1、食品中致病微生物的檢測技術1食品中致病微生物的檢測技術分子生物學技術運用到有食品檢測方面，主要是針對一些有害微生物的核酸進行研究通過核酸雜交和核酸合成等反應快速檢測樣品中是否含有特定的有害微生物，并進一步確定其含量，其中最主要的技術包括PCR技術、DNA探針技術和基因芯片技術。21.聚合酶鏈反應（PCR） （1）傳統PCR技術聚合酶鏈反應( polymerase chain reation, PCR)是1985年誕生的一項體外擴增DNA的方法，是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應，體外擴增特異DNA片段的技術。通過對人工難以培養的微生物相應DN

2、A 或RNA 片段的擴增，檢測擴增產物含量，從而快速的對飼料中致病菌含量進行檢測。3李秀娟等（2009年）對117 株金黃色葡萄球菌的nuc片段進行了PCR 擴增和焦磷酸測序，結果顯示所建立的PCR 方法能對117 株金葡菌進行準確檢測，焦磷酸測序結果的一致性進一步驗證了PCR 擴增結果的特異性，說明該方法針對目前所用的研究菌株而言，尚未出現假陽性和假陰性結果，具有較高的特異性。 4傳統PCR技術在實際應用中表現出一些缺陷，例如只能定性而不能定量地檢測，且在有死細菌存在的情況下容易產生假陽性、不能檢測致毒微生物產生的毒素等。 隨著各項新技術的出現以及與PCR技術的有機結合，發展起來了一系列改進

3、的PCR技術。目前應用的方法主要有實時熒光定量PCR、多重PCR以及PCR聯合技術等。5實時熒光定量PCR實時定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時檢測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量的方法。該方法可以對GMO 進行定量分析，目前已被一些國家的政府實驗室采用。6楊柳等（2011年）根據沙門氏菌fimY 基因序列設計引物和探針, 采用基因重組技術構建用于沙門氏菌檢測的定量標準品，成功構建了沙門氏菌重組質粒標準品和沙門氏菌實時熒光定量PCR 方法，具有較好的特異性、敏感性、穩定性和重復性。7多重PCR多重PCR是常規PCR方法的改進，它是在同一個反

4、應中同時擴增兩個或多個目標基因序列。這種方法具有更大的可靠性和適應性，并且能降低檢測成本。徐偉等（2009年）針對單增李斯特菌轉錄調節子基因prfA 和志賀氏菌侵襲性質粒抗原H 基因ipaH 設計引物， 采用多重PCR 對兩種致病菌進行同步鑒定，提供了一種快速且特異性高的同步檢測單增李斯特菌和志賀氏菌的方法。 8PCR聯合技術傳統PCR技術在實際應用中表現出一些缺陷，采用一些新技術與PCR結合，對PCR技術的完善和發展提供了有力的支持，并應用在致病菌檢測中。王永等（2009年)探討以16S rDNA 保守區段為PCR擴增對象，運用SSCP技術對致瀉大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌以及蠟樣

5、芽胞桿菌進行單鏈構象多態性分析，為食源性致病菌的快速鑒定提供方法依據。9劉成志等（2009年）根據志賀氏菌ipaH 基因的保守序列設計特異性引物，篩選合適的DNA 模板制備方法，采用快速常規PCR 和定量實時PCR 結合，對培養液中及乳飲料陽性樣品中的志賀氏菌進行檢測，建立乳飲料中快速檢測志賀氏菌的有效方法。楊大偉等（2011年）應用PCR 結合變性高效液相色譜( DHPLC) 技術，以A 型肉毒梭菌的A 型肉毒神經毒素基因作為靶基因設計特異性引物，PCR 擴增的產物經DHPLC 技術進行快速檢測，最低檢出限可達到為111ng /tube，該方法可以快速、準確檢測A 型肉毒梭菌。 102. 核

6、酸探針技術根據核酸探針中核苷酸成分的不同，可將其分為DNA探針、RNA探針和寡核苷酸探針，其中DNA探針是最常用的核酸探針。DNA 探針技術又稱分子雜交技術，是利用DNA分子的變性、復性以及堿基互補配對的高度精確性，對某一特異性DNA序列進行探查的新技術。11微生物經過處理后固定于另一固相表面上, 經洗滌變性后加入DNA探針進行雜交，DNA探針可以與同源性的靶DNA進行互補性結合，依據指示劑選用合適的方法進行檢測。目前，DNA探針技術已經在沙門氏菌、產腸毒素大腸桿菌及乙型肝炎病毒等檢測中得到了應用。12續文彬(2008年)針對單增李斯特氏菌hly部分基因設計探針，對腸炎沙門氏菌，大腸埃希氏菌，

7、綠膿假單抱病菌，空腸/結腸彎曲桿菌等非單增李斯特氏菌經雜交保護分析后，只有單增李斯特氏菌為陽性結果，具有較好的特異性。薛力剛等（2010年）通過吖啶酯標記核酸探針的方法檢測病原菌，核酸探針與待檢樣品中金黃色葡萄球菌的rRNA 序列進行雜交，形成穩定的DNA: RNA 雜交體，使用堿液破壞未雜交探針，在堿性過氧化氫中檢測發光。核酸探針法檢測金黃色葡萄球菌大大縮短了檢測周期，且特異性和敏感性較高，為金黃色葡萄球菌的鑒定提供了一種新方法。133.基因芯片技術基因芯片的主要原理是指將各種基因寡核苷酸點樣于芯片表面，微生物樣品DNA經PCR擴增后制備熒光標記探針，然后再與芯片上寡核苷酸點雜交，最后通過檢

8、測雜交信號的強度及分布確定檢測樣品中特定微生物的存在。與傳統的微生物檢測方法相比，基因芯片技術先進性主要體現在高通量檢測、簡便快速、敏感性高等方面，是食品安全方面的重大技術突破。14 陳昱等(2009年)利用芯片技術對志賀氏菌等26株食源性微生物進行檢測，最后成功建立了檢測和鑒定志賀氏菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157的方法，為3種食源性致病菌的快速檢測和鑒定提供了準確、快速、靈敏的方法。賀晨等（2011年）篩選志賀氏菌、腸炎沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、大腸桿菌O157等11種特異基因作為目的基因，建立了一種運用多重PCR 方法結合基因芯片技術快速、準確檢測11 種常見致病菌的方法，為流行病學調查和傳

9、染性疾病的早期診斷和判定提供了一種有效的檢測手段。15 陸長勇（2009年）針對金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、單核細胞增生李斯特菌等8種常見的食源性致病菌建立了基于單堿基延伸標簽反應原理的基因芯片檢測方法，其靈敏度可達到0.1pg，以鼠傷寒沙門氏菌為單一檢測對象的細菌純培養物靈敏度可達到5102 CFU/mL。16結語生物技術因其低成本、高效、高通量和高特異性等特點已經滲透著食品檢測領域，其優越性日趨明顯，成為未來食品安全檢測中的主力軍。但每種方法難免有其局限性，在應用中需依具體需要進行選擇或搭配使用，也期待各種方法的優化和新技術新方法的問世，從而為人們賴以生活的食品提供安全和營養的可靠保障。1

10、7參考文獻1 李秀娟, 徐保紅, 田會方等. 基于PCR的金葡菌準確檢測方法的建立及應用J. 中國人獸共患病學報, 2009, 25 (5): 442-445.2 楊柳, 蘇明權, 馬越云等. 熒光定量RT-PCR 檢測沙門氏菌方法的建立J.中國實驗診斷學, 2011, 15 (1) , 17-20.3徐偉, 劉軍, 李素芳. 單增李斯特菌與志賀氏菌多重PCR 檢測技術的建立J. 中國食品學報, 2009, 9 (1): 201-207.4 王永, 趙新，蘭青闊，朱珠, 程奕. 4種食源性致病菌的PCR-SSCP檢測技術研究J. 天津農業科學, 2009, 15(1): 13-15.5 劉成志

11、，錢凱，李潔莉等. 乳飲料中志賀氏菌的快速PCR檢測技術研究J. 研究報告, 2009(1): 1-5.186楊大偉, 劉云國, 譚樂義. 食品中A型肉毒梭菌PCR-DHPLC檢測方法的建立J. 食品工業科技, 2011(6): 398-400.7 續文彬. 單增李斯特氏菌液相核酸探針檢測方法的建立與初步應用. 吉林農業大學碩士學位論文, 2008, 28-31.8 薛力剛, 劉金華, 王全凱. 金黃葡萄球菌核酸探針檢測方法的建立J. 中國生物制品學雜志. 2010 , 23(1): 91-94.9 陳昱, 潘迎捷, 趙勇等. 基因芯片技術檢測3種食源性致病微生物方法的建立J. 微生物學通報, 2009, 36(2): 2