1、中山大學藥學院 歐田苗SUPERHELIX (supercoiling)2013.11.131Topoisomer：具有相同一級結(jié)構(gòu)，但兩鏈相互纏繞次數(shù)不同的兩個環(huán)狀或線性DNA。2負超螺旋：underwinding；正超螺旋：overwinding。3Lk: DNA鏈間盤繞數(shù), = Tw + WrTw：DNA鏈繞軸數(shù) (helical turn number)，當超螺旋盤繞未發(fā)生時，Lk=Tw；當超螺旋盤繞成右手螺旋時，T；左手螺旋則T。Wr：超螺旋數(shù)，指雙螺旋DNA自身盤繞數(shù)。Wr0，左手螺旋4負超螺旋：W0。5Topoisomerase I：剪切單鏈，Lk，因此正超螺旋程度Topoiso

2、merase II：剪切雙鏈，松散負和正超螺旋；原核生物中的Top II（gyrase）可以進一步誘導負超螺旋生成。KEYPOINTSEnzymes involved in DNA replication2013.11.13DNA polymeraseDNA ligaseDNA primaseDNA topoisomeraseDNA helicaseSingle strand binding protein (SSB)DNA replication2013.11.132013.11.153. DNA的損傷與修復 某些物理化學因素，如化學誘變劑、紫外線和電離輻射等都可以引起基因突變和細胞凋亡，其

3、化學本質(zhì)是這些物理化學因素直接作用于DNA，造成其DNA結(jié)構(gòu)和功能的破壞，稱為DNA損傷。生物體具有一系列起修復作用的酶系統(tǒng)，可以消除DNA損傷，恢復DNA的正常結(jié)構(gòu)。3. DNA的損傷與修復 目前已知有多種修復系統(tǒng)：直接修復（direct reversal repair）核苷酸切除修復（nucleotide excision repair）堿基切除修復（base excision repair）錯配修復（mismatch repair）2013.11.152013.11.15direct reversal repairDNA photolyasesphotoreactivationNucle

4、otide excision repair2013.11.15base excision repair2013.11.15mismatch repair4. RNA指導下的DNA合成 以RNA為模板，按照RNA的核苷酸順序合成 DNA逆轉(zhuǎn)錄 (reverse transcription ) 與通常轉(zhuǎn)錄過程中遺傳信息傳遞方向(DNARNA) 相反的轉(zhuǎn)錄過程。逆轉(zhuǎn)錄酶 (reverse transcriptase) 催化逆轉(zhuǎn)錄反應，即RNA指導的 DNA 聚合酶。所有已知的致癌RNA病毒都含有逆轉(zhuǎn)錄酶，因此被稱為逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus）。2013.11.152013.11.15逆轉(zhuǎn)錄與逆

5、轉(zhuǎn)錄病毒 逆轉(zhuǎn)錄病毒在感染期間：逆轉(zhuǎn)錄酶具有RNA降解活性和DNA聚合酶活性。逆轉(zhuǎn)錄酶同樣以四種dNTP為底物，需要Mg2+，Mn2+作輔助因子，并要求有模板和引物的存在。逆轉(zhuǎn)錄與癌變和艾滋病 RNADNA病毒cDNA與宿主DNA整合潛伏于宿主后代中逆轉(zhuǎn)錄酶作用示意圖2013.11.15（三）DNA指導下的RNA合成 細胞內(nèi)的各種RNA都是以DNA為模板，在RNA聚合酶催化下合成的，此過程稱為轉(zhuǎn)錄。最初轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物通常需要一系列斷裂、拼接、修飾和改造才能成為成熟的 RNA分子。 DNAmRNA、tRNA and rRNARNA聚合酶2013.11.15DNA雙鏈中僅有一條鏈可用以轉(zhuǎn)錄，稱為

6、模板鏈或非編碼鏈或反義鏈（template or noncoding or antisense strand）。而另一條鏈稱為編碼鏈或有義鏈（coding or sense strand）。轉(zhuǎn)錄過程中所生成的RNA分子是DNA編碼鏈的拷貝，唯一不同的是DNA編碼鏈中的T在mRNA鏈中是U。模板鏈與編碼鏈 2013.11.15DNA啟動子（promoter）：指RNA聚合酶識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。DNA終止子（terminator）：提供轉(zhuǎn)錄停止信號的 DNA序列。 啟動子與終止子 2013.11.151. RNA合成 以大腸桿菌RNA合成為例，RNA合成主要涉及起始，延伸和終止三

7、個過程。2013.11.152. RNA的轉(zhuǎn)錄后加工 在細胞內(nèi)，轉(zhuǎn)錄過程中合成的RNA鏈一般需要經(jīng)過一系列的變化，包括鏈的斷裂和化學修飾等過程，才能轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓膍RNA、tRNA和rRNA。此過程過程稱為RNA的成熟，或稱為轉(zhuǎn)錄后加工（post-transcriptional processing）。 2013.11.15rRNA的加工2013.11.15tRNA的加工2013.11.152013.11.15（四）蛋白質(zhì)的生物合成 1944，薛定諤在中提出： 基因就是遺傳信息的攜帶者，而基因攜帶遺傳信息的可能方式就如同電報密碼一樣，由少量幾個符號的一定的組合方式，亦即編碼來表達遺傳信息。1.

8、遺傳密碼（1）遺傳密碼（Genetic Code）概念的提出1953, Watson和Crick提出: DNA中的四個堿基就是薛定諤所提到的”電報密碼”。1954，Gamove提出: DNA中的堿基可以為20種基本氨基酸編碼。遺傳密碼： 就是代表DNA遺傳信息的mRNA中一定順序排列的寡聚核苷酸（即堿基順序）。（1）遺傳密碼概念的提出2013.11.152013.11.15How could the genetic information encoded in the 4-letter language of nucleic acids be translated into the 20-le

9、tter language of proteins? A small nucleic acid (perhaps RNA) could serve the role of an adaptor（適配器）, one part of the adaptor molecule binding a specific amino acid and another part recognizing the nucleotide sequence encoding that amino acid in an mRNA.Cricks Adaptor Hypothesis2013.11.15你怎樣用mRNA中4

10、種不同的堿基（A, G, C, U）為20種氨基酸編碼呢？分析：密碼堿基數(shù)編碼數(shù)編碼氨基酸數(shù)合理性144X21616X36420結(jié)論：三個堿基組成的編碼有可能符合為 20個氨基酸編碼的要求。（2） 密碼子中的堿基數(shù)目（四）蛋白質(zhì)的生物合成 密碼子（Codon）：指mRNA中由三個堿基組成的編碼，也稱三聯(lián)體密碼（Codon triplet）。1960年前后，年輕的美國生物學家Nirenberg等人建立了兩種重要的方法。（3）遺傳密碼的破釋2013.11.151. 遺傳密碼方法1：應用多核苷酸磷酸化酶合成多聚核苷酸多核苷酸磷酸化酶可作為蛋白質(zhì)合成的模板nRDP RNA + Pi（3）遺傳密碼的破釋

11、2013.11.15方法2： 建立了無細胞蛋白質(zhì)合成體系 Cell-free protein-synthesizing system, CFPSSE. Coli細胞細胞壁，膜，DNA, RNA, ribosome, 酶等破碎離心分離DNA, RNA, ribosome，酶核酸酶水解原有DNA, RNACSPSS人工合成（天然）mRNA按加入的mRNA為模板合成的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)2013.11.151961年, Nirenberg等人發(fā)現(xiàn)： polyUpolyPhe polyApolyLys polyCpolyPro1964年, Nirenberg首先確定與已知核苷酸三聚體結(jié)合的tRNA上連接

12、的是哪那一種氨基酸。該實驗對于幾種密碼編碼同一個氨基酸提供了直接的、最好的證據(jù)。Jones,Khorana等人用有機化學和酶法制備的已知核苷酸重復序列為模板，通過CFPSS進行蛋白質(zhì)合成，發(fā)現(xiàn)可以生成三種重復的多肽鏈。證明三聯(lián)體密碼的三個著名實驗2013.11.15證明三聯(lián)體密碼的三個著名實驗示意圖 2013.11.15（四）蛋白質(zhì)的生物合成 （4） 遺傳密碼的特點遺傳密碼的通用性密碼子不可彼此交蓋（少數(shù)病毒例外）遺傳密碼沒有標點符號遺傳密碼具有簡并性：Trp和Met只有一個密碼子密碼的防錯系統(tǒng)： - 密碼的頭兩個核苷酸殘基就可以確定一個氨基酸 - 類似序列的密碼往往指定化學性質(zhì)類似的氨基酸

13、64個密碼中有61個密碼編碼氨基酸，其中一個起始密碼子（AUG），三個是終止密碼子（UAA, UAG, UGA）2013.11.151. 遺傳密碼2013.11.15蛋白質(zhì)生物合成的真正模板是mRNA。mRNA 分子的堿基順序即表示了所合成蛋白質(zhì)的氨基酸順序。蛋白質(zhì)的合成過程相當復雜，整個過程涉及到三種 RNA（mRNA、tRNA和rRNA），幾種核苷酸（ATP，GTP）以及一系列酶、蛋白質(zhì)、輔助因子等的參與。 2. 蛋白質(zhì)的生物合成過程 2013.11.15（四）蛋白質(zhì)的生物合成 tRNA的結(jié)構(gòu)2013.11.15密碼子與反密碼子配對的“擺動”性 1966年，Crick提出：密碼子與反密碼子

14、中的3和中間的堿基形成Watson-Crick堿基配對，而反密碼子的5位容許其它類型的堿基配對。Crick將5位的這種變通性稱之“擺動”（wobble）。位于反密碼子5（擺動）位的核苷酸 位于密碼子的3位的核苷酸ACGUIUGU或CG或AU，C或A 2013.11.152013.11.15氨酰-tRNA的合成 tRNA在氨酰-tRNA 合成酶的幫助下，能夠識別相應的氨基酸，形成氨酰-tRNA。氨酰-tRNA的形成是一個兩步反應過程：氨基酸的活化 氨基酸ATP 氨基酸-AMPPPi 氨基酰-tRNA的形成 氨基酸-AMPtRNA = 氨酰-tRNAAMP 每一種氨基酸至少有一種對應的氨酰-tRN

15、A合成酶。它既催化氨基酸與 ATP 的作用, 也催化氨基酰基轉(zhuǎn)移到 tRNA。氨酰-tRNA的合成 AMP2013.11.15除原核生物外，所有其他生物的蛋白質(zhì)的翻譯開始于Met-tRNA原核細胞的蛋白質(zhì)合成以N-甲酰甲硫氨酰-tRNA (fMet-tRNA,tRNAifMet)形式作為肽合成的起始物。肽合成完成后，有專一性的酶將 fMet 或 Met 從肽鏈的 N 端切除。2013.11.15起始tRNAFive stages of protein synthesisStage 1: Aminoacyl-tRNA Synthetases Attach the Correct Amino Ac

16、ids to Their tRNAs (活化)Stage 2: A Specific Amino Acid Initiates Protein Synthesis (起始)Stage 3: Peptide Bonds Are Formed in the Elongation Stage (延伸)Stage 4: Termination of Polypeptide Synthesis Requires a Special Signal (終止)Stage 5: Newly Synthesized Polypeptide Chains Undergo Folding and Posttransl

17、ational Processing（折疊及后翻譯過程）2013.11.155353NC1. 起始2. 延伸2013.11.15蛋白質(zhì)的生物合成過程53NCNC532. 延伸3. 終止2013.11.15蛋白質(zhì)的生物合成過程Ribosome 70S in bacteriaFormation of the initiation complex（70S） in bacteriaFirst elongation step in bacteria2013.11.15Second elongation step in bacteria2013.11.152013.11.15Third elongatio

18、n step in bacteria（五） 遺傳變異遺傳變異（Mutation） DNA結(jié)構(gòu)的改變將導致相應蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)（氨基酸順序）的變化，從而引起生物特征或性狀發(fā)生變異，這種現(xiàn)象稱為遺傳變異，又稱基因突變。一切生物的變異和進化都可以認為是由于DNA結(jié)構(gòu)的改變而引起蛋白質(zhì)組成和性質(zhì)變化的結(jié)果。2013.11.152013.11.151. 突變的類型同型堿基間的轉(zhuǎn)換（transition） 可自發(fā)產(chǎn)生，或人工誘變異型堿基間的顛換（transversion） 可自發(fā)產(chǎn)生，或人工誘變移碼突變（frameshift ） 包括插入（insertion）或缺失（deletion），一般由人工誘變引起安

19、全變異（silent mutation）：缺損變異（leaky mutation）： 致死變異（lethal mutation）： 2013.11.15自然環(huán)境的長期影響遺傳誤差物理因素化學因素2. 引起基因突變的因素誘變劑（mutagen）：能提高突變率的物理或化學因子。原癌基因或抑癌基因致癌劑或腫瘤病毒癌基因或失調(diào)抑癌基因調(diào)節(jié)正常細胞分裂調(diào)節(jié)功能喪失許多誘變劑是致癌物質(zhì)（致癌劑：carcinogen）(1) 遺傳誤差DNA復制、轉(zhuǎn)錄引起的差錯tRNA在翻譯mRNA信息時出現(xiàn)的差錯DNA分子中堿基互變異構(gòu)會導致差錯 DNA分子的堿基，存在酮式烯醇式或氨式亞胺式互變異構(gòu)。不同的互變異構(gòu)體形成氫

20、鍵的方向和能力不同，有可能導致復制時出現(xiàn)錯誤。 例如：在正常情況下，A（氨式結(jié)構(gòu)）與T（酮式結(jié)構(gòu)）配對；當A以亞胺式存在時（幾率非常小），則與C配對。出錯率：1/3000-40002013.11.152013.11.15(2) 物理因素紫外線（UV）高能射線 (X-射線)電離輻射等(3) 化學因素 化學因素是引起DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的最常見因素，主要包括：烷基化試劑堿基類似物嵌入劑亞硝酸鹽2013.11.152013.11.15 烷基化試劑烷基化試劑能夠與DNA分子中的氨基或氧作用，生成烷基化DNA。從而產(chǎn)生致癌作用。氮芥、環(huán)磷酰胺等藥品仍在作為抗癌藥物繼續(xù)使用。它們既是抗腫瘤藥物，又可誘發(fā)繼發(fā)

21、性腫瘤。 Example of how DNA damage results in mutationsFigure 12013.11.15Figure 2Example of how DNA damage results in mutations2013.11.15 堿基類似物取代正常堿基摻入并與互補鏈上堿基配對。某些堿基類似物易發(fā)生互變異構(gòu)，復制時導致配對改變，引起堿基對置換。如：5溴尿嘧啶（BU） 2氨基嘌呤2013.11.152013.11.15 嵌入劑扁平的稠環(huán)分子，如吖啶（acridine）、溴乙錠（ethidium）等染料，可插入到DNA的堿基對之間，導致堿基對間的距離撐大，引起移

22、碼突變。2013.11.15 亞硝酸鹽 在亞硝酸作用下： C轉(zhuǎn)變?yōu)閁。 A轉(zhuǎn)變?yōu)镮（次黃嘌呤核苷） G轉(zhuǎn)變?yōu)閄（黃嘌呤核苷）NNNH2ORHONONNN2+ORH2ONNOHORHNNORO2013.11.152013.11.15The Ames Test -誘變劑和致癌劑的快速檢測Bruce AmesCompleted in 2 daysAbout 90% positive correlation營養(yǎng)缺陷型菌株（Salmonella typhimurium）誘變劑無His, 不生長產(chǎn)生菌落突變成能合成His的菌株2013.11.15（六）化學物質(zhì)與核酸的相互作用核酸是重要的生命物質(zhì)基礎。許多

23、分子能與核酸發(fā)生相互作用,破壞其模板作用,使核酸鏈斷裂，進而影響基因調(diào)控和表達功能。與核酸相互作用的小分子可作為生物探針、抗腫瘤藥物的先導化合物、預警標示物。小分子與核酸相互作用的測定： -光譜、電泳等方法。 -闡明作用模式、構(gòu)效關系等。2013.11.151. 小分子化合物與DNA的識別及作用方式 小分子化合物與DNA的結(jié)合常常誘發(fā)很多生物效應。以DNA為靶分子進行藥物設計的分子基礎。結(jié)合作用按化學鍵劃分： - 共價鍵結(jié)合 - 非共價鍵結(jié)合 2013.11.15（1）共價結(jié)合 DNA烷基化劑：早期使用，如氮芥。基本上沒有選擇性，臨床使用有嚴重的毒副作用。天然抗癌抗生素：首先與DNA形成非共價

24、復合物，然后再與之共價結(jié)合。這些雜環(huán)化合物最初的作用是干擾DNA、RNA的合成來達到殺菌的目的，但很多這類化合物卻也表現(xiàn)了明顯的抗癌活性，而且具有選擇性毒性。 2013.11.152013.11.15絲裂霉素C 絲裂霉素C是一種抗癌抗生素。經(jīng)酶的還原活化會引起結(jié)構(gòu)中某些碳位甲醇組成的脫去，繼而進行DNA的烷基化（還原烷基化劑）。2013.11.15螺旋丙烷類抗生素 CC-1065：此類中較新的抗生素，有較強的細胞毒作用，能序列特異性地作用在DNA小溝區(qū)。由于它攻擊腺嘌呤N-3位，脫嘌呤作用的發(fā)生會產(chǎn)生一個活性部位，序列分析表明CC-1065對DNA的AT富集區(qū)有選擇性。 順鉑(cis-Pt)c

25、is-Pt是臨床上比較成功的化學治療藥物。 2013.11.15順鉑它的鉑化定位于DNA大溝區(qū)的鳥嘌呤的N-7位，緊接著與第二個嘌呤作用，選擇性地結(jié)合到d(pGpG)和d(pApG) 序列，形成了DNA的各種交聯(lián)。2013.11.15（2）非共價結(jié)合 大多數(shù)藥物與DNA的作用都是非共價結(jié)合，它主導著藥物分子與DNA結(jié)合的特異性。 2013.11.15外部靜電作用 核酸的陰離子磷酸根部分強烈地影響DNA的構(gòu)象及其反應。這種帶電荷的高聚物的構(gòu)象需要在小分子作為抗衡離子的協(xié)同作用中達到完全穩(wěn)定，這種沿著螺旋外部靜電相互作用多是非特異性的。例如，聚乙烯基亞胺。2013.11.15溝區(qū)結(jié)合 蛋白質(zhì)與DN

26、A的特異性結(jié)合多在DNA大溝區(qū)藥物小分子一般在小溝區(qū)作用。典型的小溝區(qū)結(jié)合的藥物分子多含有幾種簡單的芳香雜環(huán)結(jié)構(gòu)如呋喃、吡咯或苯環(huán)，這些芳環(huán)由扭轉(zhuǎn)自由的鍵來連接藥物在小溝區(qū)結(jié)合的特異性源于藥物分子與DNA雙螺旋鏈各溝區(qū)的堿基對邊緣通過范德華力形成接觸。 2013.11.15嵌插結(jié)合 藥物分子嵌插入DNA雙鏈的堿基對片層之間，堿基對的分開，使螺旋伸長、螺旋解鏈、扭轉(zhuǎn)角減小。藥物分子通過嵌入DNA，使DNA的構(gòu)象發(fā)生改變，使其不能或不易復制，從而顯現(xiàn)出抗腫瘤、抗病毒的活性。2013.11.15Nature Review Cancer 2002, 2, 188-200DNA AND ITS ASSOCIATEDPROCESSES AS TARGETS FORCANCER THERAPYReviewLaurence H. Hurley2013.11.151940198519801997Main period for discoveryContinued dis