1、中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室第二章基因工程的基本原理及基本過程主講教師： 朱本忠2002 年 9 月中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室食品生物技術對人類的作用解決食品短缺，緩解由于人口增長帶來的壓力。豐富食品種類，滿足不同層次消費人群的需求。（全球人口膨脹，“中國威脅論”）（提高生活質量）中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室開發新型功能型食品，保障人類健康。生產環保型食品，保護環境。開發新資源食品，拓寬食物來源。食品生物技術對人類的作用（保健食品，功能食品）（減少環境污染，降低腐爛率）中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室生物工程下游技術現代分子檢測技術酶工程發酵工程蛋白質工程

2、細胞工程倫理學電子學分子生物學微生物學生物化學免疫學食品營養學細胞生物學化學工程基因工程食品生物技術研究內容關系樹中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室本章應掌握的主要內容基因工程的概念和主要內容基因工程的原理和關鍵技術反義基因技術的概念、原理基因工程在食品中的應用中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室第一節基因工程的基本原理和內容DNA（脫氧核糖核酸）RNA（核糖核酸）基因中心法則一、基本概念中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室1、DNA（脫氧核糖核酸）由兩條極性相反并互補的多聚核苷酸鏈圍繞中心軸的雙螺旋結構。2.兩條鏈中的堿基之間按照A配T,G配C的互補原則，以氫鍵連接。 其中A為：腺嘌

3、呤 T為：胸腺嘧啶 G為：鳥嘌呤 C為：胞嘧啶 U為：尿嘧啶 (RNA)中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室DNA雙螺旋堿基配對圖中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室4.DNA有自我復制的能力。DNA（脫氧核糖核酸）DNA線性排列于染色體上，存在于細胞核中。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室DNA自我復制示意圖中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室2、RNA（核糖核酸）存在于細胞質中分別有三種功能不同的RNA mRNA tRNA rRNAmRNA包含遺傳密碼，由DNA轉錄而來中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室RNA蛋白質反轉錄轉錄DNA翻譯3、中心法則自我復制中國農業大學食品學院采

4、后生物技術實驗室4、有關基因的概念基因是含有一定功能的DNA片段，是遺傳的基本單位。獲取某段有一定生理功能的DNA片段叫基因克隆。找出某段有一定生理功能的DNA片段在染色體上的位置叫基因定位。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室測定出某段有一定生理功能的DNA片段的堿基序列叫基因測序。按照一定的堿基序列，以核苷酸為原料，合成某段有一定生理功能的DNA片段叫基因合成。4、有關基因的概念中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室二、基因工程是生物技術的核心內容是現代高新技術的標志之一是世界科學技術革命的重要組成部分Genetic Engineering中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室解決人類生

5、存和發展的重要手段科學技術發展的火車頭1、基因工程（意義）帶動農業科學，醫學，環境科學，信息科學等學科的快速發展。解決食品保證安全，揭開生命的奧秘，治療疾病。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室強大的社會倫理沖擊力涉及復雜的政治、外交斗爭手段人類思想進步的推動者1、基因工程（意義）遺傳物質的傳遞打破倫理限制物種間的平等，解釋宇宙生命現象，破除迷信和邪教黨派斗爭，國際貿易爭端中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室2、基因工程概念 用人工的方法把不同生物的遺傳物質（基因）分離出來，在體外進行剪切、拼接、重組，形成重組體，然后把重組體引入寄主細胞或個體中，使其得到高效表達，最終得到人們所需要的基因

6、產物。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室3、基因工程的要點切接貼檢中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室產品基因工程基本過程酶切酶切連接轉化表達重組體（目的基因）中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室4、基因工程基本過程 利用重組DNA技術，在體外通過人工“剪切”（cut）和“拼接”（splice）等方法，對生物的基因進行改造和重新組合，然后導入受體細胞內進行增殖，使重組基因在受體內表達，產生出人類需要的基因產物。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室在供體細胞中用限制性內切酶切割基因，以分離出含有特定基因片段或人工合成的目的基因并制備載體。把獲得的目的基因與制備好的載體用DNA連接酶連接

7、組成重組體。5、基因工程主要內容1.2.中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室把重組體轉入宿主細胞。篩選、鑒定出含有外源目的基因的菌體和個體。3.4.基因工程主要內容中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室目的基因的獲得 載體的選擇6、基因工程的一般操作步驟轉基因生物的鑒定轉基因重組體的獲得導入目標生物體細胞內重組質粒的構建中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室7、所用的基本實驗技術原核生物細胞中克隆載體的提取真核生物細胞中外源DNA的提取目的基因克隆如質粒提取如基因組DNA的提取如PCR技術中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室所用的技術基本實驗技術表達載體的構建基因轉化技術轉基因鑒定技術如D

8、NA酶切、連接、轉化如農桿菌介導的基因轉化如Southern雜交中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室8、所采用的基本工具切接貼檢限制性內切酶DNA連接酶載體雜交切割DNA分子連接DNA分子基因轉化基因鑒定中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室9、食品基因工程定義 利用基因工程的技術和手段，在分子水平上定向重組遺傳物質，改良食品的品質和性狀，提高食品的營養價值、貯藏加工性狀以及感官性狀的技術。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室10、基因工程的特點可以大大縮短育種年限。生物的基因可以在人類、動物、植物和微生物四大系統間進行交流。對物種定向改造。（常規育種，輻射育種，航天育種）中國農業大學食品

9、學院采后生物技術實驗室11、基因工程研究的對象 研究生物大分子，如：蛋白質、核酸、多糖等調節生命過程的物質，包括它們的功能、性狀、代謝。 如Bt蛋白，反義抑制基因表達，油脂改良，植物疫苗。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室12、基因工程的發展概況1972年,Berg等首次用限制性內切酶Eco RI切割病毒SV40DNA和噬菌體DNA,組成重組DNA分子。這是首次DNA重組實驗。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室1973年，Cohen將傷寒沙門氏菌抗鏈霉素質粒與大腸桿菌抗四環素質粒在體外重組，獲得異源的重組質粒DNA，并把重組質粒導入大腸桿菌中，建立了抗四環素和抗鏈霉素的重組質粒DNA，

10、標志著基因工程的出現。12、基因工程的發展概況中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室12、基因工程的發展概況1986年，美國和英國科學家首次進行了抗除草劑轉基因煙草的田間實驗。此后，基因工程技術迅猛發展，已經在農業、醫藥、食品、環保等領域顯示出巨大的應用價值。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室12、基因工程的發展概況2000年全球的轉基因作物種植面積有4420萬hm2，為1996年的25倍。轉基因作物種植面積最大的前4個國家是美國、阿根廷、加拿大、中國，占全球的99.9%。我國商品化的轉基因植物為：轉基因耐貯番茄，轉查爾酮合成酶基因矮牽牛，抗病毒甜椒，抗病毒番茄，抗蟲棉和保齡棉等。中國農業

11、大學食品學院采后生物技術實驗室第二節 工具酶和基因載體一、基因工程的工具酶種類：限制性內切酶連接酶核酸酶堿性磷酸酶逆轉錄酶中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室（一）限制性內切酶1、發現：60年代初W.Arber等首次發現。大腸桿菌E.coli BE.coli BE.coli K噬菌體中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室限制和修飾系統限制作用：一定類型的細菌可以通過限制性酶的作用，破壞入侵的噬菌體DNA，導致其侵染受到限制。修飾作用：寄主本身的DNA由于合成后通過甲基化酶的作用得到甲基化，使DNA得到修飾，從而免遭自身限制性酶的破壞。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室限制和修飾系統通常，

12、用于基因轉化的菌株為：（2）缺乏限制和修飾功能的菌株。（1）缺乏限制功能而具有修飾功能；中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室2、限制性內切酶的定義在細菌中有一種能夠在特定位置上切割DNA分子的酶，這種酶就被稱為限制性內切酶。Restriction enzyme, 簡稱RE中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室3、限制性內切酶的分類(I,II,III)I型：多聚體蛋白質。作用時需要ATP、Mg2+、SAM。與DNA上未修飾的識別序列相互作用，然后沿DNA分子移動，在1000-5000個核苷酸距離后隨機切割單鏈DNA。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室3、限制性內切酶的分類(I,II,III

13、)II型：分子量較小的單體蛋白質。作用時僅需要Mg2+即可維持活性。能在特殊位點切割DNA，產生具有粘性末端或其他形式的DNA分子片段。廣泛應用于基因工程。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室3、限制性內切酶的分類(I,II,III)III型：一些具有獨特識別方式和切割方式的內切酶。如Mbo II5-GAAGANNNNNNNN-35-CTTCTNNNNNNN-3 識別位點 切割位點N：指任意一個堿基中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室4、II型限制性內切酶的命名和作用特點命名原則:用具有某種限制性酶的有機體學名縮寫來命名。用有機體屬名第一個字母（大寫，斜體）和種名的前兩個字母（小寫，斜體）

14、構成基本名稱。如果酶存在于特殊菌株中，則還加上菌株名稱的符號。最后的羅馬數字表示從該菌株中發現此酶的先后順序。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室命名舉例：Hae II從Haemophilus aegypticus中提取的，并且是從中發現的第二種限制性酶。Hin fI從Haemophilus influenzae菌株f中純化而得的。Eco RI從大腸桿菌Escherichia coli中分離出來的，R表示這種酶的基因在R質粒上。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室作用特點：識別位點序列一般是4個、5個、6個或8個堿基對。識別位點一般都是回文結構。5GAATTC35CTTAAG3Eco RI

15、中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室作用特點：產生粘性末端或平齊末端。粘性末端平齊末端5GAATTC33CTTAAG55G AATTC3 3CTTAA G5Eco RI酶切(Cohesive ends)5GTTAAC35CAATTG35GTT AAC35CAA TTG3(blunt ends)Hpa I酶切中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室作用特點：同裂酶 是指來自不同有機體但識別和切割相同DNA序列的酶。 如Hin d III與Hsu I就是同裂酶。同尾酶 指來自不同有機體，并且不同識別序列的酶，但在切割DNA分子后，產生相同的末端，這種酶稱為同尾酶。中國農業大學食品學院采后生物技術實

16、驗室作用特點：消化條件必須堅持應用推薦的反應條件。當反應條件改變時酶的專一性可能降低，以至同一種酶可識別和切割更多的位點，酶活性發生這種改變，常常在酶上加上星號，簡稱為酶的星活性。如Eco RI* 中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室5、限制性內切酶反應的終止適用于大多數限制性內切酶。65 ，溫浴5分鐘。變性劑：如尿素或SDS。耐熱的酶如Bam HI和Hae III。DNA純化：酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室6、限制性內切酶的主要用途在特異性位點上切割DNA，產生特異性限制性內切酶切割的DNA片段。建立DNA分子的限制性內切酶物理圖譜。構建基因文庫。用限制性內

17、切酶切出相同的粘性末端，以便重組DNA。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室（二）DNA連接酶能將兩段DNA拼接起來的酶叫DNA連接酶。POHPOHPOHOHP催化DNA相鄰的5磷酸基和3羥基末端形成磷酸二酯鍵。粘性平端中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室1、種類大腸桿菌連接酶需要NAD+（煙酰胺單核苷酸）只能連接粘性末端DNA片段T4連接酶需要ATP能連接粘性末端，也能連接平齊末端中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室2、影響連接反應的因素溫度，離子濃度，DNA末端特性，DNA末端的濃度和分子量。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室（1）粘性末端的連接最適連接溫度是粘性末端Tm值和DN

18、A連接酶作用最適溫度的折中，常用溫度為14 。使外源DNA片段濃度比載體DNA高10-20倍，可減少載體自連現象。用堿性磷酸酶預處理質粒載體。（無磷酸基不能連接，而外源DNA片段帶有磷酸基）中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室（2）平齊末端的連接最適連接溫度應接近反應中最小片段的Tm值，但不要超過37。高濃度的ATP會抑制平齊末端的連接。連接反應復雜，速度顯著減慢。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室（三）DNA聚合酶：負責DNA的復制或合成聚合酶I聚合酶II聚合酶III特性分子量結構基因合成速度3外切活性5外切活性pol Apol Bpol C19000120001400016-20/s

19、2-5/s250-1000+-+大腸桿菌中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室基因工程常用聚合酶1、大腸桿菌DNA聚合酶I特性用途5-3DNA聚合酶活性3-5外切核酸酶活性5-3外切核酸酶活性切口平移法標記DNA5-3外切活性降解核酸作為cDNA合成引物3端標記進行序列分析中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室基因工程常用聚合酶2、大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）特性用途5-3DNA聚合酶活性3-5外切核酸酶活性隨機引物法標記DNA3端末端標記3端標記進行序列分析補平粘性末端cDNA第二條鏈的合成雙脫氧法DNA測序中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室基因工程常用聚合酶3、T4噬菌

20、體DNA聚合酶特性用途5-3DNA聚合酶活性3-5外切核酸酶活性標記3突出端DNA分子將雙鏈DNA末端轉化為平端使結合于模板的誘變引物延伸補平或標記粘性末端5-3外切核酸酶活性中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室4、T7噬菌體DNA聚合酶特性用途已知DNA合成酶中持續合成能力最強。3-5外切核酸酶活性為Klenow的1000倍用于長片段模板的引物延伸反應通過補平和交換反應進行快速末端標記基因工程常用聚合酶中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室5、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）特性用途從噬熱菌中純化而來。5-3外切核酸酶活性聚合酶鏈式反應（PCR）對DNA片段進行體外擴增DNA測序基因工程常用聚

21、合酶耐熱的DNA聚合酶中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室6、末端轉移酶特性用途在DNA分子3端加上多個脫氧核苷酸（A或G或T或C）不需模板，需要Co2+給載體或cDNA加上互補的同聚尾巴DNA片段3末端的放射同位素標記基因工程常用聚合酶中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室(四）堿性磷酸酶一種是大腸桿菌的BAP一種是牛小腸的CIP催化去除DNA、RNA、rNTP和dNTP的5磷酸基，產生5羥基。去除DNA和RNA的5磷酸基，經過標記后進行序列分析。去除載體DNA的5磷酸基，防止載體自連。用途特性中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室（五）S1核酸酶是特異性單鏈核苷酸外切酶，能降解單鏈DNA

22、和單鏈RNA。去除DNA片段的單鏈突出端，使DNA成為平端。去除cDNA合成時形成的發卡結構。用S1核酸酶保護實驗進行基因表達分析內含子在基因組DNA中的定位。修整漸進性刪除突變的末端特點用途中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室（六）逆轉錄酶催化以單鏈RNA為模板生成雙鏈DNA的反應。RNA指導的DNA合成反應DNA指導的DNA合成反應RNA的水解反應特性用途中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室RNA蛋白質反轉錄轉錄DNA翻譯自我復制中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室二、基因工程載體(vector)能在宿主細胞內進行獨立和穩定的DNA自我復制。易于從宿主細胞中分離，并進行純化。在其DN

23、A序列中有適當的限制性內切酶單一酶切位點。具有能夠直接觀察的表型特征。理想載體應具備的特征中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室（一）質粒載體 質粒(plasmid)是一種小的雙鏈環狀DNA分子，它們在細胞中能獨立于染色體外進行自我復制，并包含各種功能的基因。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室構建質粒載體應考慮的方面分子量盡可能的小。了解載體上基因的位置、限制性內切酶的作用位點。在理想寄主中，載體應該容易繁殖。載體應包含一個可供選擇的標記性狀，從區別轉化細胞和非轉化細胞。應最大限度地具有各種限制性內切酶的切割位點。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室舉例：pBR332大小為4363bp。

24、含有抗氨芐青霉素基因和抗四環素基因。抗四環素基因基因里有單一Bam HI,Hind III,Sal I酶切位點。抗氨芐青霉素基因里有單一的Pst I酶切位點。帶有一個復制起始位點，在大腸桿菌里高拷貝存在。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室舉例：pUC19多克隆位點。含有一個氨芐青霉素抗性基因藍白斑篩選重組體。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室舉例：酵母質粒載體 它既可在大腸桿菌中復制與擴增，又可以在酵母系統中復制與擴增，故又可稱為穿梭質粒(shuttle vector)。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室選擇酵母載體應考慮的因素：有適當的大腸桿菌和酵母遺傳標志。考慮在酵母中的復制方

25、式。在酵母和大腸桿菌中的拷貝數。簡單易行的篩選插入物的方式。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室酵母質粒載體種類酵母整合型質粒(Yeast intergrating plasmids,YIp)酵母附加體質粒(Yeast episomal plasmid,YEp)酵母的復制型質粒(Yeast replicating plasmid,YRp)酵母著絲粒質粒(Yeast centromere plasmids,YCp)酵母絲狀質粒(Yeast linear plasmid,YLp)酵母表達載體(Yeast expression vector)中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室酵母表達載體通過酵

26、母表達載體，使外源基因在酵母內表達，產生人們所需的蛋白質。載體包括有效的啟動子序列（誘導性或組成性）、目的基因cDNA和轉錄終止子）產品：乙肝疫苗，胰島素，水蛭素等。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室舉例：農桿菌質粒載體1、根癌農桿菌Ti質粒一般特性： 是土壤微生物根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) 中的天然質粒，通過植物傷口，可以侵染廣泛的雙子葉植物，最終誘導植物傷口組織的增生形成冠癭瘤，并在冠癭瘤里合成冠癭堿。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室農桿菌誘導Ti質粒誘導冠癭瘤的形成植物DNAT-DNA農桿菌Ti質粒T-DNA冠癭瘤中國農業大學食品學院采后生

27、物技術實驗室冠癭瘤是農桿菌唯一的碳源和氮源，其他生物不能利用。冠癭堿包括章魚堿和胭脂堿。Ti質粒也分為章魚堿型和胭脂堿型中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室Ti質粒的重要區域：1.T-DNA（transfer DNA）區域2.vir區域：毒性區3.吸收和利用冠癭堿的區域4.其他區域中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室Ti質粒改造原則：保留T-DNA的轉移功能。取消T-DNA的致瘤性，使之不干擾植株細胞的正常生長和分化。通過簡便的手段可使外源DNA插入DNA之中，并隨T-DNA整合到植物染色體上。Vir區域和T-DNA區域可以不在一個質粒上。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室表達載體pB

28、I121-leCTR3示意圖中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室農桿菌質粒載體轉化的優點：寄主范圍廣。操作簡單。轉化頻率高和可重復性高。目的基因能完整的轉入受體細胞，整合到植物染色體中，并符合孟德爾定律。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室2、發根農桿菌Ri質粒 發根農桿菌侵染大多數雙子葉植物，并在傷口處引起植物細胞迅速擴增，形成大量根毛。 Ri質粒在結構和功能上和Ti質粒上具有一定的共性。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室3、植物病毒載體花椰菜花葉病毒(CaMV)雀麥條紋病毒(BMV)雙子座病毒(GV)中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室（二）噬菌體載體可作為載體，插入10-20k

29、b甚至更大的外源DNA片段，用于構建基因文庫，加上很強的增殖能力，有利于基因的克隆。噬菌體是寄生在細菌中的病毒，又稱細菌病毒。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室（二）噬菌體載體形態結構頭部蛋白質DNA+內部蛋白質尾環尾心尾鞘尾盤尾針尾纖絲中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室1、 噬菌體生命周期溶菌期溶源期噬菌體進入裂解循環，使宿主細胞發生裂解，同時釋放大約100個噬菌體顆粒。噬菌體進入溶源循環，注入的DNA整合到大腸桿菌染色體中，與染色體一起復制，不危害寄主。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室一種線狀雙鏈分子，長50kb，60多個基因DNA分子包含3個部分左臂：構成頭部和尾部外殼蛋白

30、基因。中臂：非必需區，可用于改造。右臂： DNA復制和溶菌有關的蛋白編碼基因。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室被改造過的噬菌體載體一種置換型載體，是可被外源DNA置換的噬菌體非必需區兩側有一隊限制性酶切位點的載體。一種插入型載體，是只含有一個限制性位點可供插入外源DNA的載體。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室噬菌體包裝過程頭前體多連體DNAcos中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室2、M13載體是一種絲狀的特異性大腸桿菌噬菌體，又叫單鏈噬菌體載體。含有6kb-7kb的單鏈環狀DNA基因組。感染細菌后呈雙鏈復制型DNA。用途：DNA序列分析。制備雜交探針。定點突變中國農業大學食品學

31、院采后生物技術實驗室特性：允許包裝大于病毒單位長度的外源DNA。感染細菌后，復制環狀DNA經包裝形成噬菌體顆粒，分泌到細胞外而不溶菌。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室（三）粘粒質粒載體 粘粒是一種含有噬菌體cos區域、抗性基因、單一克隆位點的質粒載體。 它能容納35-45kb的外源DNA，是構建真核生物基因文庫的重要載體。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室第四節 基因工程的基本技術（一）目的基因的獲得基本概念： 插入到載體內的非自身DNA片段稱為“外源基因”(foreign gene)。 目的基因(objective gene)，又叫靶基因(target gene)，是根據基因的目的

32、和設計所需要的某些DNA分子片段，含有一種或幾種遺傳信息的全套密碼。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室1、鳥槍法染色體DNA大量基因片段連接到載體轉入受體菌基因文庫篩選單一菌落DNA分離和分析基本過程物理化學繁殖中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室2、物理化學法 利用核酸DNA雙螺旋之間存在著堿基G和C配對、A和T配對的特性，從生物基因組分離目的的方法。密度梯度離心法：單鏈酶法：分子雜交法：中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室3、化學合成法4、酶促逆轉錄合成法利用逆轉錄酶有mRNA逆轉錄合成基因的方法。酶促cDNA合成的方法（1，2法見課本，3法用RNA酶H）中國農業大學食品學院采后生

33、物技術實驗室提取組織mRNA互補DNA（cDNA）雙鏈cDNA連接到載體轉入受體菌cDNA文庫篩選單一菌落DNA分離和分析中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室5、PCR擴增法聚合酶鏈式反應：Polymerase Chain Reaction, PCRPCR技術由Cetus公司Mullis等人開發的專利技術。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室快速，簡便，高度專一性和靈敏度。特點用途生物學，醫學，考古學，人類學等。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室反應體系：引物：20個堿基Taq酶dNTPDNA模板反應buffer：Mg2+中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室PCR反應基本過程：變性：

34、高溫下使DNA分子解鏈。退火：降溫使DNA分子重新配對，引物與模板結合。延伸：72 下，Taq酶作用，合成DNA分子30循環中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室改進PCR：逆轉錄PCR：錨定PCR反向PCR中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室（二）DNA序列測定 是指對某一段DNA分子或片段的核苷酸排列順序測定，即測定組成DNA分子的A、T、G、C的排列順序。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室測序方法化學降解法酶促法自動測序法中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室（三）目的基因與載體的連接 所謂基因重組(gene recombination)，就是利用限制性內切酶和其他一些酶類，切割和

35、修飾載體DNA和目的基因，并將兩者連接起來的過程。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室目的基因的獲取連接到載體轉化轉化基因克隆基因表達篩選中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室1、亞克隆 把DNA片段從某一類型的載體無性繁殖到另一類型載體，如從重組的 噬菌體克隆到質粒，或從某種質粒克隆到另一種質粒，這種過程稱為亞克隆(sub-cloning)。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室亞克隆用到的末端形式改變方法：3凹端補平：3突出端切除：平端加接頭：補成粘性末端完全補平S1核酸酶Klenow大片段中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室2、粘性末端連接同一限制性內切酶位點連接方向隨機性載體自連多

36、連體的形成中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室不同限制性內切酶位點連接方向的唯一性載體不會自連沒有多連體現象同裂酶和同尾酶的使用中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室3、平端連接內切酶如Hae III、Hpa I等切割產生平齊末端。特殊情況下補平或切平。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室連接效率低載體自連多連體方向隨機特點任意兩個平端均可連接中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室4、人工接頭 人工接頭是人工合成的具有特定限制性內切酶識別和切割序列的雙股平端DNA短序列，將其接在目的基因片段和載體DNA上，使它們具有新的內切酶位點。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室5、同聚物加尾連接是

37、利用同聚物序列之間的退火作用完成的連接。利用末端轉移酶雜DNA3端添加同聚物。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室（四）重組DNA向受體的轉化基因克隆的實質目的基因重組體受體菌的擴增目的基因的大量復制中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室重組DNA轉入受體細胞的方法：1、細菌轉化 是指裸露的（或經過純化的）DNA被細菌吸收而導致基因轉移的現象。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室 凡是能吸收游離DNA片段的細胞，稱為感受態細胞(competent cell)，或者說細胞處于感受態。正常生長條件下處于感受態。經過特殊處理才表現為感受態。對轉化表現為強烈抵制。中國農業大學食品學院采后生物技術實

38、驗室2、磷酸鈣沉淀法 利用磷酸鈣-DNA共沉淀，把外源基因與 噬菌體DNA分子的重組體導入大腸桿菌和哺乳動物細胞，簡稱為磷酸鈣沉淀法。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室3、體外包裝轉染法 用未經包裝的病毒DNA所引起的轉化，特稱為轉染。重組體噬菌體導入細胞體外包裝浸染細菌中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室4、共轉化 將外源基因與報告基因共同導入感受態真核細胞的方法，稱為共轉化。 整合有報告基因的細胞極易識別和篩選出來，可以確定細胞內是否存在外源基因。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室5、電轉化法 也稱電穿孔法，即在受體細胞上施加短暫、高壓的電流脈沖，是質膜形成納米大小的微孔，DNA

39、能直接通過這些微孔，或者作為微孔閉合時所伴隨發生的膜組分重新分布而進入細胞質中。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室6、基因槍法 它是將DNA分子吸附在由鎢或金制作的微型子彈（直徑約1m）表面，通過特制的基因槍，將子彈高速射入完整的細胞和組織內。彈藥槍電子槍高壓氣體槍中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室7、顯微注射法 又稱微注射法，是創造轉基因動物的有效途徑。外源基因的制備收集受精卵顯微注射植入母體內孕育中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室顯微注射示意圖中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室優點：可向任何類型細胞導入外源基因。DNA用量極少。注入細胞

40、的DNA分子數可加以控制。整合效率可達50%-100%中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室8、脂質體導入法 將DNA或RNA包埋于脂質體內，然后進行脂質體與細胞膜的融合，通過融合導入細胞。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室9、轉化酵母菌醋酸鋰法中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室（五）植物細胞轉化技術 植物細胞轉化技術是指將重組DNA通過生物、物理、化學的方法導入植物細胞以獲得轉基因植物的技術。重組DNA載體轉化法基因直接轉化法中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室載體轉化法1、農桿菌介導的基因轉化1983年1月，比利時的Montagu M. V和美國的Frally R.首先報道。是目

41、前應用最廣泛、最成功的轉基因技術。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室2、病毒衍生載體轉化優點缺點載體比較小，便于操作高效率感染植物細胞高水平表達外源基因載體容量有限沒有證據表明是否能整合到植物基因中外源基因遺傳不穩定中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室3、載體轉化的具體方法創傷植株感染法原生質體共培養法葉盤法中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室植物細胞外源基因的直接轉化法 是指不需要載體，而利用物理、化學的方法將外源基因導入受體植物細胞的技術。 在單子葉植物的基因轉移中應用較多。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室1、電擊法2、基因槍法3、激光微束穿孔法4、細菌圓球體融合法5、多聚物

42、介導法：PEG法6、花粉管通道法中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室（六）重組體的篩選與外源基因的鑒定 區分轉化細胞和非轉化細胞，淘汰未轉化細胞。抗除草劑基因抗生素抗性基因：卡那霉素重組體的篩選中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室轉基因檢測1、報告基因的檢測法報告基因和目的基因一起被轉入受體細胞。報告基因是受體細胞本身基因組中不存在的。具有易于檢驗的表型。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室（1）GUS基因大腸桿菌的 葡萄糖苷酶基因D-glucuronidase,GUS5-溴-4-氯-3-吲哚-D-葡萄糖醛酸水解產物酶（藍色）（無色）中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室（2）NPTII

43、基因細菌轉座子Tn5的新霉素磷酸轉移酶基因。-32P-dCTP新霉素-32P中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室（3）CAT基因細菌轉座子的氯霉素乙酰轉移酶基因。乙酰輔酶A14C氯霉素酶放射性的乙酰氯霉素中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室（4）NOS基因農桿菌Ti質粒上的胭脂堿合成酶基因。胭脂堿紫外光下直接檢測中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室（5）LUC基因和GFP基因熒光素酶基因(luciferase)可轉化植株發出微弱的光，用靈敏儀器或-光片可直接檢測。水母的綠色熒光蛋白(green fluorescence protein)基因產物經一定波長紫外光照射可激發出綠色熒光。中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室2、PCR檢測法從待檢植株DNA中是否能擴增出目的基因片段。陽性對照：質粒DNA陰性對照：非轉基因植株DNA陰性對照：空白對照快速，靈敏，簡便假陽性多，易污染特點中國農業大學食品學院采后生物技術實驗室3、分子雜交檢測方法探針的制備 基因探針(probe)是一段與目的基因互補的核酸序列，它可以是DNA，也可以是RNA，通過與待冊測樣品DNA或