1、表觀遺傳學概覽2011-PSB-A conceptual model of potential interactions amongst plant hormones2008-CGT-The Yin and Yang of microRNA (miRNA) activity in cancer pathophysiologyPit=G/bbs/i/index.htm/newsf/生物通專題：表觀遺傳學專題/Epigenetic differences：monozygotic twins雌性的一條X染色體完全失去活性RainbowCopy CatAllieX染色體失活X-Chromosome I

2、nactivation：The calico cat轉座子導致的PEV基因表達模式不同表型相同的基因型Agouti基因 甲基化/葉酸葉酸很重要人類基因組計劃1. 搞清楚人類基因組的DNA堿基的內容和順序2. 編碼區 (編碼蛋白的DNA序列)：占基因組的4,000個物種的基因組計劃正在進行；3. 比較基因組學：比較多個物種的基因、蛋白質的序列來揭示功能的保守性，并發現新的規律。遺傳信息傳遞：中心法則1. DNA自身通過復制傳遞遺傳信息；2. DNA轉錄成RNA；3. RNA自身能夠復制 (RNA病毒)；4. RNA能夠逆轉錄成DNA；5. RNA翻譯成蛋白質。Nature 2004;429:45

3、7-73遺傳類型1. 遺傳編碼信息： 提供生命必需蛋白質的模板2. 表觀遺傳學信息： 何時、何地、以何種方式去應用遺傳信息Waddingtons epigenetics基因型表型Waddingtons epigenetics基因型表型表觀遺傳與癌癥DNA甲基化(1) 高甲基化 (Hypermethylation)：基因表達量低(2) 低甲基化 (Hypomethylation)：基因表達量高腫瘤細胞：(1) 整個基因組甲基化程度很低(2) 某些抑癌基因錯誤的發生甲基化被沉默甲基化程度低：染色體容易發生功能異常表觀治療1. DNA甲基化抑制劑(1) CpG島的異常甲基化：癌癥發生早期(2) 小分

4、子抑制劑：特異性不高(3) 研究前景：選擇性抑制甲基化，激活保護性基因2. 組蛋白去乙酰化酶抑制劑(1) 組蛋白的乙酰化酶 (HATs)：增強轉錄因子活性(2) 組蛋白的去乙酰化酶 (HDACs)：減弱轉錄因子活性(3) 抑制去乙酰化：增強轉錄保護性基因(4) 對特異性要求不高表觀遺傳學( epigenetics)1. 概念 基因的DNA序列不發生改變的情況下，基因表達水平與功能發生改變，并產生可遺傳的表型。2. 特征 (1)可遺傳 (2)可逆性 (3)DNA不變表觀遺傳學的研究內容1. 基因選擇性轉錄表達的調控2. 基因轉錄后的調控3. 蛋白質的翻譯后修飾表觀遺傳修飾表觀遺傳修飾DNA甲基化

5、組蛋白修飾siRNA與miRNA介導的調控基因組印跡(Genomic Imprinting)X染色體失活染色體構型重塑 Rohrmann et al.The Plant Journal, (2011), doi: 10.1111/j.1365-313X.2011.04750.x表觀遺傳學DNA甲基化基因調控模型1. DNA甲基化的主要功能：轉錄沉默(1) 基因的啟動子區域通常不被甲基化修飾(2) 建立特定的基因表達模式： 組織特異性、生殖特異性(3) 基因組印記、X染色體失活2. DNA甲基化抑制基因轉錄的機制：(1) 干擾轉錄因子對DNA元件的識別和結合(2) 將轉錄因子DNA識別序列轉變為

6、阻抑物識別序列(3) DNA甲基化有利于招募染色質重塑或修飾因子3. DNA甲基化： 是轉錄沉默的結果和維持，而不是原因。DNA甲基化DNA甲基化(DNA methylation)是研究得最清楚、 也是最重要的表觀遺傳修飾形式。 在 DNA甲基轉移酶的催化下，利用S-腺苷蛋氨酸(SAM)提供的甲基，將胞嘧啶第5位碳原子甲基化，從而使胞嘧啶轉化為5甲基胞嘧啶(5-mC)。DNA甲基化CH3DNMTdCMPdmCMP(mC)(C)45SAM在哺乳動物基因組中，DNA甲基化的主要位點是CpG二核苷酸。甲基化CpG二核苷酸在整個基因組中分布不均勻，在基因組大部分區域中CpG序列出現頻率較低，但在某些特

7、定區域，如結構基因5-端(啟動子區)，CpG二核苷酸呈高頻率成串排列，此區域稱為CpG島。 基因調控元件(如啟動子)所含CpG島中的5-mC會阻礙轉錄因子復合體與DNA的結合，所以DNA甲基化一般與基因沉默(gene silence)相關聯。 而非甲基化(non-methylated)一般與基因的活化(gene activation)相關聯。而去甲基化(demethylation)往往與一個沉默基因的重新激活(reactivation)相關聯。 DNA甲基化抑制基因轉錄的機制基因啟動子區的甲基化可影響轉錄激活因子和其識別序列的結合，直接抑制基因表達。甲基化的CpG雙核苷酸序列可被甲基結合蛋白家

8、族(MBD)識別，而后者通過吸引組蛋白去乙酰化酶(HDAC)和組蛋白甲基化轉移酶(HMT)等組蛋白修飾蛋白來改變染色質活性，間接影響基因表達。 轉錄起始：1, Structural preparation: chromatin modulation 30 nm 10 nm (beads-on-a-string); 2, Formation of pre-initiation complex. 染色質調整chromatin modulation啟動子“暴露”promoter clearance轉錄起始復合體形成pre-initiation complex formation轉錄起始transcr

9、iption核心 組蛋白修飾核小體重塑轉錄因子、組蛋白、DNA相互作用激活轉錄Prevent the binding of transcription factorsTFDNA甲基化抑制基因轉錄的機制Long-term silencing直接干擾機制 (1)直接干擾機制 (2)間接機制The methyl-CpG-binding proteins MeCP1 and MeCP2能夠與甲基化的DNA結合MeCP2能夠招募Sin3a, HDACs，形成復合物，阻遏轉錄甲基化的CpG結合蛋白-MeCP2Model for methylation-dependent gene silencing. T

10、he structural element of chromatin is the nucleosomal core, which consists of a 146-bp DNA sequence wrapped around core histones. Acetylation of the histones causes an open chromatin config-uration that is associated with transcriptional activity. Methylated cytosines are recognized by methyl-CpG-bi

11、nding proteins (MBDs), which in turn recruit histone deacetylases (HDACs) to the site of methylation, convert-ing the chromatin into a closed structure that can no longer be accessed by the transcriptional machinery.影響DNA甲基化的因素1.DNA甲基化轉移酶(DNA Methyltransferase,DNMT)2. 組蛋白甲基化3.飲食等環境因素對DNA甲基化的影響4.RNA干

12、擾與DNA甲基化DNA甲基化轉移酶DNMT1 作為DNA復制復合物的組分，催化子鏈DNA半甲基化位點甲基化，維持復制過程中甲基化位點的遺傳穩定性。DNMT3a和 DNMT3b 主要催化從頭甲基化，以非甲基化DNA為模板催化新的甲基化位點形成。CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3MaintenanceDNA methyltransferaseDNA replicationCH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3De novo methyltransferaseDemethylaseCH3CH(DNMT1)DNA methylation re

13、actions組蛋白甲基化當沉默脈孢菌中編碼組蛋白3尾部的第位賴氨酸甲基轉移酶基因dim-5時，組蛋白3K9不能發生甲基化，導致基因組胞嘧啶甲基化丟失，由此推斷該菌中組蛋白H3 k9的甲基化可以指導DNA甲基化。 在哺乳動物細胞中，甲基化的CpG結合蛋白MeCP2不僅能促進組蛋白去乙酰化，抑制基因的沉默；同時它還是DNA甲基化和組蛋白甲基化的橋梁。 MeCP2可結合于H19基因啟動子區甲基化的DNA， 并影響組蛋白3甲基轉移酶活性，促使組蛋白 3的賴氨酸甲基化，后者與DNA甲基化一起對 19基因的表達起抑制作用。DNA甲基化模式：正常細胞 vs 癌癥Waterland R A等發現斷奶后的飲食

14、影響IGF2基因甲基化狀態，飲食中缺乏葉酸、B12等甲基供體時可導致成年后IGF2的印記丟失。飲食等環境因素葉酸是生成SAM的前體物質，而SAM 是胞嘧啶甲基化主要的甲基供體，葉酸攝入不足時可導致DNA低甲基化。荷蘭的一項隊列研究表明，葉酸攝入過低可導致甲基化狀態紊亂，這種變化可被過量飲酒加劇。DNA甲基化 vs 轉座子葉酸：很重要IAP: intracisternal A particle非甲基化：異常表達Agouti甲基化：正常表達DNA甲基化 vs 轉座子axin-fusedParamutation-副突變一個沉默的基因常常導致等位基因也發生沉默maize P-rr gene：Myb 轉

15、錄因子1. 分子機理一 (Pairing model)：染色體發生交聯，使得等位基因受到影響；1. 分子機理二 (RNA-mediated trans-induction of chromatin)：RNA參與調控RNA干擾與DNA甲基化在人類細胞中，特異的siRNA可以結合于E-cadherin 啟動子區的CpG島，誘導DNA甲基化和組蛋白H3 K9甲基化。Bao N等通過對植物研究發現miRNA 可誘導PHB基因甲基化及染色質重塑。DNA甲基化的生物學意義 調控基因表達, 在胚胎發育、細胞生長分化，衰老，疾病等方面發揮重要作用。 維持染色體結構 X染色體失活 基因印記 腫瘤發生發展DNA甲

16、基化的檢測方法1.甲基化敏感的限制性內切酶法 2.基于亞硫酸氫鹽修飾的方法3.基于甲基化DNA特異結合富集方法表觀遺傳學組蛋白修飾核小體DNA序列纏繞在核心組蛋白的八聚體上染色質構型和基因轉錄的關系DNA Packing1. 如何將10,000公里長的蠶絲(半徑10-5米)裝入一個籃球中。2. 蠶絲的體積：3.14*10-3m33. 折疊、纏繞組蛋白質修飾一、組蛋白的乙酰化二、組蛋白的甲基化三、組蛋白的磷酸化四、組蛋白的泛素化五、組蛋白的SUMO化六、組蛋白密碼 主要的功能基團AcetylMethylPhosphorylUbiquitin組蛋白的共價修飾組蛋白修飾組蛋白修飾 (2)Epigen

17、etic differences：monozygotic twins5mCH4 乙酰化H3 乙酰化組蛋白的乙酰化1. 通常發生在蛋白質的賴氨酸(K)上；2. 可逆的生化反應：A. Histone acetyltransferase，HAT (30)B. Histone deacetylase, HDAC (18)3. 分子效應：中和賴氨酸上的正電荷，增加組蛋白與DNA的排斥力4. 生物學功能：A. 基因轉錄活化B. DNA損傷修復組蛋白的甲基化1. 主要發生在賴氨酸(K)或精氨酸(R)上；2. Long-term；3. HKMTs (histone lysine methyltransfera

18、ses) vs. PRMTs (protein arginine methyltransferases)4. 可逆的生化反應?5. 分子效應：增加賴氨酸上的疏水力6. 生物學功能：A. 基因轉錄活化B. 基因轉錄沉默C. X染色體失活D. 異染色質致密狀態 (heterochromatin compaction)組蛋白乙酰化、甲基化以及DNA甲基化的關系A. MBD結合甲基化的DNA, 招募HDAC, 組蛋白去乙酰化, 招募HMT, 甲基化組蛋白, 轉錄沉默；B. 組蛋白無乙酰化修飾, MBD結合甲基化的DNA, 再與SET結合，甲基化組蛋白C. 甲基化的組蛋白尾部招募DNMT，對基因長期沉默

19、組蛋白的SUMO化1. 通常發生在賴氨酸(K)上；2. 可逆的生化反應：A. E1, E2, & E3B. SENPs3. 生物學功能：A. 轉錄沉默B. 抑制組蛋白的乙酰化和甲基化組蛋白共價修飾的功能基因轉錄、DNA損傷修復、DNA復制、染色體凝聚等組蛋白修飾：正常細胞 vs. 癌癥表觀遺傳學染色質重塑染色質重塑染色質 (Chromatin): 染色體上高度致密的部分，通常不表達基因常染色質與異染色質1. 常染色質：基因表達活躍的區域，染色體結構較為疏松2. 異染色質：基因表達沉默的區域，染色體結構致密核小體常染色質異染色質常染色質組成型的異染色質端粒動粒染色體上基因沉默的區域染色體上基因活

20、化的區域異染色質與常染色質：100Mb染色體上不同的區域Euchromatin: 常染色質；Heterochromatin: 異染色質E-H或H-稱為染色質重塑(Chromatin Remodeling)分子機理：DNA甲基化，組蛋白修飾，染色質重塑復合物的協同作用。染色質重塑的假設步驟1. 兩類酶調控染色質重塑的過程：組蛋白修飾因子 (histone modifiers) 以及ATP依賴的染色質重塑因子 (chromatin remodelers)2.組蛋白修飾因子并不改變核小體的位置，而是在DNA上作標記，以招募其他的活性成分 (組蛋白密碼) 3.染色質重塑因子：水解ATP釋放能量，從而改

21、變染色質的結構4.染色質重塑因子復合物Ch11 opener p447染色質重塑因子核小體染色質重塑因子與核小體的相互作用組蛋白的乙酰轉移酶的結合活化相應區域去凝聚狀態的染色質活性染色質的產生組蛋白乙酰化酶染色質重塑復合物組蛋白去乙酰化酶染色質重塑復合物Mediator-Pol II復合物：識別活化區域OFFONtrxG保持活性狀態(open chromatin)PRETarget gene組蛋白的乙酰化和甲基化(TAC1 and ASH1 complexes)組蛋白的去乙酰化和甲基化(ESC-E(Z) complex)保持沉默狀態(compact chromatin)PcG染色質重塑- H2

22、A Ubiquitination(PRC1 complex)染色質重塑(BRM complex)AcMe K27 H3Me K4 H3Ub H2APc-G vs. trx-G：作用機制表觀遺傳學基因組印記1. 父系印記基因: 來自父系的等位基因的表達被抑制來自母系的等位基因表達 (mono-allelic)2. 母系印記基因:來自母系的等位基因的表達被抑制來自父系的等位基因表達 (mono-allelic)基因印記基因印記1. 由表觀遺傳修飾決定的，來源于雙親 (Parent-of-origin) 的特異性表達的基因。A. 兩個等位基因中只有一個印記基因表達B. 可遺傳的修飾，并且不改變基因序

23、列的組成2. 由雙親基因組功能的不對稱性所決定印記基因1. 在小鼠中已發現80個印記基因一般認為在人中具有大致相等數量的印記基因基因表達譜的分析結果表明可能有更多的印記基因2. 主要功能: 出生前的生長發育;父系基因的表達 胚胎發育能力增強 母系基因的表達 胚胎發育能力削弱 3. 在特定細胞系及神經發育方面有重要功能印記基因的特征1. 通常成簇出現，在染色體上的分布較為分散 一個簇中一般有311個印記基因絕大多數多時編碼可表達蛋白質的基因 至少有一個起拮抗作用的ncRNA基因，具有雙親特異性的表達模式 每一個印記基因簇由一個印記控制元件 (imprint control element, IC

24、E) 所調控印記控制區域 (imprint control region, ICR) 或者印記中心 (imprinting centre, IC)絕大多數都有CpG islands，能夠發生DNA甲基化在CpG islands內或附近通常有成簇的、有向的重復片段2. 具有等位基因不同的甲基化區域 (differentially methylated regions, DMRs)有些是在所有細胞里，有些具有組織特異性 有些甲基化的DMR存在于激活的等位基因中，有些則存在于失活的等位基因中 3. 通常具有不同的組蛋白修飾，染色體結構等4. DNA復制不同步父系的拷貝較早發生復制印記基因的特征表達模

25、式:母系父系雙等位未知IGF2-H19PWS/ASSNURF-SNRPNUBE3A-UBE3A-ASKCNQ1OT1KCNQ1印記基因的特征基因組印記的相關理論1. 兩性之戰 (Kinship)，遺傳斗爭 (Genetic Conflict), 雙親投資 (Parental Investment)許多印記基因與胎兒 (fetus) 和胎盤 (placenta)的生長和發育相關 父系：希望后代健康，能夠延續基因的存在。父系表達的基因，例如 Igf2, Peg3能夠促進胎兒的生長以及營養的攝取，可能會損害母系的健康 母系：產生更多后代，延續自己的基因。母系表達基因，例如Igf2R, Mash2,

26、Gnas等能夠抑制胎兒生長，減少營養的 開支，從而提高生育后代的數量。2. 進化能力模型 (Evolvability Model): 通過印記方式， 保護一些等位基因免受選擇壓力的影響，從而提高 群體對環境變化的適應能力。生物體感知環境變化，決定等位基因是沉默還是表達例如，如果發育增強有好處，并且該等位基因已出現， 則其印記狀態將被改變3. 卵巢里的時間炸彈 (Ovarian time bomb): 避免卵巢 滋養細胞疾病 孤雌胚胎 (parthenogenetic embryos)生長和發育：葡萄胚，卵子不能成熟，持續生長以致形成癌癥等；如果改變孤雌胚胎基因組，如刪除特定的母系印記基因，能夠

27、存活并類似父系基因組的印記模式表觀遺傳學 X染色體失活XYXX性染色體：人類、哺乳動物ZZZW性染色體：鳥類XYXX性染色體：果蠅XXX性染色體：線蟲雄性：單葉的性腺，輸精管；雌雄同體：兩個卵巢、輸卵管、藏精器，一個子宮優先選擇雄性的精子MATaMATMATaMATaa性染色體：酵母無性染色體：海龜無性染色體：海龜1. 1961年，The Lyon Hypothesis, 由英國遺傳學家 Mary Lyon提出2. 體細胞中的X染色體失活發生在胚胎發育的早期3. 失活是隨機的：每一個細胞中隨機挑選父系/母系 X染色體失活4. 整條X染色體都失去活性 (有例外)5. X染色體失活是永久性的，克隆

28、過程中保持失活 狀態6. 所有哺乳動物中都存在X染色體失活現象X 染色體失活：LyonizationX染色體失活雌性的一條X染色體完全失去活性RainbowCopy CatAllieX染色體失活X染色體失活 vs 疾病與癌癥TIG1 ：人類正常的纖維原細胞2. MCF7 : 癌癥細胞表觀遺傳學siRNA與miRNA介導的調控Traditional RNAs 基因轉錄后的調控1. 非編碼RNA: e.g., Xist and Tsix2. MicroRNA3. Antisense4. Riboswitch RNAs非編碼RNARibosomal RNA (rRNA)Transfer RNA (t

29、RNA)Small nuclear RNA (snRNA)Small nucleolar RNA (snoRNA)Interference RNA (RNAi)Short interfering RNA (siRNA)MicroRNA (miRNA)AntisenseRiboswitch RNAs主要定位于基因的5非轉錄端附近，能夠感知代謝物并調控基因表達RNA干擾及其機制1. RNA干擾：生物體內通過雙鏈RNA分子在mRNA水平上誘導具有特異性序列的基因沉默的過程2. 轉錄后沉默：Post-transcriptional gene silencing, PTGS3. 表觀遺傳學中的一種重要現

30、象1. 1990年，Rich Jorgensen將由強啟動子控制的Chalcone synthase gene轉入淡紫色的矮牽牛花-加深紫色2. Hypopigmentation: 許多花出現雜色，甚至紫色消失，變成白色3. Co-suppressionHypo-pigmentationRNA干擾的發現雙鏈RNA抑制與其序列同源的基因的表達Andrew Z. FireCraig C. Mello1. 1995年，Su Guo and Kenneth J. Kemphues，線蟲2. 利用反義RNA技術阻斷線蟲par-1基因。在對照實驗中給線蟲注射正義RNA以期 觀察到基因表達的增強。3. 然而

31、，正義RNA和反義RNA都能有效地 抑制基因的表達！4. 沉默效應能在被注射動物及后代中保持，雖然RNA轉錄本在胚胎早期就發生降解RNA干擾：線蟲Young larva (幼蟲)Adult (成蟲)adult body wall at high magnification (高放大倍數的成蟲體壁)Control dsRNAds-gfp RNAGFP-reporter strain PD4251adult body wall at high magnification (高放大倍數的成蟲體壁)No hybridization and staining+ hybridization (endoge

32、nous mex-3 RNA)+antisense+hybridization+ds mex-3 RNA+hybridizationMex-3 RNA干擾RNA干擾1. “RNA Interference”: 注入dsRNA能夠有效地、長期的阻斷基因的表達2. 給線蟲喂食表達GFP dsRNA的細菌，線蟲的GFP表達被抑制 (a)，但存在RNAi缺陷的則不被抑制 (b)3. 之前的正義RNA抑制基因表達現象，可能是由于體外轉錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起植物的免疫系統1. 植物細胞可通過降解病毒RNA 的方式來對抗病毒的入侵，稱為轉錄后沉默 (PTGS)2. 外源基因誘導RNA沉默是植物對抗病毒和轉座子的一個防御系統3. 絕大多數的植物病毒具有單鏈RNA基因組，進入細胞之后從釋放其基因組，由病毒編碼的RNA polymerase產生正義和反義RNA，并形成dsRNA，觸發RNAi機制從而抵制其自身的序列RNA干擾的過程1. 從雙鏈RNA