1、廣西檸檬疫菌褐腐病病原菌鑒定蔣運寧1，陽廷密1，陳傳武1，李紅葉2，王洪凱2，葉泉清3，國立耘4，婁兵海1，付慧敏1（1 廣西特色作物研究院/廣西柑橘生物學重點實驗室，桂林，541004；2 浙江大學生物技術研究所，杭州，310029；3 廣西師范大學生命科學學院，桂林，541004； 中國農業大學植物病理學系，北京，100193）基金項目：廣西科技重大專項（桂科AA17204097-8)；桂林市科學研究與技術開發計劃項目（20160223-4）；廣西柑橘生物學重點實驗室課題（SYS2015X001，SYS2017X002）；國家現代農業(柑橘)產業技術體系項目(CARS-27)資助。第一作者

2、：蔣運寧（1963），男，助理研究員，主要從事柑橘科研及技術推廣工作，E-mail:HYPERLINK mailto:摘 要 為了解廣西檸檬疫菌褐腐病的病原菌確切種類，本研究通過多次采樣、病菌分離純化、人工接種等一系列研究，確定分離到了正確的病原菌。根據病原菌的形態學特征，rDNA-ITS序列和致病性，確定引起廣西檸檬疫菌褐腐病的病原菌為柑橘褐腐疫霉菌(Phytophthora citrophthora)。關鍵詞檸檬；疫菌褐腐病；形態學鑒定；分子鑒定；柑橘褐腐疫霉菌檸檬Citrus limon (L) Burmf.屬蕓香科(Rutaceae)柑橘屬(Citrus)枸櫞(Citrus medic

3、a L)類的常綠果樹。檸檬全身是寶，是一種鮮食與加工兼用型高檔水果。檸檬栽培主要分布在熱帶和亞熱帶國家和地區，目前世界上有30多個國家生產檸檬（包括來檬），在世界柑橘四大類（甜橙、寬皮柑橘、檸檬、柚類）中，檸檬栽培面積居第三位，占柑橘栽培面積的11%。中國是檸檬栽培的起源地之一，有1000多年的栽培歷史，我國檸檬產區主要分布在四川、云南、重慶、廣東、廣西、福建、浙江、臺灣等地1。近年廣西桂林市的部分檸檬果園46月份雨季突發落葉、落果和枯梢現象，主要危害檸檬果實和葉片，以樹冠中下部、靠近地面的果實及葉片受害重，造成大量落果和落葉。受害葉片多從葉緣、葉尖或沿主脈產生水漬狀病斑，似開水燙傷狀，病健部

4、交界不明顯。病斑近圓形或不規則形，病斑初為淡青至淡黃色，隨后迅速轉為淺褐色至深褐色，易誤診為急性炭疽病。陰雨潮濕時，病斑擴展極快，可占葉片面積的1/32/3，病葉主脈變黃，造成感病葉片大量脫落。果實發病時，先為圓形的淡灰色病斑，后漸變成淡褐色，水漬狀軟腐，病部稍凹陷，病健部分界明顯，后期果實有腐爛臭味。干燥條件下果實病斑革質，微凹陷，按壓稍有彈性，果實發病后容易脫落（見圖1、）。由于該病發病迅猛，導致葉片及果實大量脫落，致使樹勢衰退，產量銳減，田間癥狀與疫霉菌引起的疫菌褐腐病相似。據報道，全世界為害柑橘的疫霉菌有14種，但在不同國家及地區，疫霉菌種類有所不同2。為了解廣西檸檬疫菌褐腐病病原菌種

5、屬分類地位，筆者于2017年4月2017年6月期間，多次到發病果園調研和采樣，分離培養病原菌，再從病原菌形態學、分子生物學等方面對該病的病原菌進行了系統研究，然后利用形態學及rDNA-ITS序列分析方法進行鑒定，以期為有效防治檸檬疫菌褐腐病提供理論依據。1材料與方法1.1病原菌的分離與純化1.1.1病原菌分離 從廣西桂林市臨桂區8年生檸檬植株上采集具有典型癥狀的病枝、病葉和病果，裝入干凈的塑料采集袋中，帶回實驗室進行分離培養。分離方法為：將采集到的樣品表面洗凈，用吸水紙吸干表面水分，用脫脂棉球蘸取75%的酒精將表面擦拭后，再在要取樣的部位滴上少量酒精，用火機點燃，火滅后再重復一次。用滅菌的解剖

6、刀將燒過的病部表面組織（約2 mm厚）去除，然后切取組織小塊（3 mm3 mm）,轉移到1/5PDA平板上（含有5 mg/L氯霉素和60 mg/L的鏈霉素），培養3-5天，待從組織塊邊緣長出菌絲，轉移到新的PDA平板上培養。1.1.2病原菌純化從1.1.1的PDA平板上挑取生長旺盛的菌落邊緣的小菌絲塊轉移到含有抗生素（5 mg/L氯霉素和60 mg/L的鏈霉素）的水瓊脂平板上，培養兩天。用滅菌的解剖刀在解剖鏡下，切取含有單菌絲的小瓊脂塊，轉移到新的PDA平板上，待菌落長滿平板后保存。1.2病原孢子誘導將1.1.2獲得的純化病原菌轉接在CA培養基（新鮮胡蘿200 g榨汁、瓊脂20 g/L）上，觀

7、察其菌落形態，氣生菌絲生長狀況。將1.1.2獲得的純化病原菌轉接在V汁培養基上培養，并用皮氏液誘導產生孢子囊，觀察其形態特征。1.3致病性測定將1.2獲得的病原菌接種到掛有幼果的無病盆栽檸檬植株上，分別對葉片和果實進行接種。葉片接種：從無病盆栽檸檬植株上采集葉片，用75%的酒精擦拭35次，晾干后放入墊有吸水紙的培養皿中，用游動孢子液進行接種。果實接種：用75%的酒精擦拭35次無病盆栽檸檬植株上的幼果，用針刺傷檸檬果實，再將菌絲塊接種到被刺傷的檸檬果實上，然后套透明塑料袋密封保濕。同時用無菌水接種作對照。1.4病原菌形態學觀察 在光學顯微鏡下，觀察分離培養獲得的病原菌的菌絲、孢子囊和孢囊梗的形態

8、、大小及色澤特征，并測量其大小。根據病原菌菌落形態、孢囊梗及孢子囊形態特征等性狀進行鑒定。1.5 病原菌分子鑒定基因組DNA的提取：將供試菌株PGL接種到在9 cm的PDA平板上生長7天，用滅菌的接種針刮取菌落表面的菌絲，轉移到1.5 mL的離心管中，加入700 L的CTAB提取液及少量石英砂，在DNA提取儀上破碎后，按照常規方法提取DNA，并置于-20冰箱中保存待用。DNA片段PCR擴增：采用通用引物ITS1(5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3)和ITS4(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)進行擴增核糖體DNA的ITS區域，采用引物Fm84 (5-TTT AAT

9、TTT TAG TGC TTT TGC-3)和Fm83(5-CTCCAA TAA AAA ATA ACCAAA AAT G-3)擴增cox1基因片段，采用Btub F1(5-GCCAAGTTCTGGGAGGTCATC-3)和Btub R1(5-CCTGGTACTGCTGGTACTCAG-3)擴增微管蛋白-tubulin基因片段。PCR反應體系：2 PCR buffer 12.5 L(包含 0.1 U Taq DNA聚合酶，500 mM dNTP mixture，20 mM Tris-HCl，100 mM KCl，3 mM MgCl2)，10 M ITS1和ITS4 引物各0.5 L，模板DNA

10、 1 L，補足ddH2O至25 L。PCR反應條件：94預變性3 min；94變性l min，54退火40 S, 72延伸40 S，35個循環；最后72延伸10 min。PCR擴增產物的序列測定委托上海生工生物工程有限公司進行。將所得序列與GenBank數據庫中的核苷酸序列進行BLASTn比對，從GenBank數據庫中下載相似的序列（見表1），通過Bioedit對三種序列分別進行裁剪后，將其并為一個序列,采用PAUP4.0b10軟件的非加權簡約法進行系統樹的構建。通過1000次的bootstrap評估系統樹分支的穩定性。表1 用于本次分析的從GeneBank中下載的基因片段種名菌株號GeneB

11、ank登錄號文獻ITS-tubulincoxIP arecaeCBS 305.62HQ643146DQ988241HQ708218Rahman等（2014）3P. botryosaP6945HQ643151EU079935HQ708222P. colocasiaeP6317HQ261539EU079907HQ261286P. gregataCPHST-BL 37 MG865503MH493945MH477746P. meadiiCBS 219.88HQ643268AY564077HQ708324P. pseudosyringaeP10443HQ261653EU080023HQ261400P.

12、quinineaCBS 407.48HQ643338AY564085HQ708386P. richardiae45F5 MH620154KX251924MH620078P. heveaeCBS296.29 MG865505AY564067HQ708301P. citricolaCH97TUL2AB367377AB974435AB688187P. citrophthoraSTE-U 7435JN606025JN605861JN605937Christoffel等（2014）4STE-U 7420JN606000JN605846JN605922STE-U 7444JN606018JN605870J

13、N605946STE-U 7456JN606024JN605882JN605958P0318JN606020JN605840JN605916P3078JN606036JN605842JN605918Vi-11JN605990JN605906JN6059822結果與分析2.1致病性測定結果接種試驗表明，離體葉片用游動孢子液接種，幼果用菌絲塊接種，7天后兩者均出現癥狀，12天后病斑擴展至葉、果大部分，其癥狀特點與田間自然條件下發病的癥狀一致（見圖1 A、B）。從接種發病的部位進行菌株的分離，均能獲得與來自田間發病組織分離得到的菌株相同的病原菌。而接種無菌水的對照則不表現任何癥狀，也未分離出病原真菌

14、。根據柯赫氏法則,證明該病原菌為廣西檸檬疫菌褐腐病的致病菌。我們將一個分離物記為PGL。2.2病原菌鑒定2.2.1病原菌的培養性狀及形態特征病原菌菌株PGL在CA培養基，菌落呈棉絮狀，氣生菌絲較少；在PDA、MEA和燕麥培養基上，形成白色菌落，菌落呈花瓣放射狀，菌絲發達，但是菌絲生長比常見的寄生疫霉的生長速度慢很多，菌落邊緣不整齊（圖2A）。在顯微鏡下，1周之內只見菌絲，菌絲粗壯，粗細均勻，無隔膜，內部油球多，未見菌絲膨大體和厚垣孢子，無產孢結構出現（圖2B）。3周后出現孢子囊。孢囊梗簡單合軸分枝，分枝不規則，粗2.34.7 m，平均3.4 m。孢子囊形態變異極大，有長橢圓形、卵形、近圓形、橢

15、圓形、倒梨形等，基部鈍圓，大小為（21.484.3）m（17.641.2）m，平均55.7 m33.8 m，長寬比平均為1.6，孢子囊頂部凸起明顯，具有淺色半球形乳突，一般1個，少數2個，高度3.47.6 m，平均5.2m，排孢孔寬度4.97.6 m，平均6.0 m，后期顏色鮮黃色，孢子囊在水中不脫落（圖3）。異宗配合，配對培養未見有性器官產生。根據上述病原菌的培養性狀和形態學特征，參照真菌分類相關文獻5-7的描述，初步鑒定該病原菌為柑橘褐腐疫霉菌(P. citrophthora)。圖1離體檸檬葉片及果實接種12天后病斑擴展至葉、果大部分(A、B）；田間果實、葉片發病癥狀（C、D）圖2在固體培

16、養基上，菌落呈放射狀，氣生菌絲較少(A)；菌絲粗壯，管狀，無隔膜，有油球狀內含物(B)圖3孢子囊梗和孢子囊形態2.2.2病原菌rDNA-ITS序列分析將本研究中測序得到的rDNAITS、cox1和-tubulin三個DNA片段和從GenBank數據庫中下載的相關序列經過合并后，形成了2091個特征符的數據陣。聚類分析后得到了5個同等聚類樹，圖4顯示了其中的1個。我們根據Christoffel等（2014）4的研究，將Phytophthora heveae作為外群，結果表明，本研究中分離到的菌株PGL與P. citrophthora聚類在一起，boostrap分析得到99%的支持。根據該病原菌的

17、形態特征，結合分子鑒定分析以及致病性測試的結果，將引起廣西檸檬疫菌褐腐病病原菌鑒定為柑橘褐腐疫霉菌(P. citrophthora)。圖4根據rDNAITS、cox1和-tubulin三個DNA片段序列分析得到的系統發育樹3結論與討論本研究通過對廣西檸檬疫菌褐腐病的病原菌進行致病性測定、形態學特征分析以及核苷酸序列分析，明確了其病原菌為柑橘褐腐疫霉菌。柑橘疫菌褐腐病，又稱為柑橘疫腐病、褐腐病等8，引起該病的病原可為多種疫霉屬(Phytophthora)真菌，甜橙、寬皮柑橘、柚類及檸檬均可被疫霉菌感染。該病原菌主要為害成熟期果實和葉片，在田間和貯運期均能發生，可導致果實大量脫落。柑橘疫菌褐腐病在

18、世界各柑橘產區均有發生，我國以川、渝等西南地區發生嚴重9。近年報道湖南江永夏橙10、江西贛州臍橙11、廣東梅州金柚12、湖北宜都溫州蜜柑13、廣西平樂沙田柚14，均遭受到疫霉病嚴重危害，給柑橘生產造成了嚴重的損失。本研究明確了廣西檸檬疫菌褐腐病的病原及分類地位，為制定廣西檸檬疫菌褐腐病的防治策略提供理論依據。參考文獻1 王自然，郭 俊，等.檸檬苗期一種新病害的病原鑒定及防治藥劑的室內篩選J.植物保護，2012，38（4）：166-1702 廖 芳，朱林慧，牛春敬，羅加鳳，任學毅，黃國明，李關榮.柑橘屬植物疫霉病菌檢測與鑒定的研究進展J.植物檢疫，2015，29（1）：7-113 RAHMAN MZ，UEMATSU S，COFFEY MDAVID，UZUHASHI S，SUGA H，KAGEYAMA K. Re-evaluation of Japanese Phytophthora isolates based on molecular phylogenetic analysesJ. Mycoscience, 2014, 55(4): 314-3274 CHRISTOFFEL F.J. SPIES，JULIA C. MEITZ-HOPKINS，SHAUN