1、實驗7 銅綠假單胞菌的檢測目的要求掌握銅綠假單胞菌檢測的主要步驟與方法。熟悉化妝品標本的采集原則。掌握銅綠假單胞菌菌落的觀察和生化反應結果的判斷。器材和試劑1樣本 可疑化妝品2培養基及試劑 SCDLP液體培養基、普通營養瓊脂平板、血瓊脂平板、麥康凱平板、KIA、十六烷三甲基溴化銨瓊脂培養基、明膠培養基、麥芽糖、木糖微量發酵管、硝酸鹽培養基、枸櫞酸鹽培養基、葡萄糖蛋白胨水、肉湯培養基等。1%鹽酸二甲基對苯二胺（氧化酶試劑）、硝酸鹽還原試劑、吲哚試劑、3%過氧化氫、氯仿、1mol/L的鹽酸3其他 接種環、接種針、載玻片、革蘭染液、香柏油、擦鏡液、生理鹽水。步驟和方法一、樣品的前處理1.親水性樣品（

2、水包油型）：可取10g加到90ml帶玻璃珠的滅菌生理鹽水中，如樣品量少于10ml，仍按10倍稀釋法進行。如為5ml則加45ml滅菌生理鹽水，混勻后，制成1：10稀釋液。2. 疏水性樣品（油包水型）：取樣品10g先加10ml滅菌液體石蠟混勻，再加10ml滅菌的吐溫80，在40-44水中振蕩混勻10min，加入滅菌生理鹽水75ml，在40-44水浴中乳化，制成1：10懸液。或用均質器，將加有助溶劑、稀釋液的樣品放入均質器，均質3-5min后，取上清液待檢（上清液的稀釋倍數為1：10）。3.膏、霜、乳劑半固體狀樣品1）親水性樣品取10g加到90ml帶玻璃珠的滅菌生理鹽水的錐形瓶中，充分振蕩混勻，放3

3、0-32水浴中靜置15min，用其上清液作為1：10的稀釋液。2）疏水性樣品稱取10g，放到滅菌的研缽中，加10ml滅菌液體石蠟，研磨成粘稠狀，再加10ml滅菌吐溫80，研磨待溶解后，加70ml滅菌生理鹽水，在40-44水浴中充分混勻，制成1：10稀釋液。4.固體樣品：取10g加到90ml帶玻璃珠的滅菌生理鹽水的錐形瓶中，充分振蕩混勻，放30-32水浴中靜置15min后取出，充分振蕩混勻，再放到30-32水浴中靜置15min，取上清液作為1：10的稀釋液。如有均質器，上述親水性膏、霜、乳劑等，可稱10g樣品加90ml的滅菌生理鹽水，均質1-2mi；疏水性膏、霜及眉筆、口紅等，稱10g樣品加90

4、mlSCDLP液體培養基，或1g樣品加1ml滅菌液體石蠟、1ml滅菌吐溫80、7ml滅菌生理鹽水，均質3-5min。二、增菌培養：取1：10稀釋樣品10ml加入90mlSCDLP液體培養基中，置37培養18-24h，進行增菌。如有銅綠假單胞菌生長，則培養基表面有一薄層菌膜，培養液呈黃綠色或藍綠色。三、分離培養：從増菌液的菌膜處挑去培養物，劃線接種于普通營養瓊脂平板、麥康凱平板、十六烷三甲基溴化銨平板和血瓊脂平板上，經35孵育18-24h后觀察菌落特征及色素等。本菌為專性需氧菌，在普通營養瓊脂平板上形成圓形、大小不一、邊緣不整齊、扁平、光滑、濕潤而常呈融合狀態的 菌落，瓊脂被染成藍綠色或黃綠色。

5、在血瓊脂平板上形成大而扁平、濕潤、有金屬光澤、有生姜味的 灰綠色或藍綠色菌落，菌落周圍出現的菌落呈有透明的溶血環。在麥康凱平板上形成微小、半透明菌落，48h后菌落中央常呈棕綠色。十六烷三甲基溴化銨平板具有較強的選擇性，大腸埃希氏菌不能生長，革蘭陽性菌生長較差而銅綠假單胞菌則生成無定型扁平菌落，向周邊擴散或略有蔓延、表面濕潤，菌落呈灰白色，菌落周圍培養基常擴散有水溶性色素。四、形態觀察：將可疑菌落進行涂片革蘭染色可見革蘭陰性球桿狀或長絲狀，成雙或成鏈排列。不染色標本動力觀察，運動活躍；鞭毛染色，一端有1-3根紅色的鞭毛。五、生化反應：將上述幾個平板上的可疑菌落接種到各種生化培養基中。1.氧化酶、

6、觸酶試驗、本菌均陽性。2.綠膿菌素提取試驗：本來應該用專門的綠膿菌素培養基提取，但效果不如在十六烷三甲基溴化銨平板上提取，所以采用十六烷三甲基溴化銨平板，具體方法為在十六烷三甲基溴化銨平板中加入3-5ml氯仿，輕輕振搖2分鐘左右，當氯仿提取液呈藍色時，用吸管將氯仿移至另一試管中，并加入1mol/L的鹽酸1ml左右，震蕩片刻后靜止，如上層鹽酸層液內出現粉紅色為陽性，表明有綠膿菌素的存在。3.42生長試驗：挑去純培養物，接種在普通瓊脂斜面培養基上，放41-42培養箱中，培養24-48h。銅綠假單胞菌能生長，為陽性，而近似的熒光假單胞菌則不能生長。4.其他生化反應：銅綠假單胞菌的最后鑒定，主要根據生化反應特征，與嗜麥芽窄食單胞菌的生化區別如下表1。銅綠假單胞菌和嗜麥芽窄食單胞菌主要生化反應結果 KIA 氧化酶 枸櫞酸鹽 硝酸鹽產氮 吲哚 色素 葡萄糖 麥芽糖 木糖細菌 底層 斜面 產氣 H2S銅綠假單胞菌 - - - - + + + - + + - +嗜麥芽窄食單胞菌 - - - - + - - - - + + -檢驗結果報告：被檢樣品經增菌分離培養后，在分離平板上有典型或可疑菌落