1、關(guān)于分光光度法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量第一張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則實(shí)驗(yàn)室安全及防護(hù)實(shí)驗(yàn)室常用玻璃儀器實(shí)驗(yàn)考試第二張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)室規(guī)則提前5分鐘到實(shí)驗(yàn)室，不能遲到、早退、曠課，每遲到、早退一次扣1分，每曠課一次扣5分。禁止在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)吃食品，如有違反者按遲到處理。上課必須穿隔離衣，不能穿拖鞋和吊帶背心，否則禁止進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)期間手機(jī)必須設(shè)置在振動(dòng)上，上課期間如急需接、打電話請(qǐng)到走廊上處理。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)要保持安靜，不得嬉鬧、大聲說(shuō)話。認(rèn)真預(yù)習(xí)認(rèn)真做實(shí)驗(yàn)養(yǎng)成良好的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣（實(shí)驗(yàn)中、實(shí)驗(yàn)結(jié)束后）值日生工作第三張，PPT共三十六頁(yè)，

2、創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)室安全及防護(hù)預(yù)防火災(zāi)預(yù)防中毒外傷第四張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)室常用玻璃儀器吸量管*(示教)試管燒杯量筒第五張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)考試實(shí)驗(yàn)課成績(jī)平時(shí)表現(xiàn) 實(shí)驗(yàn)測(cè)驗(yàn) 原理實(shí)驗(yàn)報(bào)告 -格式 結(jié)果操作考試 分析第六張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)報(bào)告網(wǎng)上提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告采取網(wǎng)上提交的方式，實(shí)驗(yàn)報(bào)告提交時(shí)間設(shè)定為3天，即本次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后第三天晚上12點(diǎn)之前提交，過(guò)期無(wú)法再提交，本次實(shí)驗(yàn)報(bào)告則記為0分。盡早提交報(bào)告，不要等到最后期限，有時(shí)系統(tǒng)不穩(wěn)定，可能提交不上去。直接將報(bào)告粘貼在框中，切記不要以附件方式上傳，否則有可能文件打不

3、開(kāi)，影響成績(jī)。不要相互抄襲，一旦發(fā)現(xiàn)雷同卷則均記為0分。若過(guò)期沒(méi)有提交報(bào)告，不要將報(bào)告發(fā)到老師郵箱，發(fā)也沒(méi)用，最終實(shí)驗(yàn)報(bào)告成績(jī)只記系統(tǒng)導(dǎo)出的成績(jī)。第七張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)一分光光度技術(shù)及蛋白含量測(cè)定第八張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月理論 掌握分光光度技術(shù)的基本原理 了解分光光度計(jì)的基本構(gòu)造實(shí)驗(yàn): 利用分光光度技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定 1.雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 2.考馬斯亮蘭結(jié)合法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 3.紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 第九張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 一、概念 利用物質(zhì)特有的吸收光譜來(lái)鑒別物質(zhì)或測(cè)定其含量的一項(xiàng)技術(shù) 。 應(yīng)用：定性、

4、定量 優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高 精確度高 操作簡(jiǎn)便、快速 分光光度技術(shù)（Spectrophotography）第十張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、工作原理物質(zhì)對(duì)光線有選擇性吸收作用。每種物質(zhì)都具有其特征性的吸收光譜。在一定條件下，物質(zhì)對(duì)光的吸收程度與該物質(zhì) 的濃度成正比。 分光光度法所使用的光譜范圍： 200nm 10m 200400nm 400760nm 76010m 紫外光區(qū) 可見(jiàn)光區(qū) 紅外光區(qū)第十一張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月如何定性？ 利用吸收光譜曲線鑒定化合物 吸收光譜曲線： 以不同波長(zhǎng)的單色光作為入射光，測(cè)定某一溶液的吸光度，以波長(zhǎng)為橫軸，吸光度為縱軸作圖，得到溶

5、液的吸收光譜曲線。 每種物質(zhì)有其特征性的吸收光譜，故可作為定性分析的依據(jù)。 吸 光 度第十二張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 1.朗伯（Lambert）定律 一束單色光通過(guò)一光吸收介質(zhì)時(shí)，其光強(qiáng)度隨吸收光介質(zhì)的厚度增加呈指數(shù)減少。 I1/I0=e-K1l2.比爾（Beer）定律 一束單色光通過(guò)一光吸收介質(zhì)時(shí)，其光強(qiáng)度隨吸收光介質(zhì)的濃度的增加呈指數(shù)減少。 I1/I0=e-K2C I0 :入射光強(qiáng)度； I :透射光強(qiáng)度；l ：介質(zhì)厚度 C ：介質(zhì)濃度如何定量？ Lambert-Beer定律*第十三張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 3.Lambert - Beer定律* 一束單色

6、光通過(guò)某溶液時(shí)，光波被溶液吸收一部分，吸收多少與溶液的濃度和溶液厚度成正比。 A=CL A：吸光度； C：溶液濃度； L：液層厚度 ：即摩爾吸光系數(shù)，指一定波長(zhǎng)時(shí)，溶液的濃度為1 mol/L，光程為 1cm時(shí)的吸光度值 。 *在波長(zhǎng)、溶液和溫度確定的情況下，由物質(zhì)的特性決定的。 第十四張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4.計(jì)算*（1）標(biāo)準(zhǔn)管法（標(biāo)準(zhǔn)比較法） 實(shí)際測(cè)定過(guò)程中，用一已知濃度的測(cè)定物按測(cè)定管同樣處理顯色，讀出吸光度，再根據(jù)前式計(jì)算。 A標(biāo)準(zhǔn)=標(biāo)準(zhǔn)C標(biāo)準(zhǔn)L標(biāo)準(zhǔn) A樣品=樣品C樣品L樣品 A：吸光度； ：摩爾吸光度； C：溶液濃度； L：液層厚度第十五張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于

7、2022年6月 因標(biāo)準(zhǔn)液和樣品液中溶質(zhì)為同一物質(zhì)， 樣品= 標(biāo)準(zhǔn) 因盛標(biāo)準(zhǔn)液和測(cè)定液的比色杯徑長(zhǎng)相同 L樣品=L標(biāo)準(zhǔn) 故上二式可寫(xiě)成： A標(biāo)準(zhǔn)/A樣品= 標(biāo)準(zhǔn)C標(biāo)準(zhǔn)L標(biāo)準(zhǔn)/樣品C樣品L樣品 C樣品=A樣品/A標(biāo)準(zhǔn) C標(biāo)準(zhǔn)第十六張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線法 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制一系列已知不同濃度的測(cè)定物溶液，按測(cè)定管同樣方法處理顯色，分別讀取各管吸光度。以溶液濃度為橫座標(biāo)，吸光度為縱座標(biāo)，在方格座標(biāo)紙上作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。獲取樣品的濃度：根據(jù)測(cè)得樣品的吸光度值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得測(cè)定物的濃度。 濃度吸光度第十七張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月標(biāo)準(zhǔn)曲線使用注意事項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)

8、曲線范圍在測(cè)定濃度的一半到二倍之間。吸光度在0.051.0范圍內(nèi)。所作標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供短期使用。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與測(cè)定管測(cè)定應(yīng)在同一臺(tái)儀器上進(jìn)行，避免誤差產(chǎn)生。第十八張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月5應(yīng)用中注意的問(wèn)題* Lambert-beers law的偏離：該定律只適應(yīng)于一定濃度范圍，A宜在0.051.0之間； 選擇波長(zhǎng)：最大吸收波長(zhǎng)； a.靈敏；b.避免雜質(zhì)干擾 參比溶液（空白管）：消除背景效應(yīng)，應(yīng)包含除待測(cè)溶質(zhì)以外所有的成分。第十九張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 空白管： 測(cè)量過(guò)程中，因比色皿本身和溶劑也會(huì)產(chǎn)生一定的光吸收，故設(shè)置一個(gè)空白管，即其中除了待測(cè)溶質(zhì)以外，其它的

9、成分完全相同。 測(cè)量時(shí)，首先以空白管對(duì)準(zhǔn)光路對(duì)儀器調(diào)零，既消除比色皿本身對(duì)光的吸收，又消除了非待測(cè)物對(duì)光的吸收，所測(cè)值即為待測(cè)物造成的光吸收。第二十張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月分光光度計(jì)(spectrophotometer)一基本部件單色器光源狹縫吸收池檢測(cè)系統(tǒng)、測(cè)量裝置鎢燈氫燈棱鏡光柵比色皿/比色池第二十一張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十二張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 二 、分光光度計(jì)使用步驟（示教） 三、使用時(shí)注意事項(xiàng)* 1. 波長(zhǎng)選擇。 2. 機(jī)器預(yù)熱。 3. 不測(cè)量時(shí)，應(yīng)使樣品室蓋處于開(kāi)啟狀態(tài)，否則會(huì)使光電管疲勞。 4. 不應(yīng)把成有腐蝕性液體

10、的比色皿放在儀器表面。第二十三張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 5. 比色皿使用注意事項(xiàng)* 由于紫外光不能透過(guò)玻璃比色皿，紫外光區(qū)測(cè)量時(shí)要用石英比色皿。 同組使用的比色皿必須配套（規(guī)格、新舊程度一致）。 比色皿有2光面與2毛面，光學(xué)表面對(duì)準(zhǔn)光路，不能有任何污損，否則會(huì)引起光吸收的增加。第二十四張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 比色皿中所盛溶液不能太少，也不能太多，一般所盛液體約占全部容積的2/3。 腐蝕性溶液不得長(zhǎng)期盛放在比色皿中。 每次使用后,應(yīng)立即倒空或以吸液泵吸干，然后用水沖洗比色皿34次。 * 本次實(shí)驗(yàn)，考馬斯亮藍(lán)可使玻璃比色皿著色，酒精浸泡后清洗。第二十五張，PP

11、T共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)定量分析實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)一 雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 （p50） 實(shí)驗(yàn)三 考馬斯亮蘭結(jié)合法測(cè)定蛋白質(zhì)含量（p52） 實(shí)驗(yàn)四 紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 （p53）第二十六張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 實(shí)驗(yàn)一 雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量【基本原理】 蛋白質(zhì)分子中含有許多肽鍵，與雙縮脲結(jié)構(gòu)類(lèi)似，在堿性溶液中能與銅離子結(jié)合成紫色的化合物（稱(chēng)雙縮脲反應(yīng)）。 在一定濃度范圍，顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，故可用比色法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。 含有兩個(gè)以上肽鍵的物質(zhì)才有此反應(yīng)，故氨基酸無(wú)此反應(yīng)。 雙縮脲法的靈敏度為1-20mg。第二十七張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于20

12、22年6月試 劑 （ml） 1 2 3 4 5 6標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0.10.30.50.70.9生理鹽水0.90.70.50.30.11.0雙縮脲試劑4.04.04.04.04.04.0【操作步驟】（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制1. 取小試管6支，編號(hào)按下表操作 2混合后，于37水浴中放置15分鐘，在540nm波長(zhǎng)下比色，以 第6管調(diào)零，測(cè)得各管的吸光度值。以各管的吸光度值為縱 座標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫座標(biāo)，繪成曲線。第二十八張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（二）樣品測(cè)定： 取樣品0.1ml，加生理鹽水0.9m1，再加雙縮脲試劑4m1，于37水浴中放置15分鐘，測(cè)其吸光度，根據(jù)吸光度值查標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)

13、算得出樣品中蛋白質(zhì)的濃度。 注意：雙縮脲法的靈敏度為1-20mg，取蛋白標(biāo)準(zhǔn)液時(shí)注意濃度。實(shí)驗(yàn)時(shí)， 樣品管可與標(biāo)準(zhǔn)管同時(shí)處理第二十九張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月【基本原理】 考馬斯亮蘭G-250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍(lán)色。它和蛋白質(zhì)可通過(guò)范德華力結(jié)合，與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色由紅色轉(zhuǎn)變成藍(lán)色，最大吸收峰從465nm變成595nm，能過(guò)測(cè)定595nm處的光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。 優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，1-5g；測(cè)定速度快；干擾物質(zhì)少。 實(shí)驗(yàn)三 考馬斯亮蘭結(jié)合法測(cè)定蛋白質(zhì)含量第三十張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1取試管3支，編號(hào)按下表操作 試 劑（ml） 空白

14、 標(biāo)準(zhǔn) 標(biāo)本 生理鹽水 0.1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)液(50ugml) 0.1 樣 品 0.1 考馬斯亮藍(lán)試劑 5.0 5.0 5.02.混勻，放置5分鐘，在波長(zhǎng)595nm處，以空白管調(diào)“0”，測(cè)定各管的吸光度。【操作步驟】第三十一張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3. 計(jì)算 A標(biāo)本/A標(biāo)準(zhǔn) 50 （g/ml） = 樣品中蛋白質(zhì)的含量（g/ml） 注意：蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度50 g/ml第三十二張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)四 紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量【基本原理】 由于蛋白質(zhì)分子中含有酪氨酸，色氨酸等芳香族氨基酸，因而蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，吸收高峰在280nm波長(zhǎng)處。由于各種蛋

15、白質(zhì)所含芳香族氨基酸的量相差很少，因此在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)，吸收峰的光密度值與其濃度成正比關(guān)系，可作定量測(cè)定。 靈敏度：50-100g第三十三張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月【操作步驟】（一）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 1.取試管6支，編號(hào)，按下表操作。 試劑（ml） 1 2 3 4 5 6 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0 生理鹽水 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 4.0 混勻，盛于石英杯中，用紫外分光光度計(jì)，以第6管調(diào)“0” ，在280nm波長(zhǎng)下測(cè)定各管光密度，以各管的光密度值為縱座標(biāo)，以蛋白質(zhì)濃度為橫座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。（二）標(biāo)本測(cè)定：取標(biāo)本1.0ml，加入生理鹽水3.0ml，測(cè)A280標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出濃度。第三十四張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月頸椎脫臼處死小鼠，剪開(kāi)腹部，取出肝臟組織