1、IgA腎病小鼠模型的建立與鑒定【摘要】目的建立小鼠IgA腎病模型，為臨床研究IgA腎病提供實驗根據。方法昆明種小鼠30只，分為正常對照組(10只)、模型組(20只)。采用口服牛血清白蛋白(BSA)結合尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素B(SEB)的方法制作小鼠IgA腎病模型。第12周末搜集新穎尿液，顯微鏡下尿紅細胞定性檢驗;摘眼球取血，檢測血肌酐(Sr)、尿素氮(BUN);光鏡法觀察腎小球系膜細胞及基質變化;電鏡法檢測系膜區有無電子致密物沉積;免疫熒光法觀察系膜區IgA沉積情況。結果第12周末，模型組小鼠均出現不同程度的血尿;Sr、BUN較正常對照組顯著增高(P0.01);光鏡下系膜細胞及基質明顯增生;

2、電鏡下系膜區電子致密物沉積;免疫熒光示系膜區大量的IgA沉積，而正常對照組那么無上述表現。結論IgA腎病小鼠模型效果良好，病理、電鏡及臨床指標與人類IgA腎病臨床病理相似。【關鍵詞】IgA腎病;模型;血尿;免疫熒光;小鼠Abstrat:bjetiveTestablishusedelfIgAnephrpathyinrdertprvideexperientbasisfrthelinialresearhfIgAnephrpathy.ethds30Kuningieererandlyassignedintthentrlgrup(n=10)andthedelgrup(n=20).usedelfIgAnep

3、hrpathyasestablishedbytheethdfralintakefbvineserualbuin(BSA)tgetherithinjetinfstaphylusentertxinB(SEB)viatheaudalvEin.Attheendfthe12eeks,freshurineasgatheredfrthequantitativetestfheaturia;bldastakenthrughrbitalsinusaftereyeballextirpatintdeterinetheserureatinine(Sr)andbldureanitrgen(BUN);thehangesfe

4、sangialellsandatrixinthekidneyserebservedbylightirspy;eletrnirspyaseplyedtdeteteletrn-densedepsitsintheesangialarea;theexpressinfIgAdepsitinaseasuredbyiunfluresenestainingintheesangialarea.ResultsBytheendf12eeks,thereeredifferentdegreesfheaturiaindelgrupie.BUNandSrlevelsindelgruperesignifiantlyhighe

5、rthaninthenralntrlgrup(P0.01).Lightirspyshedevidentprliferatinfesangialellsandatrix.Eletrnirspydenstratedahigheletrndensedepsitinintheesangialarea,hiletheabveabnralitieserentbservedinthenralntrlgrup.nlusinTheusedelfIgAnephrpathyprveseffetive,ithpathlgialeletrnirspiandlinialparaeterssiilartthelinialp

6、athlgyfhuanIgAnephrpathy.Keyrds:IgAnephrpathy;del;heaturia;iunfluresenestaining;ieIgA腎病世界范圍內廣發的一種系膜增生型腎小球腎炎，占原發性腎小球疾病的10%20%，中國、日本、新加坡等發病率較高，其中有20%30%的患者進展到腎衰1。建立與人類臨床病理生理相似的IgA腎病動物模型，對研究IgA腎病的發病機理、臨床治療等具有重要的作用。本實驗采用口服牛血清白蛋白結合尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素的方法制作IgA腎病小鼠模型，為進一步探究IgA腎病提供實驗根據。1材料和方法1.1實驗材料1.1.2主要實驗試劑和設備牛血

7、清白蛋白(BSA,上海明睿生物，產品批號RF101-010);葡萄球菌腸毒素B(SEB,北京博邁世紀生物技術);兔抗小鼠IgA抗體(北京博奧森生物技術，抗體貨號bs-0774R);異硫氰酸熒光素(FIT)-標記的羊抗兔IgG(illiprerpratin);irH340石蠟切片機;光學顯微鏡(日本artn);日本SysexA-1500自動生化分析儀;電鏡(H-600)，切片機(LKBV型)。1.2實驗方法1.2.1酸化水的制備新穎的雙蒸水中參加鹽酸，濃度為8.5l/L。即1000l雙蒸水中參加10%鹽酸3.2l。1%BSA酸化水的制備,1gBSA參加100l酸化水。1.2.2造模方法適應性喂養

8、1周后，取新穎尿液進展顯微鏡下尿紅細胞檢測，均為陰性，將30只小鼠隨機分為正常對照組(10只)、模型組(20只)。正常對照組小鼠自由飲水與飲食;模型組小鼠除自由飲水和飲食外，前5周隔日予BSA(200g/kg)灌胃;第6周起予BSA(20g/kg，500gBSA溶于500l無菌生理鹽水中)尾靜脈注射，每天1次，連續3天;第8周起予SEB(0.5g/kg,1gSEB溶于25l無菌生理鹽水中)尾靜脈注射，每周1次，連續3周，觀察至第12周末。1.2.3IgA腎病小鼠模型的鑒定1.2.3.1血、尿液檢測第12周末留取小鼠新穎尿液，行尿紅細胞定性檢測;經摘眼球取血(待測Sr，BUN)后，處死小鼠，留取

9、右側腎臟分別固定于10%甲醛及戊二醛中，行病理(光鏡和電鏡)及免疫熒光檢查。1.2.3.3電鏡檢查取材,前固定,漂洗,后固定,漂洗,脫水，置換及浸透，包埋及聚合，修塊及切片，染色，電鏡觀察。1.2.3.4免疫熒光小鼠腎組織經10%甲醛固定，石蠟包埋，5切片依次經二甲苯20in,二甲苯20in,95%乙醇5in,95%乙醇5in,雙蒸水5in3次,3%H2210in,PBS5in3次,抗原修復(微波爐中高火5in,低火15in),自然冷卻,PBS5in3次,5%羊血清1h,兔抗小鼠IgA(1100),4過夜,PBS5in3,FIT標記羊抗兔IgG(1100)4過夜,PBS5in3,甘油封片,熒光

10、顯微鏡下觀察攝像。免疫熒光半定量標準:半定量標準參照目前國內通用的5級法(+)分級:：低倍鏡下不能顯示;+：低倍鏡下似乎可見，高倍鏡下可見;+:低倍鏡下可見，高倍鏡下明晰可見;+：低倍鏡下明晰可見，高倍鏡下耀眼;+:高倍鏡下刺眼。1.3統計學處理全部數據采用SPSS13.0醫學統計軟件進展處理，計數資料用s差表示，采用兩獨立樣本t檢驗;等級資料用兩獨立樣本非參數檢驗。P0.01為差異有統計學意義。轉貼于論文聯盟.ll.2結果2.1一般情況造模過程中，正常對照組小鼠無死亡，模型組小鼠先后死亡3只，分析原因可能是灌胃器誤插入氣管，或插入過深導致小鼠食管及胃黏膜損傷。尾靜脈注射SEB后，小鼠出現倦耽

11、少吃少動等現象，2h后恢復正常。2.2血、尿指標檢測12周末，采集新穎尿液光鏡下尿紅細胞計數。結果顯示模型組小鼠明顯高于正常對照組(P0.01)(表1);摘眼球取血，留取血清，檢測血Sr和BUN。結果顯示模型組較正常對照組明顯升高(P0.01)(表2)。表12組小鼠尿紅細胞計數的比擬表22組血BUN和Sr的比與正常對照組比擬：*P0.012.3鏡下構造改變2.3.1光鏡模型組小鼠腎組織主要表現為腎小球毛細血管襻擴張，系膜細胞及基質明顯增生，毛細血管腔局部閉鎖，局部小管擴張;光鏡下正常對照組小鼠腎小球，腎小管，及間質組織形態構造未見異常，系膜細胞及細胞基質未見增多(圖1)。圖112周末，各組小鼠

12、光鏡下腎組織病理變化的比擬(H-E染色，400)A.模型組,腎小球系膜細胞及基質增生,毛細血管腔局部閉鎖，局部小管擴張;B.正常對照組,腎小球系膜細胞及基質未見增生,毛細血管開放良好2.3.2電鏡模型組小鼠腎小球系膜區有大量電子致密物沉積，而正常組小鼠腎小球系膜區無或有少量的電子致密物沉積(圖2)。圖212周末，各組小鼠電鏡下腎組織病理變化的比擬(10000)A.模型組,系膜區大量的電子致密物沉積;B.正常對照組,系膜區無電子致密物沉積2.4免疫熒光檢測12周末，免疫熒光可以看到，系膜區IgA熒光強度大多為+，而正常組系膜區IgA熒光強度為+，差異有統計學意義(表3、圖3)。表32組小鼠腎臟系

13、膜區IgA熒光半定量比擬3討論自Rifai等于1979年首次用BALB/小鼠成功制作IgA腎病模型以來，許多學者基于IgA腎病的發病機制成功復制了許多IgA腎病模型2-6。主要包括:免疫誘導型、繼發病變型、自發病變型。但由于存在種種問題，與人的IgA腎病病理變化差距很大，模型建立的滯后導致對IgA腎病的研究較少，對IgA腎病的治療未獲得新的手段。國內常用的IgA腎病為異種蛋白所誘導的免疫誘導型，即口服牛血清白蛋白(BSA)結合尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素(SEB)。由于局部患者對某些上呼吸道病原體、腸道菌群、食物抗原有較高的血清抗體滴度，認為黏膜免疫在發病中起到一定作用7。故口服免疫原如BSA及靜

14、脈注射葡萄球菌、大腸桿菌、呼吸道病毒等病原微生物成分或免疫復合物常用于誘導主動性IgA腎病模型。BSA口服免疫可使機體IgA抗體的產生，SEB的詳細機制目前還不十清楚確，大多數認為SEB還可破環肝臟網狀內皮系統，引起IgA去除不完全，進而引起免疫復合物在系膜區的沉積。17只模型小鼠熒光證實全部有IgA沉積;光鏡下腎小球系膜細胞和系膜基質增生;電鏡下腎小球系膜區可見大量的高電子密度的致密物沉積;臨床的尿、血檢測隨著腎臟病理變化的加重而逐漸加重，且與正常組比擬差異有統計學意義，說明造模成功。此方法操作簡單，重復性好，成功率高，應該是目前理想的、有研究價值的動物模型，能為進一步研究IgA腎病的發病機

15、制及治療提供根底平臺。【參考文獻】1DnadiJV，GrandeJP.IgAnephrpathyJ.NEnglJed，2002，347(10)：738-748.2BagheriN,PeppleDA，Hassan,etal.DevelpentfiuneplexglerularinjuryJ.LabInvest,2022,85(3):354-363.3JiaQ,PestkaJJ.Rlefylxygenase-2indexynivalenl-induediunglbulinanephrpathyJ.FdheTxil,2022,43(5):721-728.4KyaaA,SharinS,SakuraiH,etal.StaphylusaureusellenvelpeantigenisaneandidatefrtheindutinfIgAnephrpathyJ.KidneyInt,2022,66(1):121-132.5SuzukiS,GejyF,NakatiY,etal.RlefIgA,IgG,andIgantibdiesagainstHaephilusparainfluenzaeantigensinIgAnephrpathyJ.linNephrl,1996,46(5)：287-295.6SharinS,S