1、細菌分離純化培養及鑒定protocol樣品菌株分離：準備工作1用報紙將平板包好（約12個一包）滅菌后放入烘箱烘干，最好隔 夜；2按照培養基的配方配制好液體培養基后，調pH值（注意滅菌后培 養基pH會略有升高），其中一定體積液體培養基中加入1.5%的瓊 脂后，倒入錐形瓶并用濾膜封好待滅菌。注意培養基的體積總量 不能超過錐形瓶的三分之二，約一半左右；剩余液體培養基加入 試管中，每支5ml （其中3ml用于保種，2ml用于提取菌株基因組 DNA），用膠塞封好，與加入瓊脂的錐形瓶一起滅菌；3將無菌超凈臺打開紫外燈滅菌約20分鐘，將滅好菌的培養基放置 冷卻到不燙手后，在超凈臺中操作倒入到已烘干的培養皿中

2、，每 塊板中倒入約20ml，厚度約為培養皿的1/31/2之間。倒好后的 培養皿疊放在超凈臺內，待培養皿中培養基冷卻凝固之后即可使 用。暫時不用的，可先用封口膜封好并標記好培養基名稱存放好。4在培養皿上寫清樣品名稱，標注日期，姓名。用槍加入100uL液 體樣品到培養皿上，盡量把培養皿托平，將涂布玻棒插入酒精中 取出在酒精燈外焰灼燒完全，待冷卻后，在酒精燈下將液體涂布 均勻（最好涂布至培養基將液體全部吸收）。5將涂好的培養皿正置培養2小時后，用封口膜封好，倒置培養。定時觀察平板，描述菌落的顏色、形狀，記錄菌落數并拍攝照片。劃線分離純化：1待涂布好的培養皿上長出單菌落后，用挑取同一培養皿中不同顏 色

3、、不同形狀的菌落進行劃線分離純化，挑取的菌落用記號筆標 出。2將接種針在酒精燈外焰灼燒完全，稍冷卻后，在平板上進行Z字 形三個方向劃線。3若在新板上又長出新菌落，再次分離劃線4劃線需做至少2-3次，直至菌落完全純化（純化步驟很關鍵）保種：1將已純化的細菌用滅菌的牙簽蘸取接種入試管內（注意要取單菌落），搖床150r/min, 28C培養，直到其生長至指數期2在2ml凍存管（預先滅菌并烘干）中加入1ml 30%甘油（甘油預先 配置好滅菌后待用），再加入1ml上述1中的菌液，蓋緊管蓋，混 勻后在管壁做好樣品標記和日期，同時在實驗記錄本上做好記錄3以上每個樣做三管，做好記錄，放入冷存盒，放入-80度冰

4、箱內， 記錄存放位置。4將同一試管內剩余的2ml細菌培養液加入到滅過菌的2ml試管中 待提取DNA。DNA的提取：可采用細菌基因組DNA抽提試劑盒或手提的方法進行 手提法步驟如下：1、取2mL,8000r/min離心10分鐘，棄去上清。2、加入2 ml無菌水離心洗滌兩次，用2ml無菌水懸浮菌體，混 勻,-20C保存備用。3、取 0.7ml 菌懸液，加入 37 口 l 10%SDS,混勻，加入 7.4 口 l 10mg/ml 蛋白酶K,混勻，37T溫育1小時4、加入 148 口 l 5mol/L NaCl,再加入 102 口 l CTAB/NaCl （質量濃度50 g/ L CTAB ,0.5

5、mol/ L NaCl），混勻，65C溫育 10 分鐘。5、加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，10000r/min離心5分鐘,保留上 清。6、上清中加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25 : 24 : 1）,混 勻,10000r/min離心5分鐘，保留上清。7、加入0.6倍的異丙醇，混勻,-20C靜置20分鐘以上，10000r/min離心5分鐘，收集DNA沉淀，用70%乙醇離心洗滌DNA沉淀。8、用50 口 l無菌水溶解DNA,4C保存。比較了幾種方法，該方法對我們實驗室的純菌DNA的提取較好，能提 到較高濃度的DNA。16S PCR反應及其測序：將已提取的細菌基因組DNA作為模板，1492r, 27f作為引物，用TAKARA高保真taq酶做16s PCR反應，其PCR產物純化（純化試 劑盒）后，即可送去測序；也可以將產物直接拿給測序公司由他們幫 忙純化并測序，其費用會略高