1、 發酵過程及控制 第五章 發酵過程及控制第一節 發酵方式 第二節 發酵動力學 第三節 發酵過程主要影響因素及控制 第四節 發酵過程檢測和自控 第五節 發酵終點的判斷 第一節 發酵方式 一、概述 發酵原本是指在厭氧條件下葡萄糖通過酵解途徑生成乳酸或乙醇等的分解代謝過程。現在從廣義上將發酵看作是微生物把一些原料養分在合適的發酵條件下經過特定的代謝轉變成所需產物的過程。微生物具有合成某種產物的潛力，但要想在生物反應器中順利實現以最大限度地合成所需產物卻并不容易。發酵是一種很復雜的生化過程，其好壞涉及諸多因素。最基本的是取決于生產菌種的性能，但有了優良的菌種之后，還需要有最佳的環境條件即發酵工藝加以配

2、合，才能使其生產能力充分表現出來。 第一節 發酵方式 二、分批發酵 1.分批發酵的理論基礎 分批發酵是指在一個密閉系統內投入有限數量的營養物質后，接入少量的微生物菌種進行培養，使微生物生長繁殖，在特定的條件下只完成一個生長周期的微生物培養方法。該方法在發酵開始時，將微生物菌種接入已經滅菌的培養基中，在微生物最適宜的培養條件下進行培養，在整個培養過程中，除氧氣的供給、發酵尾氣的排出、消泡劑的添加和控制pH需加入的酸或堿外，整個培養系統與外界沒有其他物質的交換。分批培養將細胞和培養液一次性裝入反應器內，進行培養，細胞不斷生長，產物也不斷形成，經過一段時間反應后，將整個反應系取出。分批培養的特點是操

3、作簡單，易于掌握，因而是最常見的操作方式。9.1多Agent系統簡述第九章 多Agent系統of315弱定義：Agent一般用以說明一個軟硬件系統。它具有自治性，社會性，反映性，能動性等特性。9.1.1概念1.Agent強定義：Agent不僅具有以上的特性，而且具有知識、信念、義務、意圖等人類才具有的特性。強定義更加強調人格化概念的Agent的心智要素。一般而言，可以認為Agent是一個能夠感知外界環境并具有自主行為能力的以實現其設計目標的自治系統。它運行于復雜和不斷變化的動態環境中，能有效地利用環境中各種可以利用的數據、知識、信息和計算資源，準確理解用戶的真實意圖，為用戶提供迅捷、準確和滿意

4、的服務。9.1多Agent系統簡述第九章 多Agent系統of316關于MAS，百度百科給出的定義是由多個Agent組成的集合，其多個Agent成員之間相互協調，相互服務，共同完成一個任務。它的目標是將大而復雜的系統建設成小的、彼此互相通信和協調的，易于管理的系統。2.多Agent系統（MAS）MAS作為解決復雜系統的一個有效方法，能夠利用并行分布式處理技術和模塊化設計思想，把復雜系統劃分成相對獨立的Agent子系統，通過Agent之間的共同協作來完成對復雜問題的求解。在一個MAS中，各Agent成員之間是獨立自主的，其自身的目標和行為不受其它Agent成員的限制，可以采用不同的設計方法和計算

5、機語言開發而成，沒有全局數據，也沒有全局控制，是一種開放的系統，Agent加入和離開都是自由的。9.1多Agent系統簡述第九章 多Agent系統of317MAS的體系結構是指MAS中Agent間的信息關系和控制關系，以及問題求解能力的分布模式，通過定義Agent之間的權威關系，為Agent提供了一種交互框架。9.1.2 MAS的結構MAS的體系結構可以有三種形式：集中式、分布式和混合式。（1）集中式結構（2）分布式結構（3）混合式結構9.1多Agent系統簡述第九章 多Agent系統of318MAS用于解決實際問題，其特性因為應用的不同領域而有所不同，主要有以下一些特點：9.1.3特點及分類

6、1.特點（1）由于Agent可以是不同的個人或組織采用不同的設計方法和計算機語言開發而成，因而可能是完全異質和分布的；（2）在MAS中，每個Agent是自治的，各自按照自己的方式異步地運行自己的進程，解決給定的子問題，自主地推理和規劃并選擇適當的策略，并以特定的方式影響環境；（3）MAS支持分布式應用，具有良好的模塊性、易于擴展、設計靈活簡單。在其實現過程中，不追求單個龐大復雜的體系，而是按面向對象的方法構造多層次，多元化的Agent以降低各個Agent問題求解的復雜性從而降低整個系統的復雜性；（4）MAS是一個集成系統，各Agen之間互相通信彼此協調，并行地求解問題，能有效地提高問題求解的能

7、力；（5）多Agent技術打破了人工智能領域僅僅使用一個專家系統的限制，在MAS環境，各領域的不同專家可能協作求解某一個專家無法解決或無法很好解決的問題，提高系統解決問題的能力。 9.1多Agent系統簡述第九章 多Agent系統of3199.1.3特點及分類2.分類（1）根據Agent的自主性分類1）由控制Agent和被控Agent構成的系統：Agent之間存在較強的控制關系，每個Agent或對其他Agent具有控制作用，或受控于對它具有權威的Agent。在這類系統中，被控Agent的行為受到約束，自主程度較低。2）自主Agent構成的系統：Agent自主地決策，產生計劃，采取行動。Agen

8、t之間具有松散的社會性聯系。Agent通過與外界的交互，了解外部世界的變化，并從經驗中學習增強其求解問題的能力以及與相識者建立良好的協作關系。在這類系統中，自主Agent之間的協作關系是互惠互利的關系，當目標發生沖突時，通過協商來解決。3）靈活Agent（即半自主的Agent）構成的系統：Agent進行決策時，某些問題在一定程度上需要受控于其他Agent，大部分情況下要求Agent完全自主地工作。在這類系統中，Agent之間通常是松散耦合，具有一定的組織結構，通過承諾和組織約束相互聯系。9.1多Agent系統簡述第九章 多Agent系統of31109.1.3特點及分類2.分類（2）根據對動態性

9、的適應方法分類 1）系統拓撲結構不變，即Agent數目、Agent之間的社會關系等都不變。Agent內部結構固定，基本技能不變，通過重構求解問題的方式來適應環境；Agent通過自重組來適應環境，例如修改調整自己的知識結構、目標、選擇等。 2）系統拓撲結構改變Agent數目不變，每個Agent的微結構穩定，可以修改Agent間的關系和組織形式；可增減Agent數目，可以動態創建和刪除Agent。9.1多Agent系統簡述第九章 多Agent系統of31119.1.3特點及分類2.分類（3）根據系統功能結構分類 1）同構型系統，即每個Agent功能結構相同； 2）異構型系統，Agent的結構、功能

10、、目標都可以不同，由通信協議保證Agent間協調與合作的實現。（4）根據Agent關于世界知識的存儲分類 1）反應式多Agent系統； 2）黑板模式的多Agent系統； 3）分布存儲的多Agent系統。（5）根據控制結構分類 1）集中控制：由一個中心Agent負責整個系統的控制、協調工作； 2）層次控制：每個Agent控制處于其下層的Agent的行為，同時又受控于其上層的其他Agent； 3）網絡控制：由信息傳遞構成的控制結構，且該控制結構是可以動態改變的，可以實現靈活控制。第一節 發酵方式 分批培養過程中隨著培養基中營養物質的不斷減少，微生物生長的環境條件也隨之不斷變化，不能使細胞自始至終處

11、于最優條件下。因此，微生物分批培養是一種非穩態的培養方法。但是在培養基接種后只要維持一定溫度，對于好氣培養過程則還需進行通氣攪拌，在培養過程中，培養液中的細胞濃度、基質濃度和產物濃度不斷變化，但有一定規律。分批發酵是一種準封閉式系統，種子接種到培養基后除了氣體流通外發酵液始終留在生物反應器內。 第一節 發酵方式 在此簡單系統內所有液體的流量等于零，故由物料平衡，得式(5-1) 式（5-3）的微分方程 dX/dtX （5-1） dS/dt=-qsX （5-2） dP/dtqPX （5-3）式中 X菌體濃度，g /L; t培養時間，h; 比生長速率，h-1； S基質濃度，g/L; qs比基質消耗速

12、率，g（gh）； P產物濃度，g/L; qP比產物形成速率，g（gh）。第一節 發酵方式 以上由細胞生長、基質消耗和產物生長的微分方程構成的微分方程組，反映了分批發酵中細胞、基質和產物濃度的變化情況。對各種不同的微生物分批發酵過程，通過實驗研究這三個參數的變化規律，建立適當的微分方程組，就可以對分批發酵進行模擬，進而進行優化控制，最終達到提高生產效率的目的。 分批發酵過程一般可粗分為四期：即適應期（也有稱停滯期或延滯期的）、對數（指數）生長期、生長穩定期和死亡期；也可細分為六期：即停滯期、加速期、對數期、減速期、靜止期和死亡（衰亡）期，如圖5-1所示。 第一節 發酵方式 圖5-1 分批培養中的

13、微生物的典型生長曲線 第一節 發酵方式 （1）在停滯期（） 即剛接種后的一段時間內，細胞不生長，細胞數目和菌量基本不變，這是由于菌對新的生長環境有一適應過程，其長短主要取決于種子的活性、接種量和培養基的可利用性以及濃度。菌齡短的菌種停滯期也短，在對數生長期接種停滯期最短，種子老化會使停滯期延長。帶培養液接種比種子經分離培養液后接種的延滯期要短，但帶培養液的種子易老化，不易保藏。對于經分離后的濃縮種子，若在接種時添加適量的培養濾液，則可縮短延滯期。此外，對有些微生物培養在接種時添加某種激活劑可大大縮短延滯期。菌齡相同的菌種，則接種量越大，停滯期越短，而培養基的濃度對停滯期的長短影響不大。 第一節

14、 發酵方式 停滯期的長短，差別很大，短的幾乎覺察不到，瞬間即可完成，而長的要在接種后23天才開始生長。種子一般應采用對數生長期且達到一定濃度的培養物，該種子能耐受含高滲化合物和低CO2分壓的培養基。工業生產中從發酵產率和發酵指數以及避免染菌考慮，希望盡量縮短適應期。 （2）加速期（） 加速期（）通常很短，大多數細胞在此期的比生長速率在短時間內從最小升到最大值。如這時菌已完全適應其環境，養分過量又無抑制劑便進入恒定的對數或指數生長期()。第一節 發酵方式 （3）指數生長期() 在這一階段，由于培養基營養物質豐富，有毒代謝物少，細胞生長不受限制，所以細胞濃度隨培養時間呈指數增長，可用方程(5-1)

15、表示，將其積分，再取自然對數得式 lnXt1nXot (5-4)式中 X。菌的初始濃度； Xt經過培養時間t的菌體濃度。 將菌體濃度的自然對數與時間（lnXt t） 作圖可得一直線，其斜率為，即比生長速率。比生長速率與微生物種類、培養溫度、pH、培養基成份及限制基質濃度等因素有關。在對數生長期，細胞的生長不受限制，因此，在對數生長期的比生長速率達最大，可用max表示。 第一節 發酵方式 一些微生物如產黃青霉、構巢曲霉、甲烷加單孢霉、貝內克氏菌的典型max值分別為（0.12、0.36、0.53、4.24）h-1。對數生長期的長短主要取決于培養基，包括溶氧的可利用性和有害代謝產物的積累。 （4）減

16、速期（） 在指數生長期，隨著細胞的大量繁殖，培養基中養分的迅速減少，有害代謝物的逐漸積累，細胞的比生長速率逐漸下降，即進入減速期（）。細胞的生長不可能再無限制地繼續，這時比生長速率成為養分、代謝產物和時間的函數，常用Monod方程表示。當限制性基質濃度很低時，增加該基質濃度能顯著提高細胞的比生長速率，否則就不明顯。 第一節 發酵方式 （5）靜止期（V） 靜止期（V），因營養物質耗盡，有害物質大量積累，細胞的濃度達到最大值，不再增加。實際上是一種生長和死亡的動態平衡，凈生長速率等于零，即，式中為比死亡速率。由于此期菌體的次級代謝十分活躍，許多次級代謝物在此期大量合成，菌的形態也發生較大的變化，如

17、菌已分化、染色變淺、形成空胞等。當養分耗竭，對生長有害代謝物在發酵液中大量積累便進入死亡期（VI）。 （6）死亡期（VI） 在死亡期（VI），細胞開始死亡，活細胞的濃度不斷下降，這時，生長呈負增長。工業發酵一般不會等到菌體開始自溶時才結束培養。發酵周期的長短不僅取決于前面五期的長短還取決于菌的初始濃度X0。 第一節 發酵方式 2. 重要的生長參數 分批培養中基質初始濃度對菌的生長的影響如圖5-2所示:圖5-2 分批培養中基質初始濃度對菌生長的影響第一節 發酵方式 （1）得率系數Y 在濃度較低的（A-B）范圍內，靜止期的細胞濃度與初始基質濃度成正比，可用式(5-5)表示 XY（So一St） (5

18、-5)式中 so初始基質濃度，g/L; st經培養時間t時基質濃度； Y得率系數，g細胞/g基質在A-B的區域，當生長停止時，st等于零。方程(5-5)可用于預測用多少初始基質便能得到相應的菌量。 （2）比生長速率 在C-D的區域，菌量不隨初始基質濃度的增加而增加。這時菌體的進一步生長受到積累的有害代謝物的限制。用Monod方程可描述比生長速率和殘留的限制性基質濃度之間的關系 max s（KsS） (5-6)第一節 發酵方式式中 比生長速率，h-1； max最大比生長速率，h-1； S基質濃度，g/L; Ks基質利用常數，相當于max /2時的基質濃度，g/L，是菌對基質的親和力的一種度量。

19、分批培養中后期基質濃度下降，代謝有害物積累，已成為生長限制因素，產值下降。其快慢取決于菌體對限制性基質的親和力大小，Ks小，對的影響較小，當St接近0時，急速下降；Ks大，隨St的減小而緩慢下跌，當st接近0時，才迅速下降到零，見圖5-3。第一節 發酵方式 圖5-3 分批發酵過程中的若干重要參數的變化 第一節 發酵方式 3.分批發酵的優缺點 分批發酵在工業生產上占有重要地位。分批培養的優點是：周期短，培養基一次滅菌，一次投料，容易實現無菌狀態；操作簡單，易于操作控制，產品質量穩定；培養濃度較高，易于產品分離。但是分批培養的輔助時間較多，設備生產能力低。在目前國內外絕大多數發酵生產中，都是采用分

20、批培養的方法。第一節 發酵方式 若細胞本身為產物，可采用能支持最高生長量的培養條件；以初級代謝物為產物的，可設法延長與產物關聯的對數生長期；對次級代謝物的生產，可縮短對數生長期，延長生產（靜止）期，或降低對數期的生長速率，從而使次級代謝物更早形成。但分批發酵不適用于測定其過程動力學，因使用復合培養基，不能簡單地運用Monod方程來描述生長，存在基質抑制問題，出現二次生長現象。對基質濃度敏感的產物，或次級代謝物，如對基質濃度敏感的產物，或次級代謝物，比如抗生素，用分批發酵不合適，因其周期較短，一般在12天，產率較低。這主要是由于養分的耗竭，無法維持下去。據此，發展了補料-分批發酵。第一節 發酵方

21、式 三、補料（流加）分批發酵 1.補料-分批發酵理論基礎 補料-分批發酵是指先將一定量的培養液裝入反應器，在適宜的條件下接種細胞，進行培養，細胞不斷生長，產物也不斷形成。隨著細胞對營養物質的不斷消耗，向反應器中不斷補充新的營養成分，使細胞進一步生長代謝，克服由于養分不足，導致發酵過早結束，到反應終止時取出整個反應系。流加培養是介于分批培養過程與連續培養過程之間的一種過渡培養方法。 第一節 發酵方式 一般出現在下列兩種情況中：一種情況是培養過程中的主要底物是氣體；另一種情況是存在底物抑制。若底物是氣體，如甲烷發酵，則不可能將底物一次加入，只能在培養過程中，連續不斷地通入。對于存在底物抑制的培養系

22、統，采用連續流加培養基的方法，可使發酵液中一直保持較低的底物濃度，從而解除底物抑制。目前國內外的酵母生產行業大多采用這種操作方法。第一節 發酵方式 目前補料-分批培養已在發酵工業上普遍用于氨基酸、抗生素、維生素、酶制劑、單細胞蛋白、有機酸以及有機溶劑等的生產過程。目前補料-分批發酵的類型很多，就補料的方式而言，有連續補料、不連續補料和多周期補料；每次補料又可分為快速補料、恒速補料、指數速度補料和變速補料；按反應器中發酵液體積區分，又有變體積和恒體積之分；從反應器數目分類又有單級和多級之分；從補加的培養基成分來分，又可分為單一組分補料和多組分補料。 第一節 發酵方式 流加培養的特點就是能夠調節培

23、養環境中營養物質的濃度。一方面，它可以避免某些營養成分的初始濃度過高而出現底物抑制現象；另一方面，能防止某些限制性營養成分在培養過程中被耗盡而影響細胞的生長和產物的形成，這是流加培養與分批培養的明顯不同。由于新鮮培養液的加入，整個過程中反應體積是變化的，這是它的一個重要特征。 根據不同情況，存在不同的流加方式。從控制角度可分為無反饋抑制流加和有反饋抑制流加兩種。無反饋抑制流加包括定量流加和間斷流加等。有反饋抑制流加，一般是連續或間斷地測定系統中限制性營養物質的濃度，并以此為控制指標，來調節流加速率或流加液中營養物質的濃度等。第一節 發酵方式 若只有料液的輸入，沒有輸出，發酵液的體積在增加。若分

24、批培養中的細胞生長受一種基質濃度的限制，則在任一時間的菌濃可用下式表示：XtX0Y（S0-St） (5-7)式中 X0，菌的初始濃度，g/L; Xtt時菌的濃度，g/L; S0初始基質濃度，g/L; Stt時基質濃度，g/L; 若st0，則其最終菌濃為Xmax，只要X0Xmax Xmax YS0 (5-8) 第一節 發酵方式 如果當XtXmax時開始補料，其稀釋速率Dmax，實際上當基質一進入培養液中很快便被耗竭，故可得輸入的基質等于細胞消耗的基質。雖培養液中的總菌量XT隨時間的延長而增加，但細胞濃度Xt并未提高，因此D。這種情況稱為準穩態。隨時間的延長，D將隨體積的增加而減少，D可用下式表達

25、 DF/（V0Ft） （5-9）式中 V0發酵液原來的體積L； D稀釋速率L-1； t補料時間h； F補料流速L/h； Vt時發酵液體積L， V= V0Ft.第一節 發酵方式 因此，按Monod方程，殘留的基質應隨D的減小而減小，導致細胞濃度的增加。但在的分批-補料操作中S0Ks因此，在所有實際操作中殘留基質濃度的變化非常小，可當作是零。故只要D max; Ks S0便可達到準穩態，恒化器的穩態和補料-分批發酵的準穩態的主要區別在于恒化器的是不變的，而補料-分批發酵的是降低的。補料-分批發酵的優點在于它能在這樣一種系統中維持很低的基質濃度，從而避免快速利用碳源的阻遏效應和能夠按設備的通氣能力去

26、維持適當的發酵條件，并且能減緩代謝有害物的不利影響。第一節 發酵方式 2分批-補料的優化 為了獲得最大的產率，需采取優化補料的策略。可以從實際分批-補料培養中改變補料的速率，如邊界控制實現。在分批培養的前期應維持在其最大值，max；下一階段應保持在臨界c上。這種控制策略可理解為細胞生長和產物合成的兩階段生產步驟。Shioya（1992）將生物反應器的優化分為三個步驟，如圖5-4所示，即過程的建模、最佳解法的計算和解法實現。為此，需考慮模型與真實過程之間的差異和優化計算的難易。在建模階段出現的問題之一是怎樣定量描述包括在質量平衡方程中的反應速率。第一節 發酵方式 圖5-4 生物反應器優化的三個步

27、驟 第一節 發酵方式 Shioya等對分批培養進行優化和控制的方法如圖5-5所示，用一模型鑒別和描述比生長速率與比生產速率之間的關系，藉最大原理獲得比生長速率的最佳策略和這一策略的實現。 圖5-5 分批培養中實現最佳生產的方法 第一節 發酵方式 在建模階段擬解決的問題之一是定量描述物料平衡中的以基質、產物等濃度表示的各反應速率。分批培養中的最大的目標是在一定的運轉時間tf下使產量最大化。比生產速率，在此被看做是決定性變量，其變化取決于基質補料速率的變化，是過程的重要參數之一，表征生物反應器的動態特性。為了獲得最大的細胞產量，應在培養期間使產值最大。為此，應使培養基中的糖濃度保持在一最適范圍。如

28、沒有現成的在線葡萄糖監控儀，可控制發酵過程中CO2呼吸商RQ值和乙醇濃度。但應強調指出，RQ和乙醇濃度的控制只能用于使比生長速率最大化。為了維持分批培養中產值不變，常用一指數遞增的補料策略。這可使生長速率維持恒定，直到得率系數Y減小。故可用補料辦法控制比生長速率。但如果計算補料速率所需的初始條件和參數不對，則比生長速率便根本不等于所需數值。第一節 發酵方式 酵母的生產與代謝不僅取決于是否有足夠的氧，而且與糖的含量有關。當糖含量很低時(0.028%)，在有氧條件下，酵母不產生乙醇，其生長得率可達50%；當糖含量較高時，酵母菌在生長的同時，產生部分乙醇，酵母得率低于50%；而當培養液中的糖含量達5

29、%時，即使在有足夠氧的條件下，酵母菌的生長也會受到抑制，且產生大量乙醇，酵母得率很低。因此，為了獲取較高的生長速率和較高的酵母得率，必須使培養液中糖的含量保持在較低的水平。顯然，采用一次投料的方法是不行的，這樣在發酵的初始階段將會產生大量酒精，影響酵母的生長和收率。采用流加的方法可獲得滿意的結果，在整個發酵過程中，培養液中的糖含量都保持在較低的水平（一般為0.1%0.5%），酵母利用多少就流加多少，流加速率等于酵母的耗糖速率。這樣酵母處在較低糖含量的培養條件下，以較快的速度生長，其酵母的收得率也能取得令人滿意的結果，所以酵母培養采用流加培養。 第一節 發酵方式 釀酒酵母的培養溫度會影響其比生長

30、速率和酸性磷酸酯酶的比生產速率。當溫度低一些，27有利于值；溫度高一些，32.5有利于酸性磷酸酯酶的比生產速率的提高。最終產物濃度與改變溫度的時間（max到c）6h是最適合的。 四、半連續發酵 半連續培養又稱為反復分批培養或換液培養，在補料-分批發酵的基礎上加上間歇放掉部分發酵液（行業中稱為帶放）便可稱為半連續發酵。帶放是指放掉的發酵液和其他正常放罐的發酵液一起送去提煉工段。這是反應器內培養液的總體積保持不變的操作方式。 第一節 發酵方式 這種操作方式可以反復收獲培養液，對于培養基因工程動物細胞分泌有用產物或病毒增殖過程比較適用。例如，采用微載體系統培養基因工程iCHO細胞，待細胞長滿微載體后

31、，可反復收獲細胞分泌的乙肝表面抗原（HBsAg）制備乙肝疫苗。 考慮到補料-分批發酵雖可通過補料補充養分或前體的不足，但由于有害代謝物的不斷積累，產物合成最終難免受到阻遏。放掉部分發酵液，再補入適當料液不僅補充養分和前體而且代謝有害物被稀釋，從而有利于產物的繼續合成。但半連續發酵也有它的不足：放掉發酵液的同時也丟失了未利用的養分和處于生產旺盛期的菌體；定期補充和帶放使發酵液稀釋，送去提煉的發酵液體積更大；發酵液被稀釋后可能產生更多的代謝有害物，最終限制發酵產物的合成；一些經代謝產生的前體可能丟失；有利于非產生菌突變株的生長。據此，在采用此工藝時必須考慮上述的技術上限制，不同的品種應根據具體情況

32、具體分析。第一節 發酵方式 五、連續發酵 連續培養或連續發酵是發酵過程中一邊補入新鮮的料液，一邊以相近的流速放料，維持發酵液原來的體積。使微生物細胞能在近似恒定狀態下生長的微生物發酵培養方式。可以采用罐式或攪拌發酵罐及管式反應器。它與封閉系統中的分批培養方式相反，是在開放的系統中進行的培養方式。在連續培養過程中，微生物細胞所處的環境條件，如營養物質的濃度、產物的濃度、pH以及微生物細胞的濃度、比生長速率等可以自始至終基本保持不變，甚至還可以根據需要來調節微生物細胞的生長速率，因此連續培養的最大特點是微生物細胞的生長速率、產物的代謝均處于恒定狀態，可以達到穩定、高速培養微生物細胞或產生大量的代謝

33、產物的目的。此外，對于細胞的生理或代謝規律的研究，連續培養是一種重要的手段。第一節 發酵方式 連續培養過程可以連續不斷地收獲產物，并能提高細胞密度，在生產中被應用于培養非貼壁依賴性細胞。如英國Celltech公司采用連續培養雜交瘤細胞的方法，連續不斷地生產單克隆抗體。 1.單級連續發酵的理論基礎 在任何連續發酵開始，都要先做分批培養，使微生物在接種后生長繁殖達到一定細胞濃度，并進入產物合成期，然后才開始以恒定流量向發酵罐流加培養基，同時以相同的流量流出培養液，使發酵罐內培養液的體積保持恒定，微生物持續生長，合成產物。 第一節 發酵方式 連續發酵達到穩態時放掉發酵液中的細胞量等于生成細胞量。流入

34、罐內的料液使得發酵液變稀，流量與培養液體積之比可用D來表示，稱為稀釋率（h-1），表示單位時間內加入的培養基體積占發酵罐內培養基體積的分率，其倒數表示培養液在發酵罐內平均停留時間。 DF/V （5-10）式中 D 稀釋率，h-1； F 料液流量，L/h； V 發酵液的體積，L。第一節 發酵方式 在一定時間內細胞濃度的凈變化 dX/dtX-DX （5-11)式中 X生長速率，g /(Lh)； DX細胞排放速率，g /(Lh)。 在穩態條件下dX/dt0，即X=DX，故 =D （5-12） 即在穩態條件下細胞的比生長速率與稀釋率相等，可通過補料速率來控制比生長速率，因V不變。稀釋率大小將有一定限制

35、，即有一臨界稀釋率DC，將式（5-6）max S（KsS） 代入式（5-11），并化簡，得 S=KSD/(max-D) （5-13）第一節 發酵方式 式(5-13)解釋了D如何控制。細胞生長將導致基質濃度下降，直到殘留基質濃度等于能維持D的基質濃度。如基質濃度消耗到低于能支持相關生長速率的水平，細胞的丟失速率將大于生成的速率，這樣基質濃度S將會提高，導致生長速率的增加，平衡又恢復。 連續培養系統又稱為恒化器，培養物的生長速率受其周圍化學環境影響，即受培養基的一種限制性組分控制。設備的差異，如混合不全；菌貼罐壁和培養物的生理因素，如若干基質用于維持反應和在高稀釋速率下基質的毒性等造成恒化器的實驗

36、結果可能與過去理論預測的結果不同。第一節 發酵方式 2多級連續培養 基本恒化器的改進有多種方法，但最普通的辦法是把多個發酵罐串聯起來，第一罐類似單罐培養，以后下一級罐的進料即為前一發酵罐的出料，這樣就組成了多級串聯培養（多級恒化系統）。多級恒化系統見圖5-6。多級恒化器的優點是在不同級的罐內存在不同的條件。這將有利于多種碳源的利用和次級代謝物的生產。提高生產能力。如采用葡萄糖和麥芽糖混合碳源培養產氣克雷伯菌第一級罐內只利用葡萄糖，在第二級罐內利用麥芽糖，菌的生長速率遠比第一級小，同時形成次級代謝產物。由于多級連續發酵系統比較復雜，用于研究工作和生產實際有較大的困難。 第一節 發酵方式 由于恒化

37、器運行中將部分菌體返回罐內，從而使罐內菌體濃度大于簡單恒化器所能達到的濃度，即Y（S0一St）。可通過以下兩種辦法濃縮菌體：限制菌體從恒化器中排出，讓流出的菌體濃度比罐內的小；將流出的發酵液送到菌體分離設備中，如讓其沉積或將其離心，再將部分濃縮的菌體送回罐內。 圖5-6多級恒化器示意圖 第一節 發酵方式 這種方法相當于不斷接種，增加了罐內的菌體濃度；導致殘留基質濃度比簡單恒化器小；菌體和產物的最大產量增加；臨界稀釋率也提高。菌體反饋恒化器能提高基質的利用率，可以改進料液濃度不同的系統的穩定性，適用于被處理的料液較稀的品種，如釀造和廢液處理。 3連續培養在工業生產中的應用 連續培養在產率、生產的

38、穩定性和易于實現自動化方面比分批發酵優越，但污染雜菌的幾率和菌種退化的可能性增加。培養物產率可定義為單位發酵時間形成的菌量。從一批發酵到另一批發酵的間隔時間，包括打料、滅菌、發酵周期、放罐等。比如青霉素連續發酵可較分批發酵產量量提高65%。在連續培養中，選取適當的限制性基質，可大大提高產量，例如采用氯或磷代替葡萄糖作為限制性基質，連續生產鏈球菌培養乳酸，其生產速率分別提高4.2及12.8倍。第一節 發酵方式 用紅曲霉發酵生產-半乳糖苷霉時，為防止葡萄糖對半乳糖誘導作用的抑制，可采用二級連續培養，即在第一級罐中加葡萄糖為碳源，以促進菌體生長；第二級用半乳糖誘導霉的生長，可使霉的生長速率提高57%

39、。 用連續培養進行發酵生產，早在20世紀20年代就開始采用連續培養法生產飼料酵母，此后，人們對各種連續培養進行了大量的研究工作。雖然有關酵母、真菌、細菌、放線菌、原核生物、藻類等各種微生物連續培養的報道很多，但大多數都是試驗性的，而不是大規模的工業化生產。到目前為止，有關工業化的連續培養生產有以下幾個方面。 第一節 發酵方式 （1）酵母、細菌等單細胞蛋白產品 20世紀20年代開始采用連續培養法生產飼料酵母，這是最早的單細胞蛋白產品。目前，由造紙廠亞硫酸鹽廢液連續培養生產飼料酵母較為普遍。到20世紀50年代末，以糖蜜為原料連續培養生產藥用酵母和面包酵母的工業開始形成。由于酵母菌的生長受糖濃度的抑

40、制，當糖濃度較高時，酵母進行有氧代謝產生大量酒精，從而使酵母得率下降。一般采用25個反應器串聯，在各反應器中同時連續流加糖液，從第一個反應器開始，酵母濃度逐漸增高，但各反應器中糖的濃度卻基本保持一致。與批式流加培養比較，其設備生產能力可提高50%左右。第一節 發酵方式 （2）酒精、啤酒、醋酸等一次代謝產物 酒精、啤酒、醋酸、葡萄糖酸等一次代謝產物的連續發酵開始于上世紀50年代初。50年代后期，國內外相繼實現了糖蜜制酒精的連續發酵生產。20世紀60年代初，用淀粉質原料連續發酵制造酒精的工業化生產已獲得成功。酒精連續發酵多采用10個左右的反應器串聯，酒精濃度可達10%左右，發酵液的平均停留時間一般

41、不到分批發酵時間的一半，只需30h左右。啤酒連續發酵的流程有多級攪拌罐式、多級塔式和單塔式三種，其中以單塔連續發酵較為多見。塔式啤酒連續發酵的特點是發酵速率高，塔內具有較高的酵母濃度，一般比分批發酵大16倍左右，因此，發酵時間大幅度降低。醋酸的連續發酵生產多采用單級自吸式反應器和塔式反應器。第一節 發酵方式 （3）污水的生化處理 用活性污泥處理廢水普遍采用連續培養的方法。由于廢水中的底物濃度相對較低，因而廢水處理大多采用濃縮細胞部分回流的方法，以提高生物濾池的生產能力。 工業化連續培養應用較為廣泛的國家有德國、加拿大、澳大利亞、新西蘭和美國等。在我國連續培養的研究與生產始于20世紀50年代。目

42、前已實現的有：由造紙廠亞硫酸鹽廢液連續生產飼料酵母，以糖蜜為原料連續生產藥用酵母和酒精，用淀粉質原料生產酒精的連續發酵已被廣泛應用。此外，污水的連續生化處理已被廣泛采用，啤酒和面包酵母的連續發酵已完成了中間試驗。第一節 發酵方式 4.連續培養中存在的問題 與分批發酵比較，連續發酵過程具有許多優點：在連續發酵達到穩態后，其非生產占用的時間要少許多，故其設備利用率高，單位時間產量高。發酵設備以外的外圍設備（如蒸汽鍋爐、泵）的利用率高，可以及時排除在發酵過程中產生的對發酵過程有害的物質。但連續發酵技術也存在一些問題，如雜菌的污染，菌種的穩定性問題。 （1）污染雜菌問題 在連續發酵過程中需長時間不斷地

43、向發酵系統供給無菌的新鮮空氣和培養基，這就增加染菌的機會。盡管可以通過選取耐高溫、耐極端pH值和能夠同化特殊的營養物質的菌株作為生產菌種來控制雜菌的生長。但這種方法的應用范圍有限。故染菌問題仍然是連續發酵技術中不易解決的課題。 第一節 發酵方式 了解雜菌在什么樣的條件下發展成為主要的菌群便能更好地掌握連續培養中雜菌污染的問題。 在分批培養中任何能在培養液中生長的雜菌將存活和增長。但在連續培養中雜菌能否積累取決于它在培養系統中的競爭能力。故用連續培養技術可選擇性地富集一種能有效使用限制性養分的菌種。 （2）生產菌種突變問題 微生物細胞的遺傳物質DNA在復制過程中出現差錯的頻率為百萬分之一。盡管自

44、然突變頻率很低，一旦在連續培養系統中的生產菌中出現某一個細胞的突變，且突變的結果使這一細胞獲得高速生長能力，但失去生產特性的話，它會最終取代系統中原來的生產菌株，而使連續發酵過程失敗。 第一節 發酵方式 而且，連續培養的時間愈長，所形成的突變株數目愈多，發酵過程失敗的可能性便愈大。并不是菌株的所有突變都造成危害，因絕大多數的突變對菌株生命活動的影響不大，不易被發覺。但在連續發酵中出現生產菌株的突變卻對工業生產過程特別有害。因工業生產菌株均經多次誘變選育，消除了菌株自身的代謝調節功能，利用有限的碳源和其他養分合成適應人們需求的產物。生產菌種發生回復突變的傾向性很大，因此這些生產菌種在連續發酵時很

45、不穩定，低產突變株最終取代高產生產菌株。第一節 發酵方式 為了解決這一問題，曾設法建立一種不利于低產突變株的選擇性生產條件，使低產菌株逐漸被淘汰。例如，利用一株具有多重遺傳缺陷的異亮氨酸滲漏型高產菌株生產L一蘇氨酸。此生產菌株在連續發酵過程中易發生回復突變而成為低產菌株。若補入的培養基中不含異亮氨酸，那些不能大量積累蘇氨酸而同時失去合成異亮氨酸能力的突變株則從發酵液中被自動地去除。 六、灌注培養 灌注培養是指細胞接種后進行培養，一方面新鮮培養基不斷加入反應器，另一方面又將反應液連續不斷地取出，但細胞留在反應器內，使細胞處于一種不斷的營養狀態。第一節 發酵方式 當高密度培養動物細胞時，必須確保補

46、充給細胞足夠的營養以及去除有毒的代謝廢物。在半連續培養中，可以采用取出部分用過的培養基和加入新鮮的培養基的辦法來實現。這種分批部分換液辦法的缺點在于當細胞密度達到一定量時，廢代謝物的濃度可能在換液前就達到產生抑制作用的程度。降低廢代謝產物的有效方法就是用新鮮的培養基進行灌注，通過調節灌注速率可以把培養過程保持在穩定的、廢代謝物低于抑制水平的狀態下。一般在分批培養中密度為（24）x 1O6cells/mL，在灌注系統中可達到（24）x 107 cells/mL。灌注技術已經應用于許多不同的培養系統中，規模分別為幾十升至幾百升。第二節 發酵動力學 微生物是發酵培養過程的主體，細胞內有各種酶系，它攝

47、取原料中的養分后，通過體內的特定酶系進行復雜的生化反應，將底物轉化成有用的產品。微生物發酵過程包括微生物的生長、反應基質的消耗和代謝產物的生成，其中細胞的生長是關鍵。發酵動力學是對微生物的生長和產物形成的描述，它研究細胞生長速率和發酵產物的生成速率以及環境條件對這些速率的影響。發酵動力學的研究是了解微生物發酵過程的實質所必需的，通過發酵動力學的研究建立發酵過程的數學模型，從而為發酵過程的工藝設計和管理控制提供理論基礎，達到提高產品的產率即降低成本的目的。第二節 發酵動力學 一、發酵動力學類型 發酵動力學類型是為了描述菌體生長、碳源利用與代謝產物形成速度變化，以及它們之間的動力學關系而建立的。微

48、生物種類繁多，具有氧化、還原、分解、合成、轉換和積累某種產物等多種代謝機能，通常是按微生物需氧的特點來區分發酵類型。一類是需氧性發酵，由好氧菌引起，發酵時必須充分供氧，如谷氨酸、檸檬酸、抗生素、生長激素、酶制劑等的生產；另一類是厭氧性發酵，由厭氧菌引起，發酵時必須隔離空氣，分子氧的存在對發酵有害，只有在需要保持罐壓時才向發酵罐中通入無菌空氣，如乳酸、丙酮、丁醇等的生產；第三類是兼性發酵，由兼性厭氧菌引起，在有氧存在時進行有氧性發酵，在無氧存在時進行厭氧性發酵，如酒精、酵母菌體的生產。第二節 發酵動力學 按菌體生長、碳源消耗、產物形成三者之間的動力學關系來區分發酵類型，能清楚地比較各種發酵的特點

49、。Gaden根據發酵過程中，產物的形成與底物利用之間關系的不同，將發酵分為三類。 型為生長聯系型，又稱簡單發酵型，產物直接由碳源代謝而來，產物生成速度的變化與微生物對碳源利用速度的變化相平行，產物生成和糖的利用有直接的化學計量關系，產物形成與微生物的生長相偶聯。例如酵母菌的酒精發酵和供氧條件下生產酵母菌體都屬于這一類型。蘑菇菌絲、蘇云金桿菌等的培養亦屬于此類。 第二節 發酵動力學 在單細胞微生物中，菌體增長與時間的關系多為對數關系。酵母生產就是根據對數生長關系和菌體產量常數（在一定的培養條件下，菌體產量與碳源消耗之比）計算加糖速度，以防止過量糖的加入引起酒精產生。在厭氧條件下，酵母菌生長與產物

50、生成是相平行的；在有氧的條件下，糖的消耗速度和菌體生成的速度是平行的過程。在這些發酵過程中，菌體生長、碳源消耗、產物生成三種速度都有一個高峰，三個高峰幾乎在相同時間出現。第二節 發酵動力學 型為部分生長聯系型，或生長部分相關行，又稱中間發酵型。產物不是碳源的直接氧化產物，而是菌體內生物氧化過程的主流產物，碳源既供微生物的生長又供產物生成，碳源利用率較高，產物形成的量也較多。糖的消耗主要在微生物的旺盛生長階段和產物最大形成期，但糖的消耗與產物合成無直接計量關系，產物生成與微生物的生長部分偶聯。例如，在用黑曲霉進行檸檬酸發酵時，發酵早期糖被用于滿足菌體生長，直到其他營養成分耗盡為止。然后代謝進入檸

51、檬酸積累階段，產物積累的數量與糖的利用數量有關，這一過程僅能得到少量的能量。 第二節 發酵動力學 又如土霉素的生產，開始時代謝活動極其微弱，當開始產生初級菌絲后，代謝旺盛而不大量分泌抗生素，隨后初級菌絲斷裂，呼吸率和核酸形成下降，抗生素分泌量增加。產生次級菌絲后，抗生素形成量迅速增加，核酸仍有生成而呼吸下降，最后生長停頓，代謝再度降低，然而抗生素仍能繼續分泌一段時間。在這些發酵過程中，菌體生長和最終產物的生成雖分為兩個階段，但二者并非截然分開，在產物大量形成階段菌體增長可能出現第二次高峰，也可能降低或停止。第二節 發酵動力學 型為非生長聯系型，又稱復雜發酵型。這一型的特點是產物形成一般在菌體生

52、長接近或達到最高生長期。產物合成與碳源利用無準量關系，產物生成量遠遠低于碳源消耗量，產物生成在菌體生長和基質消耗完以后才開始，與生長不偶聯，所形成的產物均是次級代謝產物。例如青霉素和鏈霉素、維生素的生產多屬于此類。整個過程分為兩個時期：第一個時期為菌體生長期，積累菌體和能量代謝的各個方面都極為旺盛，而抗生素的生成量極微；第二個時期為抗生素合成期，氧化代謝的各個方面較弱，而產物的積累逐漸達到高峰，但兩個時期也有關聯，往往不能截然分開。第二節 發酵動力學 Deindoerfer根據發酵的進程，將發酵分為五類，即單一型、并進型、連貫型、分段型和復合型。 單一型：底物按固定的化學計量關系轉化為產物，過

53、程無中間產物積累。單一型發酵動力學類型分為兩個類型，即生長反應型和非生長反應型。 并進型：底物按不定的化學計量關系轉化為產物，沒有中間產物的積累。這類反應過程產生一種以上的產物，但產物不是按固定的化學計量關系轉化的，生成產物的相對速度往往隨營養成分濃度而變化。第二節 發酵動力學 連貫型：底物轉化為產物的過程中有一定的中間產物的積累。如假單孢桿菌(在把葡萄糖發酵成葡萄糖酸時，先把葡萄糖轉化為葡萄糖內酯，然后再轉化成葡萄糖酸)。 分段型：分段型有兩種情況，一種是底物在轉化為產物前全部轉化為中間產物，另一種情況是營養物按先后順序有選擇地轉化為產物。分段型由兩個單一型組成，這兩個單一型反應可能是由酶的

54、誘導作用加以調節控制。 弱氧化醋酸桿菌氧化葡萄糖為5一酮基葡萄糖酸就是分段型。在這一過程中，首先將全部葡萄糖轉化為葡萄糖酸，然后再將葡萄糖酸轉化為5一酮基葡萄糖酸。第二節 發酵動力學 大腸桿菌的二階段式生長也是分段型。在同時供給葡萄糖和山梨醇作為基質的情況下，先利用葡萄糖，用完葡萄糖后再開始利用山梨醇。Monod將這種生長方式稱為“二段生長”。 復合型：絕大多數發酵過程實際上是由上述各種基本反應類型組合而成的，其復雜程度可能相差極大。青霉素發酵就顯示了這種情況。青霉素菌絲體的生長曲線是典型的二段式生長，青霉素的生成曲線也顯示兩個階段并落后于菌絲體的生長曲線。在糖耗盡與青霉素出現之前的一段時間內

55、有某種中間產物的積累。 第二節 發酵動力學 二、微生物生長動力學 微生物生長動力學研究的是微生物細胞的生長速率和環境條件對生長速率的影響。微生物在生長過程中，通過新陳代謝活動，部分營養物質轉變成細胞物質，表現出細胞質量增加和細胞體積增大，這是個體生長的過程。當生長到一定限度時，微生物細胞開始繁殖，表現出細胞個體數目增加，這是群體生長的過程。無論是細胞質量增加或細胞體積增大，還是細胞個體數目增加，都是微生物生長的體現。第二節 發酵動力學 1.生長速率 在微生物的培養過程中，菌體濃度的增加速率與菌體濃度、基質濃度和抑制劑濃度有關。生長速率與培養液中的菌體濃度成正比，比例系數一般用表示，稱為比生長速

56、率，它與許多因素有關，當溫度、pH、基質濃度等條件改變時，隨之改變。 2.比生長速率與基質濃度的關系 （1）Monod方程 Monod根據經驗得出，在培養液中無抑制劑存在時，底物濃度與比生長速率的關系由上節(5-6)，可表示為：max s（KsS） 第二節 發酵動力學 當限制性底物濃度非常小時，比生長速率與限制性底物濃度成正比，微生物的生長顯示為一級反應。 當限制性底物濃度很大時，比生長速率達到最大比生長速率max，菌體的生長速率與底物濃度無關，而與菌體濃度成正比，微生物的生長顯示為零級反應。 當限制性底物濃度很高時，對于某些微生物，高濃度的基質對生長有抑制作用，因而當達某一值時，再提高底物濃

57、度，比生長速率反而下降，這時max僅表示一種潛在的力量，實際上是達不到的。 第二節 發酵動力學 （2）其他比生長速率方程式 Monod方程式是描述比生長速率與底物濃度關系最基本的方程式，其他的方程式還有多個限制基質的Monod式Tessier方程式Moser方程式Contois方程式；對于BOD測定用方程可知，當單位菌體所具有的底物很小時，菌體的比生長速率與底物濃度成正比，而與菌體濃度成反比。 3.生長抑制 微生物的生長速率或底物消耗速率，與酶反應一樣，存在著各種形式的抑制現象。第二節 發酵動力學 （1）抑制劑抑制 由于微生物的生長合成是一系列酶催化反應的結果，因此酶催化反應中的各種抑制劑同樣

58、對微生物的生長有抑制作用。例如Saccharomyces cerevisiae利用葡萄糖的速率受培養基中山梨糖的抑制，在以葡萄糖為主要底物培養Monascus sp.時，半乳糖對Monascus sp.的生長同樣起競爭性抑制作用。 （2）底物抑制 高濃度底物對代謝途徑的抑制作用是所攝取的過量底物本身或其代謝底物抑制酶活力的過程，或是由于基因水平影響酶的生成機制，從而最終控制底物攝取速度，并影響生長速度的過程。底物抑制的一個明顯例子是酵母菌生長過程中的Crabtree效應。當培養液中葡萄糖的濃度超過5時，即使在足夠的氧供應條件下，也會使酵母細胞的生長速度明顯下降，這種現象稱Crabtree效應。

59、第二節 發酵動力學 （3）產物抑制 酒精發酵中酵母菌的生長為產物抑制的一個例子，乙醇對酵母比生長速率的影響為非競爭性抑制。 4.邏輯定律 對于穩定的連續發酵過程，由于其底物濃度等培養條件都維持不變，比生長速率為一常數，對于分批發酵，在對數生長期，發酵液中的底物濃度較高，比生長速率接近最大比生長速率，底物濃度的變化不會引起的明顯變化，可認為是常數。但就整個分批發酵而言，隨著時間的進行，由于培養液中營養物質的消耗、細胞重量的增加和代謝產物的生成，使得培養條件隨著時間不斷變化，比生長速率亦隨之變化，可用邏輯定律來說明，比生長速率與菌體濃度有關，且隨時間的增加而降低。第二節 發酵動力學 三、產物形成動

60、力學 微生物發酵中，產物生成速率與細胞濃度、細胞生長速率及基質濃度等有關，不同的發酵生產有著不同的動力學模式，其中底物和抑制劑可以是多個。下面首先介紹生長與產物形成的關系，然后介紹幾個具體發酵中產物形成的動力學模型。 1.產物形成與生長的關系 細胞生長與代謝產物形成之間的動力學關系決定于細胞代謝中間產物所起的作用。描述這種關系的模式有三種，即生長聯系型模式、非生長聯系型模式和復合型模式。第二節 發酵動力學 （1）生長聯系型模式 在這種模式中，當底物以化學計量關系轉變成單一的一種產物時，產物形成速率與生長速率成正比關系，代謝產物一般稱為初級代謝產物，這類代謝產物的發酵稱為初級代謝，如乙醇、檸檬酸