1、精選優質文檔-傾情為你奉上精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業專心-專注-專業精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業PCR添加劑是PCR反應中的一種增效劑，它們在PCR反應中起到提高PCR反應的特異性、增加PCR擴增的產量及防止無效擴增等有益效果。由于PCR技術在有些情況下擴增的不完美性，從PCR技術發明的初期開始，人們就展開了對PCR反應中添加其它化學物質的研究。迄今為止，在PCR添加劑的研究領域，人們已經發現了越來越多的PCR添加劑，它們都以各自的特性在不同的方面對PCR反應起著促進作用。而隨著PCR添加劑研究的不斷發展，在各種相關研究中，人們逐漸從研究和應用單一型PCR添加劑轉

2、向研究和應用復合型PCR添加劑，從傳統PCR添加劑的研究開發轉向新材料新化合物PCR添加劑的研究開發。傳統的PCR添加劑包括常見的助溶劑、離子化和非離子化的除垢劑以及一些諸如氯化四甲基銨（TMAC）、甜菜堿、SSB等。多年來人們對這些添加劑的研究表明，它們在一定的濃度范圍內對某些PCR有著增效作用，但在另外一些情況下或在其它的濃度范圍內對PCR反應又有著抑制作用，所以這些PCR添加劑的在不同反應體系中的應用應通過試驗來調整和合理選擇，合理準確的使用會使PCR反應獲得很大的改善，從而得到試驗所需要的理想結果。甜菜堿是一種高效的甲基受體，它在一些細菌體內對抵抗因鹽份引起的滲透壓升高起著重要的作用，

3、其做為一種PCR添加劑，出現在Rees.W.A.22等人對甜菜堿降低DNA 的Tm所做的研究之后。甜菜堿廣泛存在于多種酶以及PCR試劑盒中，它能提高PCR擴增的效率和特異性，特別是在長PCR（Long-PCR）擴增時常被應用23。Barnes23指出，在LongPCR中添加甜菜堿能夠使每個循環的熱變性溫度下降到9293，且退火溫度也可以下降12，從而補償因退火條件變化及因其它添加劑引起的酶穩定性下降引起的PCR反應的負面效果。另外，他還指出甜菜堿不僅能促進高GC含量片段的擴增，而且能提高普通的PCR擴增的目的產物量24。甜菜堿另外一個優點是，作為一種滲透保護劑，它具有和牛血清白蛋白（BSA）類

4、似的功能，能夠防止聚合酶的變性24。把LongPCR Buffer中的BSA換成甜菜堿將有利于減少彌散問題的發生。甜菜堿也有可以克服DNA少量污染帶來的擴增困難，這意味著PCR反應可以在低質量模板存在的情況下進行25。氯化四甲基銨（TMAC）最早被用于在雜交反應中減少DNARNA的錯配以提高特異性26，在PCR反應中，它能夠增加PCR反應的效率和提高PCR反應的特異性。在Ted Hung等人27首次發現TMAC提高PCR反應特異性的研究中，他們選擇了兩個mouse cDNA的基因片段進行擴增實驗。結果顯示，含有110-5110-4 M TMAC的實驗組擴增結果在電泳圖上只出現一條單一的目的條帶

5、，而未含有TMAC的實驗組特異性非常差，有多條非目的條帶出現。Eric Chevet等人28在研究中還發現，通過添加TMAC可以提高AT含量豐富的DNA片段的Tm，從而通過改善引物的特異性結合來提高PCR反應的特異性。在研究中，他們實驗了不同濃度的TMAC促進PCR反應的效果，發現TMAC的最佳添加濃度為60mM。他們的研究還表明，TMAC不僅可以提高PCR反應的特異性，而且可以提高PCR反應的效率，三對引物的擴增實驗均發現添加TMAC可以提高PCR目的產物產量510倍。單鏈結合蛋白（SSB）是活的生物體中不可缺少的重要物質，它非特異性的和單鏈DNA結合，參與所有涉及到單鏈DNA的諸如復制，修

6、復及重組等過程29。這種體內DNA復制過程中SSB所起到的重要作用，自然引起了人們對SSB在PCR這一體外DNA 復制技術中應用的可行性考慮。Rapley等人30在1994年首次就SSB在PCR中的應用做了專門研究。他們研究發現T4噬菌體基因32編碼蛋白及大腸桿菌單鏈結合蛋白對數種模板的PCR反應均有提高效率的作用。由于PCR反應是一個不斷的熱循環過程，因此嗜熱源SSB是PCR添加劑的理想來源，這一點在近年來的研究中得到了證實。Dbrowski等12就曾克隆Thermus aquaticus 和 T.thermophilus的SSB編碼基因并讓它們在E. coli中過表達，隨后進行的Taq S

7、SB及Th SSB在PCR中的添加實驗表明它們均能很好的提高PCR反應效率。之后不久，Perales等人13表達純化了三種類型ThSSB，在Th聚合酶和Pfu聚合酶的PCR體系中所做的實驗發現ThSSB可以使PCR延伸的時間減半，而且在無校正功能的Th聚合酶PCR體系中的實驗進一步表明ThSSB可以增加PCR反應的保真度。而Olszewski等人14在multiplex PCR 實驗中對TaqSSB的研究發現其可以防止或減少引物二聚體的形成，從而有效提高PCR反應的效率和特異性。甲酰胺（Formamide）是被較早發現并廣泛應用的PCR添加劑之一，它能顯著性的提高PCR反應的特異性8。為了開發

8、新的更高效的PCR增效劑，Raj Charabarti等人31對與甲酰胺結構類似的低分子量的胺類化合物在PCR中的應用做了專門的研究。在Raj Charabarti等人的研究中，包括甲酰胺在內的與甲酰胺結構類似的共四大類10種低分子量胺類化合物做了PCR反應添加實驗。實驗結果表明，acetamide對中等GC含量的片段擴增有非常好的效果，而對高GC含量的片段卻并不是這樣；2-pyrolidone對多數基因片段都有特別好的增強擴增的效果，特別是在高GC含量的擴增中表現出很好的效果。DMSO是也是一種較早被發現的且廣泛應用的PCR增效劑。P.R.Winship5、B.Bachmann32等較早對D

9、MSO在PCR產物測序中能有效降低DNA鏈的復性做過報道，隨后D. Pomp33，G. Sarkar8, Filichkin.S.A.34及Sun Y35等人對DMSO在PCR中的應用做了進一步的研究，雖然他們的報道中都指出DMSO能夠全部或部分的提高PCR反應的特異性，但各自報道的有效作用濃度都有很大差別，添加量從0.9到15不等，過高濃度的DMSO均能抑制PCR反應。肖志壯36等人就過量DMSO抑制PCR反應及降低PCR擴增的特異性的現象在所實驗的PCR模型上做過專門的研究并提出了應對的策略，他們的研究表明，在10 %DMSO 的反應體系中，引物濃度為7. 5 10 - 7mol/ L 時

10、，模板濃度提高到1. 610 - 10mol/ L即可完全避免非特異擴增。值得注意的是，10 %DMSO存在時，如果引物濃度降低至7. 5 10 - 8mol/ L，則看不到特異產物，也就是說，反應體系含DMSO時，需增加引物濃度，保證PCR特異擴增。因此，DMSO用于PCR時一定要注意平衡模板、引物及DMSO的濃度，這一點值得我們在應用DMSO的PCR實驗中加以注意。鑒于DMSO在優化PCR反應中所起的效果且同樣為了開發新的更高效的PCR添加劑，Raj Charabarti等人37還對其它幾種水溶性亞砜類化合物在PCR中的應用做了相應的研究，以期判斷它們是否也具有同樣的優化PCR反應的效果。

11、在實驗中，他們選用了三種高GC模板PCR模型，就DMSO、methyl sec-butyl sulfoxide, n-propyl sulfoxide, n-butyl sulfoxide, and tetramethylene sulfoxide 等五種亞砜類化合物優化PCR反應的分別做了測試。在這五種測試的亞砜類化合物中，methyl sec-butyl sulfoxide為唯一一種分子結構呈不對稱性的化合物，tetramethylene sulfoxide為唯一一種分子結構含環形功能團的化合物。在三種高GC模板模型中，牛腦GTP cDNA（660bp, 58%GC）模板為主要受測模型，所

12、有五種亞砜類化合物首先在這個模型上進行測試。結果表明，除添加n-butyl sulfoxide的實驗組未出現任何目的產物外，其它四種被測化合物均有表現出很強的提高PCR反應特異性的效果，且對應得到目的產物均有很高的產量。具體效果效果為：tetramethylene sulfoxide為效果最佳，methyl sec-butyl sulfoxide次之，接下來是n-propyl sulfoxide，DMSO以其只能獲得所有產物中89的特異性產物而居最后。在產量上，添加tetramethylene sulfoxide，methyl sec-butyl sulfoxide及n-propyl sulf

13、oxide后的實驗組為添加DMSO實驗組的23倍多。而在接下的來實驗中，對剩下四種化合物，同樣以牛腦GTP cDNA（660bp, 58%GC）模板為模型實驗了的各種化合物的有效作用濃度范圍，實驗結果表明，tetramethylene sulfoxide的有效作用濃度范圍為：0.281.0M，methyl sec-butyl sulfoxide的有效作用濃度范圍為：0.030.31M，n-propyl sulfoxide的有效作用濃度范圍為：0.150.36M，DMSO的有效作用濃度范圍為：0.751.25M。在996bp人骨髓白細胞c-jun cDNA ( 64%GC)模型上所做的進一步測試

14、表明，變性溫度為95時，tetramethylene sulfoxide相比于DMSO有較好的作用效果，而propyl sulfoxide相比于DMSO則效果較差；變性溫度為92時，tetramethylene sulfoxide則為唯一有效的添加劑。而在511bp人PSM cDNA(52%GC, 158bp 73% GC 片段)模型上的測試再一次證明tetramethylene sulfoxide為最有效的添加劑，DMSO次之，propyl sulfoxide居最后。和作者稍早前基于相同的出發點對系列砜類化合物作為PCR添加劑所做研究的結果對比分析可知38，雖然methyl sulfone比

15、DMSO的效果稍好，但亞砜類化合物總體來說作用效果要好于砜類化合物。作者進一步的比較分析指出，這種在PCR反應中不同亞砜類化合物間所表現出的不同效果是有一定的化學式上的結構依賴性的，同比來說環狀結構的砜類、亞砜類及胺類化合物作用效果明顯優于其它結構的化合物。有研究者認為DMSO提高PCR反應的特異性是由于其于模板DNA的大溝和小溝結合并破壞其雙鏈結構，在這里，作者認為環狀結構化合物的獨特作用效果可能是由于其破壞了模板DNA大溝和小溝里帶有供體和受體互補氫鍵的理想構象，也有可能其通過限制DNA鏈的自由旋轉而使得DNA骨架的相鄰基團間位間排斥減小。新型高效是以上從結構類似化合物中篩選新PCR添加劑

16、的出發點，近年來，復合型PCR添加劑的開發更是朝這各目標又邁進了一步。所謂的復合型添加劑就是把兩種或兩種以上的PCR添加劑通過一定的比例混合在一起形成的新型PCR添加劑，和單一PCR添加劑相比，其促進PCR的效率更高。N. Baskaran 等人39的報道中，實驗了四種不同的片段的PCR，其中兩個高GC片段（64和80），兩個非高GC片段（44和52）。當在同一個體系中同時擴增四個片段時，實驗表明1.0M的甜菜堿結合68DMSO及5DMSO結合1.21.8M的甜菜堿能很好的同時擴增出四種目的片段，雖然高濃度的DMSO及高濃度的甜菜堿在也能擴增出某種或某幾種片段，但四種目的片段的產量均衡性比不上

17、甜菜堿和DMSO組成的復合型添加劑。最近，J. Kang等人7在隨機序列DNA文庫的同步PCR擴增試驗中也同樣發現1M的甜菜堿結合5DMSO能改善PCR擴增的效果。相比于以上兩種PCR添加劑組成的簡單復合型添加劑，M. Ralser等人40及M. Musso等人41則相繼報道了三種以上PCR添加劑組成的復合型添加劑。Markus Ralser等人對其混合配置形成的含有甜菜堿，DMSO，DTT及BSA四種物質的復合型添加劑在12對引物(GC含量6175)擴增實驗中進行了測試，結果發現最佳的復合型添加劑配比如下（30ul體系中終濃度）：0.54M甜菜堿、1.34MDTT、1.34DMSO及11ug

18、/mlBSA。在這一最佳配比下可以獲得最好的PCR擴增特異性和最高的PCR擴增產量。他們的實驗結果還表明，這種配比的PCR增效劑同比于Qiagen，Invitrogen及Bioline等品牌的商品化PCR增效劑在PCR增效效果上是相當，而且和各種不同的DNA聚合酶及各種不同的模板均具有很好的兼容性。稍后，M. Musso等人應用1.3M甜菜堿，50uM 7-deaza-dGTP及5DMSO混合而成的復合型添加劑高產量擴增了GC含量為79的長度為392bp的DNA片段，接下來在另外兩段DNA片段（GC含量為67.8和72.7）的擴增中這種復合型PCR添加劑同樣能幫助獲得高特異性的擴增產物。近年來

19、，和復合型PCR添加劑一樣，新化合物及新材料PCR添加劑的研究開發是PCR添加劑研究的新方向。海藻糖、homoectoine、Zn2+1,7-bis(4-quinolylmethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane (Zn2+Q2-cyclen)、單壁碳納米管（SWNTs）及納米金膠體等數種新PCR添加劑被人們研究和發現。這其中，納米材料的應用具有重要的意義，它開辟了PCR添加劑研究的新天地。海藻糖是一種一種非還原性二糖，是由兩個分子的D-葡萄糖單元通過,-1,1糖苷鍵連接而成。和甜菜堿的效果類似，它能夠幫助有機體抵抗干燥，脫水，熱，冷和氧化等外在因素的干擾。海

20、藻糖最早見于cDNA合成反應中的應用，在反應中其能顯著的提高酶的熱穩定性42。A. N. Spiess等43報道過其在PCR反應中的應用，他們的研究指出海藻糖能很好的促進高GC含量片段的擴增。在由Real-Time PCR儀器軟件所給出的曲線圖上，清楚的顯示出在一定的濃度范圍內隨著海藻糖濃度的增加PCR反應效率也不斷增加。僅當海藻糖的濃度大于0.6M時PCR的反應效率才有所下降。為了說明海藻糖對Taq酶的熱穩定性的影響，在Taq酶進入PCR反應前，他們在95下對含有0.2M的海藻糖及不含海藻糖的Taq酶進行了30分鐘和90分鐘的保溫實驗。保溫是在標準的PCR反應的Buffer中進行的，這樣可以

21、保證和真實PCR反應的環境相一致。在接下來的實驗中，用這種保溫后的Taq酶進行PCR擴增。結果顯示，添加海藻糖的Taq酶在保溫30分鐘后同比于未添加海藻糖的Taq酶其熱穩定性只有微弱的增加，但是在保溫90分鐘后同比卻有很大的增加。在文中，作者還比較了海藻糖和甜菜堿的效果，結果表明一定濃度的甜菜堿雖然具有和海藻糖相似的增加PCR反應效率的效果，但海藻糖的有效作用濃度范圍比甜菜堿要大，這就說明海藻糖在應用上比甜菜堿會更方便。Homoectoine是一種由L-ectoine衍生合成而得到的一種新化合物M. Schnoor等人44在比較了Betain(甜菜堿)，-hydroxyectoine，L-ec

22、toine及homoectoine等四種化合物后發現homoectoine降低DNA Tm值的效果是所有四種物質中最強的。在隨后的PCR反應添加實驗中，他們發現相比于甜菜堿更低濃度的homoectoine就能達到和甜菜堿相似的特異性擴增效果。Zn2+cyclen（cyclen= 1,4,7,10-tetraazacyclododecane）是一種大環四胺鋅復合物，有研究發現，當溶液中解離常數為0.3mM、pH為8.0時能選擇性的和dT結合45。因而當大環四胺鋅復合物與雙鏈DNA結合時，其與dT的選擇性結合可以削弱A-T堿基對間的氫鍵，從而引起了DNA的Tm值的下降。Zn2+Q2-cyclen是

23、Zn2+cyclen的衍生物，E.Kituta等人46發現由于其在喹啉環和nucleobase之間多出了兩個-鍵的堆積作用，從而和dT的結合比Zn2+cyclen要更緊密（Kd10uM，pH8.0）。他們小組的E. Kinoshita等人47在后來的進一步研究中發現，對于完全配對的短寡核苷酸雙鏈（homoduplex）和不完全配對（一個堿基錯配）的寡核苷酸雙鏈（heteroduplex），Zn2+Q2-cyclen降低heteroduplex的Tm值能力更強，數據顯示在Zn2+Q2-cyclen濃度超過5uM時heteroduplex的Tm變得幾乎很難測量到。文中的數據還顯示，這種獨特的降低T

24、m值的現象在其它幾種常見的具有降低Tm值特性的PCR添加劑中卻沒有觀察到。這個結果提示我們，Zn2+Q2-cyclen具有防止引物錯配的明顯優點，因此也就可以用來在低效PCR的擴增中提高特異性。他們就這個問題在同一篇報道中做了相應的研究，結果表明以基因組DNA及cDNA文庫為模板進行的PCR擴增中均能看到Zn2+Q2-cyclen提高PCR特異性的效果，而最佳的Zn2+Q2-cyclen添加濃度是和體系中的模板DNA及引物的量是相關的。碳納米管（CNTs）又稱納米碳管，是一種新型的納米材料，它是由日本科學家于1991年首先發現48。按其壁包含碳原子層的多少可以分為單壁碳管（SWNTs），雙壁碳

25、管（DWNTs）及多壁碳管（MWNTs）。CNTs的直徑為幾個納米到幾十個納米不等。碳納米管的應用領域十分廣泛，具有巨大的商業價值：其高強度的特性使它可以作為超細高強度纖維，也可作為復合增強材料；其獨特的電學性能，使其可用于多種半導體器件，如場效應晶體管、二極管、邏輯電路等，甚至大規模集成電路49。在生物技術領域，碳納米管可作為納米藥物載體，亦可見作為納米生物傳感器得到應用50,51。迄今為止，碳納米管做為添加劑在PCR中的應用僅見一篇文獻報道。D. Cui等人52的對SWNTs做為PCR添加劑的研究表明，在濃度低于3g/ul時隨SWNTs濃度的增加PCR產物的產量逐漸提高，但當濃度大于3g/

26、ul時產量卻受到抑制。PCR體系不含Mg2+時也同樣觀察到相似的結果。膠體金做為PCR添加劑，由上海交通大學H. Li等人15首先發現并在Angew. Chem. Int. Ed.上進行了報道，他們發現直徑為10nm的納米金顆粒在一定濃度范圍內能顯著提高PCR反應的特異性。結果顯示在添加金納米顆粒后，電泳圖上與目的片段DNA相對應的地方僅出現一條顯著性的條帶，而未添加金納米顆粒的電泳圖上則顯示明顯的拖尾現象。在進一步對濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8及1.0nM的納米顆粒添加后所得產物的電泳圖進行比較后得出，從0.2nM依次到0.8nM，PCR反應的特異性逐漸提高，但當反應體系中存在過

27、多的金納米顆粒（1.0nM）時，PCR反應會被有力地抑制，產物的量明顯降低。他們還對比研究了分別在25，30，35，40下退火時添加金納米顆粒前后產物的電泳圖，結果顯示，同一溫度下，金納米顆粒添加前后圖譜中條帶形成了鮮明地對比，即使在25的較低溫度下退火，添加金納米顆粒后都顯示出了非常好的特異性。之后不久，與Haikuo Li等人發現膠體金顯著提高PCR特異性不同，臺灣的研究人員Min Li等人16則發現膠體金具有提高PCR反應靈敏度的特性。他們在研究中發現，在保證相同或更高的擴增產量的情況下，添加直徑為7nm13nm的納米金顆粒可以使PCR反應的時間縮短。通過不同的PCR系統、不同的DNA聚

28、合酶及不同的模DNA的PCR添加實驗后發現，對于慢速PCR儀通過添加納米金顆粒可以提高PCR靈敏度510倍，而在快速PCR儀上這一數值可以提高到104。從以上的報道可以知道，納米材料做為新型的PCR增效劑不僅可以增加PCR特異性和效率，而且可以提高PCR反應的靈敏度。這是迄今為止其它類型的PCR所無法比擬的。非離子性洗滌劑，例如0.1-1% 的Triton X-100, Tween 20 或是NP-40，通常可以降低DNA二級結構。雖然這樣可以增加模板基因的擴增，但也會帶來非特異性擴增的困擾。所以，這些添加劑對無雜物低產量的PCR反應很管用，但對相對不太純的PRC反應就沒那么好了。非離子性洗滌劑的另外一個好處就是可以減少SDS 污染。通常在DNA提取過程中，SDS會被帶到PC