多有一定的毒性。目前，雖然已經報道了幾種能夠在溫和環境、友好反應條件下通過特定的酶完成N-脫甲基化的反應，然而，這些酶對底物沒有手性選擇性18-19。由于TrSOX能夠有效地去除具有手性特異性底物中的N-甲基20，因此在化學、醫藥和食品領域有很大的應用潛力。但是野生型TrSOX對N-甲基-L-氨

5、基酸類的底物適應性仍然有限，有必要擴大底物譜，提高催化活性。氨基酸序列比對表明TrSOX第54位的Arg是同源家族催化中心限制性保守殘基之一，其蛋白結構中胍基可能和氨基酸類底物的羧酸基形成直接的相互作用，也可能會影響底物的手性選擇性，因此R54位的突變可能在TrSOX的催化活性中起著重要的作用13-14。然而，目前還不清楚該位點如何改造會影響催化性能，在某些酶的分子進化研究中發現，一些嚴格保守位點的突變帶來了有趣的結果21-22，因此本研究采用R54定點飽和突變來影響TrSOX對N-甲基底物的催化性質。3 結論與討論在本次工作中，為研究R54保守位點對TrSOX催化性能的影響，采用定點飽和突變

6、試圖獲得19個突變體。進一步通過活性顯色平板篩選配合定點突變獲得了14個具有活性以及1個完全失活的突變體。R54位的單點突變體保持了天然TrSOX優異的熱穩定性。在具有活性的突變體中，R54K和R54D對大多數N-甲基-氨基酸的催化效率顯著提高而其他二級結構中-螺旋含量急劇下降的突變體則顯著降低。這表明R54對TrSOX的折疊與整體結構的維持具有重要的意義。此外，54位殘基的堿性或酸性側鏈可以直接與底物的活性側鏈相互作用并引導底物的進入與產物的釋放，從而提高催化效率。由于天然TrSOX對大多數非氨基酸相關底物都不起作用，R54上的突變體可以幫助拓寬底物的適應性。一些吡咯烷、哌啶相關的底物甚至更大的含氮雜環類底物都可以被催化，這些天然TrSOX不具備催化活性的催化效率雖然沒有N-甲基氨基酸類底物高，但是仍有進一步優化的潛力。由于R54突變體對N-甲基非氨基酸類底物的反應機理尚不清楚，還需要更多的研究來鑒定產物，而TrSOX突變體