1、植物組織培養溫州醫科大學生命科學學院0 緒論0.1 植物組織培養的簡介0.1.1 植物組織培養的概念植物組織培養（plant tissue culture）：是指在無菌和人工控制的環境條件下，利用人工培養基，對離體的植物胚胎、器官、組織、細胞及原生質體進行培養，使其再生細胞或完整植株的技術。又稱為植物離體培養（plant culture in vitro）。植物組織培養是一門研究植物離體培養的生物技術學科。基礎學科：植物生理學無菌：無真菌、細菌、病毒等微生物。人工控制的環境條件：光照、溫度、濕度、氣體等。離體生態學（in vitro ecology）：是指研究離體培養環境條件控制的科學，其研究

2、對象是培養基、植物材料和人工環境條件。外植體（explant）：用于離體培養的那部分植物器官、組織或細胞。愈傷組織（callus） ：是指外植體因受傷或在離體培養時，其細胞進行活躍的分裂增殖而形成的一種無特定結構和功能的組織。采用微生物學的實驗手段來操作植物離體的器官、組織和細胞。0.1.2 植物組織培養的特點具體表現為以下方面：組培技術是無菌操作技術。組培材料處于完全的異養狀態。組培材料可以是離體狀態的器官、組織、細胞或原生質體。組織培養物可以形成克隆（clone，無性繁殖系），也可以進行莖芽增殖或生根。組培容器內的氣體和環境氣體可通過封口材料進行交換，相對濕度通常是幾乎100，因此，組培苗

3、葉片表面一般都無角質層或蠟質層，且氣孔保衛細胞功能缺乏，氣孔始終都是張開的。組培的環境溫度、光照強度和時間都是人為設定的，其參數可調。0.1.3 植物組織培養的研究類型和任務組織培養：分生組織、形成層組織、薄壁組織、韌皮部組織等。器官培養：根、莖、葉、花、果實、種子。胚胎培養：幼胚、成熟胚、胚乳、胚珠、子房等。細胞培養：單細胞或較小細胞團，如性細胞、葉肉細胞、根尖細胞、韌皮部細胞等。原生質體培養研究任務：研究離體培養條件下，細胞、組織或器官所需營養條件和環境條件，細胞、組織或器官的形態發生和代謝規律，植物脫毒方法和機理，植物特別是一些難繁植物的大量快速繁殖方法，細胞融合方法和機理，再生個體的遺

4、傳和變異，種質資源的離體保存機理和方法等。0.2 植物組織培養的形成和發展開創階段（上世紀初上世紀30年代末）1. Schleiden 和Schwann 植物組織培養的理論基礎源于德國植物學家Schleiden和動物學家Schwann于1838-1839年提出的細胞學說：一切生物都是由細胞構成，細胞是生物體的基本功能單位，細胞只能由細胞分裂而來。 2. Haberlandt 德國植物學家Haberlandt被公認為是植物組織培養之父，他于1902年發表的植物組織培養的第一篇論文：提出了植物細胞具有全能性，構思了細胞培養的概念。Haberlandt選擇了柵欄組織細胞、髓部細胞、雄蕊絨毛以及氣孔保

5、衛細胞進行實驗，將這些細胞培養在有機物豐富并含有葡萄糖的Knop培養液中，在無菌條件下進行培養。細胞沒有分裂，但存活了幾個星期并有生長。失敗的主要原因：1）實驗材料高度分化。 Haberlandt沒有意識到，由于可進行光合作用的細胞相應地已經分化了，它們的分生組織潛能不容易表達。2）培養基過于簡單。 Haberlandt不知道細胞脫分化成為分生組織狀態需要刺激物質，植物生長調節劑當時還未發現。3. Kotte and Robbins1922年，植物離體組織培養取得了一些進展。德國人Kotte和美國人Robbins兩人同時分別獨立地將分生組織作為外植體。Kotte研究切下的根尖，如豌豆、玉米根尖

6、，將它們放在含有Knop溶液鹽成分、葡萄糖、含氮化合物如天冬酰氨酸、丙氨酸以及肉汁的各種營養液中。Kotte觀察到根尖生長持續了2周，但他沒有進行繼代培養。另一方面Robbins通過繼代，將玉米根尖離體培養了更長的時間，但隨著時間延長，生長量減少，最后消失。4. Hanning、Knudson和Laibach1904年，Hanning在無機鹽和蔗糖溶液中對蘿卜和辣根菜的胚進行了培養，發現離體胚可以充分發育成熟，并提早萌發形成小苗。1922年，Knudson采用胚培養法獲得了大量的蘭花幼苗。1925年，Laibach培養亞麻種間雜交幼胚獲得成功，證明了胚培養在植物遠源雜交中利用的可能性。在植物組

7、織培養研究的開創時期，由于影響植物組織和細胞增殖及形態發生能力的因素尚不清楚，培養材料的選擇十分重要，在30多年的探索實驗中，植物組織培養幾乎沒有大的進展。奠基階段（上世紀30年代上世紀50年代末）1. 李繼侗和沈同1933年，他們首次報道了利用天然提取物成功進行植物組織培養的研究。利用加有銀杏胚乳提取物的培養基，成功培養了銀杏的胚。2. White、Gautheret and Nobecourt1934年，美國植物生理學家White用添加了酵母提取物（YE）的培養基進行了番茄根的離體培養，建立了第一個活躍生長并能繼代增殖的無性繁殖系，從而使非胚器官培養首次獲得成功。同年，法國學者Gauthe

8、ret在添加了YE和水解酪蛋白（CH）的固體培養基上，使山毛櫸和歐洲黑楊的形成層培養物連續增殖了幾個月，這是固體培養基在植物組織培養上的首次成功應用。1937年，White又發現酵母提取物的作用可以被B-族維生素（硫胺素，VB6，煙酸）所取代，建立了第一個由已知化合物組成的培養基。 1939年，White建立了連續生長的煙草雜種培養物。同時期， Gautheret在山毛櫸和胡蘿卜形成層、Nobecourt在胡蘿卜根和馬鈴薯塊莖上也建立了連續生長的培養物。WhiteGautheretNobecourt White 和 Gautheret 獲得的愈傷組織，由含有大液泡的薄壁組織組成。3. Skoo

9、g和Miller 1954年，Skoog于做了一個著名的實驗。在煙草愈傷組織培養中用了變質的鯡魚精子DNA，發現它可促使愈傷組織加快生長。有效成分存在于變質的DNA樣品或者經高壓滅菌后的新鮮樣品中，他指出有效成分是降解的DNA產物。1955年，他把這種物質命名為激動素（KT）。1956年，Miller首次從鯡魚精子中分離出激動素。 Skoog Skoog和Miller的煙草髓部愈傷組織培養實驗 1957年，Skoog和Miller提出激素控制器官形成的觀點。在這篇著名的論文中，他們提到在煙草髓部愈傷組織培養中，根和芽的分化由生長素和細胞分裂素的比率決定，并且器官分化可以通過改變培養基中兩種激素

10、的濃度進行調節。高濃度的生長素誘導生根，而高濃度的細胞分裂素促進芽的形成。兩者濃度相當時則傾向于未分化樣式的生長。這一對激素調節器官分化的觀點現在已在大多數植物種類中被證實。 4. Muir、Steward和Reinert1953年，Muir利用往復式搖床的振蕩，在液體培養基中進行了萬壽菊和煙草愈傷組織的培養，獲得了單細胞或密集細胞的懸浮液，并可繼代增殖。這既是培養方法上的突破，也是Haberlandt培養單細胞設想的實現。1958年，英國學者Steward和Reinert幾乎同時在胡蘿卜根組織的韌皮部單細胞懸浮培養液中誘導出胚狀體，并長成完整植株。證實了Haberlandt的細胞全能性理論。

11、 建立和發展階段（上世紀60年代至今）從植物細胞全能性理論的提出到其被實驗科學地證實，植物組織培養研究領域走過了近60年的發展歷程。當影響植物細胞分裂和器官形成的機理被揭示后，學者們對該領域進行了全面研究，獲得的成果枝繁葉茂，發表的文章浩如煙海，形成了一套成熟的植物組織培養的理論體系和技術方法，擁有著極其廣泛的應用領域，從而在生物科學中建成了這門具有理論、技術和應用的科學。1. Thimann和Wickson 1958年，他們發現腋芽（當頂芽存在時為休眠狀態）的生長，可以通過外源細胞分裂素的應用而啟動。這樣，將莖段培養在含有細胞分裂素的培養基上，就可以在一個具有完整頂芽的生長中的莖上誘導側芽的

12、形成。這將消除頂端優勢，得到大量不定芽。Thimann2. Morel脫毒、快繁商業化1952年， Morel和Martin提出了植物脫毒（virus free）技術，通過分離已被病毒感染的大麗花個體的根尖，并將其離體培養，重新獲得了無病毒的大麗花。1960年，Morel利用蘭花莖尖培養，實現了脫毒和快速繁殖（rapid clone propagation）的兩個目的。這一技術導致歐洲、美洲和東南亞許多國家“蘭花工業”的興起。Morel3. MurashingeMurashinge發展了一套標準的離體繁殖方法，將這一技術廣泛普及。與Skoog一起篩選出至今仍被廣泛應用的MS培養基。4. Guh

13、a和Maheshwari等花藥培養1964-1966年，印度學者Guha 和Maheshwari成功地由曼陀羅花藥培養獲得單倍體植株，開創了花粉培育單倍體的新途徑。1973年，Nitsch采用花藥預培養方法獲得了煙草花粉植株的純合二倍體。 1974年，Sunderland建立了散落花粉系列培養法。1982年，Ghandimathi和Imamura直接分離花粉進行 培養成功，建立了一個適于深入研究雄核發育的實驗體系。MaheshwariNitschNitsch發展了培養煙草和曼陀羅小孢子的技術、單倍體染色體加倍的技術，并且在5個月之內收集到二倍體純合子的種子（Nitsch, 1974, 1977

14、）。 5. Cocking等-原生質體培養1960年，英國學者Cocking首次用酶解方法獲得了原生質體，開創了植物原生質體培養的研究。1971年，日本學者Nagata和Takebe首次將煙草葉肉原生質體培養出再生植株。1985年，Fujimura獲得首例禾谷類水稻的原生質體培養的再生植株。1986年，Spangenberg獲得了甘藍型油菜的原生質體培養的再生植株。Cocking6. Carlson等原生質體融合1972年，Carlson利用硝酸鈉進行了煙草種間原生質體的融合實驗，獲得了首株體細胞種間雜種植株。1974年，Kao利用聚乙二醇（PEG）進行了大豆和煙草科間原生質體的融合，獲得了3

15、的異質體。同年，Bonne和Eriksson利用PEG成功進行了具有葉綠體的海藻和不具有葉綠體的胡蘿卜根原生質體的融合。1978年，Melchers獲得了首個屬間雜種植株（馬鈴薯番茄）。1981年，Zimmerman提出了原生質體融合的新方法電融合。Melchers植物遺傳操作成功的前景引起了大眾的興趣。Melchers和他的同事（1978年）通過將馬鈴薯和番茄原生質體融合，允許遺傳信息在兩個不同的有機體中移動，獲得了一個雜種植物。這一方法提供了獲得親緣相近但生殖隔離的種間雜種的機會。7. Kaul等次生代謝物生產1969年，Kaul發現三角葉薯蕷懸浮培養物可以生產薯蕷皂苷配基。1973年，F

16、uruya和Ishii發現人參培養細胞可以產生人參皂苷。Nickell組織培養的先驅，尤其是在培養中次生代謝物質的生產方面。 Street培養設施化Street和他的助手開創了各種細胞懸浮培養的程序（恒化器和恒濁器）。 0.3 植物組織培養的應用及展望快繁和脫毒育種次生代謝物生產種質保存在遺傳、生理、生化、病理等研究上的應用1. 離體快繁（試管苗和人工種子）和脫毒1）試管苗在生產上應用最廣泛、經濟效益較大。特點：繁殖系數大、速度快，苗木整齊一致，周年生產。一個單株一年繁殖幾萬到幾百萬個植株。葡萄：3萬，蘭花：400萬，草莓：108 。尤其適用于“名、優、特、新、奇” 品種、脫毒苗、優良單株、瀕

17、危植物和基因工程植株等的繁殖。目前園藝作物及經濟林木等部分或大部分都用離體快繁提供苗木。美國Wyford國際公司年產花卉、蔬菜、果樹及林木的組培苗3000萬株。以色列Benzur苗圃年產觀賞植物組培苗800萬株。我國工廠化生產的組培苗有：香蕉、甘蔗、桉樹、葡萄、蘋果、脫毒草莓、脫毒馬鈴薯、非洲菊、蘆薈。Fig. 1. Mass propagation of multiple shoot cultures of Artemisia annua青蒿2）人工種子（artificial seed）人工種子的概念是1978年Murashinge首次提出的，它是指植物離體培養中產生的胚狀體或不定芽，被包裹

18、在含有養分和保護功能的人工胚乳和人工種皮中，從而形成能發芽出苗的顆粒體。具有試管苗的優點外，還具有以下優點：1）便于貯藏和運輸、可直接播種和機械化操作；2）可在人工種子中加入抗生素、菌肥、農藥等成分，提高種子活力和品質。前途是光明的，道路是曲折的。人工種子3）脫毒苗木培育很多作物特別是無性繁殖作物都帶有病毒，影響產量和質量，對生產造成極大損失。草莓主要病毒有4種，大蒜和馬鈴薯的病毒有10多種。感病植株并非每個部位都帶有病毒，生長點附近的病毒濃度很低甚至無毒。利用莖尖組培，再生植株就可脫毒，獲得脫毒苗。應用：水果（甘蔗、菠蘿、香蕉、葡萄、草莓等）、蔬菜（馬鈴薯、大蒜、洋蔥等）、花卉（蘭花、菊花、

19、唐菖蒲等）等。莖尖培養用于脫毒2. 培育新品種或創制新物種單倍體育種離體選擇突變體培育遠源雜種基因工程育種單倍體育種手段：花藥和花粉培養優點：所有基因均能表現，基因型可快速純合。成果：已育成大面積種植的品種。1974年我國育成第一個新品種煙草單育1號，此后還育出水稻中花8號、小麥京花1號和大量花培新品系。單倍體植株單倍體加倍離體選擇突變體愈傷組織、懸浮培養細胞易變異、細胞數量大，有利于突變體篩選。多用于抗性篩選。已選出一些抗病、抗鹽、高賴氨酸、高蛋白的突變體，有些已用于生產。體細胞變異突變體篩選培育遠源雜種胚培養可克服受精后障礙導致的遠源雜交不孕，產生遠源雜交后代，育成新物種。已育成蘋果和梨、

20、大白菜和甘藍、栽培棉和野生棉等雜交種。原生質體融合可克服有性雜交不親和性，獲得體細胞雜種。已獲得馬鈴薯和番茄、煙草和龍葵等屬間雜種，但尚無實際應用價值。典型的原生質體煙草原生質體Aechmea fasciata (X400)Ti導入的原生質體原生質體遠緣雜交基因工程育種農桿菌介導法、基因槍法均基于植物組織培養技術。抗除草劑、抗蟲、抗病、抗逆性、品質改良。轉基因作物已占種植面積的1/5左右。轉基因技術基因槍技術3. 次生代謝物生產利用組織和細胞的大規模培養，可以生產人類需要的一些天然有機化合物，如蛋白質、脂肪、糖類、藥物、香料、生物堿及其他活性化合物。已從200多種植物的培養組織或細胞中獲得了5

21、00多種有效代謝化合物，包括一些重要藥物。如人參皂苷、喜樹堿、降壓靈等。特別適于天然植物蘊藏量少、含量低、臨床效用高的成分，如紫杉醇等。Fig. 2. Scale-up of Catharanthus roseus 長春花cell cultures in a 20 litre air紫草發酵罐培養4. 植物種質資源的離體保存常規保存手段耗費人力、物力和土地。1975年，Henshaw和Morel首次提出了離體保存植物種質的策略。優點：節約人力、物力和土地，防止有害病蟲的傳播，便于種質資源的交換和轉移。已有多種植物保存。如草莓莖培養物可保存6年。5. 在遺傳、生理生化、病理等研究上的應用已成為植

22、物科研的常規方法。遺傳：單倍體、純合二倍體、無性系變異等。生理生化：植物營養、生長活性物質、光合代謝等。病理：單細胞或原生質體培養快速鑒定抗病性、抗逆性等。復習思考題什么是植物組織培養？簡述植物組織培養的特點及分類。何謂離體生態學、外植體和愈傷組織？植物組織培養有那些方面的應用？3 植物組織培養的基本技術3.1 培養基的成分與配制技術3.2 基本操作3.3 離體培養體系的建立3.1 培養基的成分與配制技術成分母液配方pH值制備3.1.1 基本成分水礦質元素碳水化合物生理活性物質生長調節劑附加物天然添加物1. 水（H2O ）水：可靠的水質是實驗的保證可以使用以下裝置：水質軟化裝置離子交換反向滲透

23、蒸餾離子交換設備2. 礦質元素大量必需元素（加入mM量級）：氮、磷、鉀、鈣、鎂、硫微量必需元素（加入 M量級）：鐵、錳、硼、鋅、銅、鉬其他：碘、鎳、鈷、鋁等3. 碳水化合物作用：提供碳源、維持滲透壓。通常碳源用蔗糖，高壓滅菌后蔗糖大部分水解為葡萄糖和果糖。濃度范圍15%，但在幼胚、莖尖、花藥等培養時可達10甚至更高。低濃度（1.52.5）的糖有利于木質部的生長；高濃度（34）有利于韌皮部；4. 生理活性物質維生素肌醇氨基酸及其酰胺類單核苷酸維生素（0.110mg/L）作用：輔酶注意事項：易高溫降解，過濾滅菌。硫胺素（VB1）：全面促進生長。吡哆醇（VB6）煙酸（VB3）VC：抗氧化劑，防止褐變

24、。肌醇作用：幫助活性物質發揮作用，使培養物快速生長，促進胚狀體及芽的形成。一般用量：50100mg/L。氨基酸及酰胺有機氮源、緩沖作用、調節體內平衡。甘氨酸：促進離體根的生長。絲氨酸、谷氨酰胺：有利于花藥胚狀體或不定芽的分化。水解酪蛋白（CH）、水解乳蛋白（LH）：氨基酸混合物。5. 植物生長調節劑： 目前公認的已用于植物組織培養和生長操作的有六大類植物激素。它們是：生長素、細胞分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯和油菜素內酯。此外還有一些具有植物激素特征的化合物。天然生長素 在植物中發現的天然生長素主要是吲哚-3-乙酸（IAA）。在植物分生組織區濃度很高，與許多生理反應有關。與植物組培有關的作用主要

25、是在細胞分裂和有絲分裂過程。生長素的一個主要應用是促進生根，因此被廣泛用于切段的微繁和生根培養。然而，不可忽視它可抑制根的伸長。合成生長素： 最廣泛使用的合成生長素：吲哚-3-丁酸IBA、-萘乙酸（NAA）和2,4-二氯苯氧基乙酸（2,4-D）。通常與細胞分裂素聯用。這些生長素對光、溫的穩定性高于IAA，可以經高壓滅菌。 其余較少用的生長素包括：2-萘氧乙酸（NOA）、4-氯苯氧乙酸（4-CPA）、2-甲基-4-氯苯氧乙酸（MCPA） 、2,4,5-三氯苯氧基乙酸（2,4,5-T）、3,6-二氯茴香酸(麥草畏)、4-氨基-3,5,6-三氯吡啶羧酸（毒莠定）。細胞分裂素 細胞分裂素是腺嘌呤6位上

26、的N被其他基團取代的衍生物，與生長素共同作用促使植物細胞分裂。玉米素是最早被分離的細胞分裂素。呋喃甲基腺嘌呤和芐基腺嘌呤是最早合成的。細胞分裂素主要在植物的根部合成，運輸到莖干。在組織培養中對芽的形成和器官分化起主要作用。均二苯脲（DPU）從椰子汁中提取，具有類似細胞分裂素活性，常作為微繁的附加成分。常用的細胞分裂素：芐基腺嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）、激動素（KT）。Thidiazuron（TDZ）已廣泛用于組織培養。TDZ抑制細胞分裂素氧化酶，從而降低細胞分裂素的新陳代謝，使得細胞分裂素在組培過程中維持較高的水平。 赤霉素 赤霉素對熱敏感，因此在組培中不常用。使用時，在培養基高壓滅菌后

27、，對它單獨過濾除菌。它們主要的作用是刺激植物亞頂端分生組織的擴展生長。因此常用來刺激芽的伸長，如對矮稻的生物測定可明顯看到其作用。赤霉酸（GA3）是在組培中用得最多的赤霉素。脫落酸 脫落酸（ABA）是植物生長的強有效的抑制劑。與其他生長因子相互起作用。在組培中廣泛用來促進體細胞胚發育為成熟的胚，并轉化為小植株。乙烯 乙烯是氣態的，是一種揮發性的激素。要將這種激素降低到最小程度，培養容器大小，尺寸以及密閉方法就顯得非常重要。在過去的幾年發展了大量的植物生長調節劑。由于它們更強的活性、穩定性以及低廉的價格，在植物組培中它們的用途也不斷地擴展。生長素/細胞分裂素相互作用 在Skoog和Miller工

28、作的基礎上，已經建立起很好的生長素細胞分裂素比率關系，用于組培中決定芽和/或根的形成。細胞分裂素對生長素的濃度比值高時，傾向于形成芽，而生長素細胞分裂素的濃度比值高時，傾向于形成根。兩種激素的比值處于中間水平時增強愈傷組織的形成。6. 附加物膠凝劑螯合劑滲透劑活性炭其他膠凝劑： 瓊脂：從藻類中提取的天然產品，710 g/L。瓊脂一般都含有雜質，特別是鈣、鎂和微量元素，在營養研究時應避免使用。Gelrite：一種吉蘭多糖（異多糖），是假單胞菌產生的胞外多糖，2.02.5 g/L。不同品牌其物理化學特征不同螯合劑 Chelates可與金屬陽離子（主要是鐵）形成復合物，使其溶解于溶液中。 EDTA：

29、乙二胺四乙酸EDDHA：乙二胺二鄰羥苯基大乙酸鐵鈉 滲透劑 Osmotic agents組培培養基的滲透能力影響水和各種成分的可用性。蔗糖的濃度大于2%常常是由于其滲透效果而非作為碳源的作用。大多數情況下甘露醇僅作為有滲透效果的糖醇，而不參與代謝變化。活性炭Charcoal（0.53）使培養基變黑（根部環境）。吸附分子，特別是帶有環狀結構的植物生長調節劑。可能含有刺激因素（如多胺）。由于吸附能力的不同，活性炭的商標很關鍵。在高壓滅菌前加入會降低培養基的pH值，使瓊脂不易凝固。7. 天然添加物椰乳（CM）、水解酪蛋白（CH）、酵母提取液（YE）等。作用：提供天然微量營養成分、生理活性物質和生長調

30、節劑等。缺點：成分不確定，影響實驗重復性。3.1.2 母液（貯備液）10倍、100倍或更高倍數，冰箱貯存。貯備液：大量元素20倍貯備液：微量元素200倍貯備液：鐵鹽200倍貯備液：有機物質（除了蔗糖）200倍各種激素貯備液分別配制：0.1mg/L或1mg/L注意事項：各種藥品要充分溶解后才能混合。混合時要注意先后順序，避免相互結合生成沉淀。鐵鹽單獨配制，一般用硫酸亞鐵和EDTA-Na2通過加熱形成穩定的螯合鐵貯存。生長素類先用少量95乙醇或1mol/L NaOH加熱助溶后，用水定容。細胞分裂素類先用少量1mol/L鹽酸溶解，再用水定容。3.1.3 配方基本培養基：MS、B5、White等。激素

31、配比：主要是生長素和細胞分裂素的比例。如：MS + BA2 + NAA0.10.23.1.4 pH值一般5.66.0。高壓滅菌后稍有下降，所以滅菌前要略調高。大于6.0，培養基變硬；低于5.0，瓊脂凝固不好。一般用1mol/L的鹽酸或氫氧化鈉調節。培養階段pH值會改變 3.1.5 培養基制備加一定量水，依次加入需要量的母液。加入需要量的蔗糖，溶解，定容。調節pH值。加入需要量的瓊脂，加熱溶解（要不斷攪拌）。分裝：在瓊脂未凝時（40左右凝固）分裝，量一般為容器的1/41/3，注意不要沾到容器口。封口。滅菌。存放。注意事項：不能高壓滅菌的物質，在滅菌后溫度下降但瓊脂尚未凝固時，在無菌條件下，用過濾

32、除菌法加入。配好的培養基一般應在兩周內用完。3.2 離體培養體系的建立3.2.1 外植體的選擇和處理3.2.2 培養條件3.2.1 外植體外植體（explant）從需要培養的母株分離的一小塊植物材料。接種體（inoculum）已經培養的植物材料用于繼代培養。地上部比地下部清潔。外植體越小，克服特殊植物病理問題（如病毒、支原體、細菌）的機會越大，但同時也降低了存活率。內部的組織比外部的不易受到污染。不同外植體反應不總是相同。外植體的選擇2. 外植體的滅菌 根據培養容器大小將材料切割成適當大小；流水（自來水）沖洗植物表面；在酒精中晃動幾秒鐘；HgCL2（0.11%）吐溫（潤濕劑）2滴/100ml：

33、35min；用經過高壓滅菌的蒸餾水沖洗；商業漂白劑715%吐溫2滴/100ml：1030min；再用經過高壓滅菌的蒸餾水沖洗幾次。注釋自來水：除去塵土，清潔劑去掉表面垢污。 酒精：70%酒精使蛋白質失活。95%有時被用來溶解外植體表面的臘質層。 NaOCl（商業漂白劑）或Ca(OCl)2：活性在于Cl- 和其他氧化反應。 HgCl2活性在于Cl-和使蛋白質失活的重金屬。 潤濕劑（例如：吐溫20或80）可以加到上述溶液中。 *汞對環境是有毒的，因此汞溶液使用后收集到一個大的容器中。在溶液中加入氨水，汞可以沉淀。蘭花花枝的無菌消毒3.2.2 培養條件溫度光照濕度氣相條件溫度 事實上要對每種特定的植

34、物甚至每一特定階段調整最優化的溫度。對大多數植物日間培養室的溫度調節點在22 2C。夜間的溫度通常要低幾度。容器內的溫度要比室溫高（可達5C）。培養室的一個主要的問題是維持始終如一的溫度。保障措施：需要安裝一個很大的自動調溫器，當溫度太高時可以關掉燈光 光通常用熒光燈，在架子上平行安放。大多數情況是裝在培養室的外面，以避免熱。 以下的光參數是重要的：光周期 和光強光周期大多數情況光周期不是最重要的。通常是16小時光照。為了節省能源和降低安裝費培養室內不同架子上的燈不必同時打開。光強 適當的光密度是30 mol m-2 s-1，這一光強下為混合培養類型。自養型組培則需要達到250 mol m-2

35、 s-1。 依據不同類型的容器，容器內的光強或多或少被減弱。 PAR Photosynthetic active radiation PAR每秒每平方米波長在400700nm之間的光子摩爾數 LUX是一個不太合適的單位，因為它基于人眼的敏感性 光譜光譜是光形態建成的因素（植株高度以及葉片伸展）重要的比率：藍光/紅光，紅光/紅外 光譜因燈不同而不同濕度 Humidity 培養室的相對濕度（RH）通常不控制。標準容器其頂部空間水蒸氣飽和。容器內的RH可以通過不同的裝置控制通風，底部冷卻，瓊脂濃度 。容器氣體組分在組培容器中頂部空間的成分組成與溫室空氣有顯著的區別，見下表 ：其他揮發性氣體含量微小。

36、 componentgreenhouse environmentcontainer atmosphereO222 %as low as 4 %N277 %up to 87 %CO2 365 - 1000 ppmup to 20 %water vapour60-85 % 100 %ethylene5 ppb - 100 ppb 2 ppm頂部空間氣體成分對植物生長發育的影響： 矮化或白化 玻璃化軟腐自養/混合營養乙烯傷害矮化或白化有限的氣體交換對組培的效應組培容器盡可能密閉，以防止污染。然而，在一個完全密閉的容器中可能出現氣體的堆積，對植物生長造成不利，如產量減少、白化病或壞疽。Fig. 1:

37、growth reduction Fig. 2 Albinism玻璃化Hyperhydricity玻璃化是在植物組培過程中的一種生理混亂現象。程度有低高之分。程度低的話在培養初期不會遇到大的問題。但程度高的話在培養的各個階段都有可能遇到嚴重的問題。 玻璃化癥狀 玻璃化的癥狀通常不易用肉眼觀察到。植物易感或培養條件非常不利則會出現可見的癥狀。培養條件非常不利的例子：細胞分裂素濃度過高水分含量過高容器過于密實膠凝劑濃度過低 產生原因原因是多方面的。然而許多因素只是當培養系統的條件沒有達到最優化時表現誘導或激發玻璃化。下列可以作為考慮的因素： 外植體：種類，栽培變種；繼代間隔時間；繼代次數；切割方法

38、；在培養基上的放置情況。 培養基：凝膠的濃度和類型；有無液體層；細胞分裂素的種類及水平；鹽濃度。容器：氣體組成和氣體濃度。 環境：溫度；光強和光質，濕度；空氣流動 補救方法培養基成分：培養基用較高濃度的凝膠固化，也可以使用有較高凝固能力的凝膠劑；降低細胞分裂素的濃度。容器特征：不太密實的裝置，比如氣透性膜；增加水蒸氣和其他氣體與周圍環境的交換，從而調節容器的頂部空間氣體成分；環境條件：底部冷卻；增加光強；在不含BA的培養基上冷藏。底部冷卻 大部分容器的底部由于燈產生的微弱熱量而變暖。結果水蒸氣在冷的蓋子上凝結成水滴。容器內相對濕度可以通過冷卻底部來控制，這樣水蒸氣就在培養基表面凝結。培養基溫度

39、和蓋子下面的溫度差別越大，相對濕度就越低。例如：培養基20 ，蓋子下部 23，RH為 85% 。 各種容器和封口裝置復習思考題簡述用于植物組織培養的培養基的組成。如何選擇外植體？請詳細說明外植體滅菌的方法。植物組織培養需要哪些環境條件？1.1 植物細胞的全能性植物細胞全能性（totipotency）：是指任何攜帶完整遺傳信息的植物活細胞都具有表達其所有遺傳信息的能力，能夠發育成完整的植株。全能性是一種可能性，變為現實必須滿足兩個條件：解除抑制和給予刺激。細胞需經過脫分化和再分化過程才能表現其全能性。1 植物組織培養的基本原理1.2 植物細胞的分化與脫分化脫分化（dedifferentiatio

40、n）：成熟細胞或分化細胞轉變為分生狀態（即形成愈傷組織）的過程。再分化（redifferentiation）：成熟細胞或分化細胞脫分化轉變為愈傷組織后重新分化成異質細胞的過程。1.3 植物的形態建成1.3.1 愈傷組織的誘導、生長和保持傷口可能導致愈傷組織的形成。愈傷組織形成可以在幾乎所有的活的植物中發現。傷口愈傷組織的開始是植物的一種自我保護反應；內源植物激素水平的改變，結果使細胞分裂具有活性。機械損傷、微生物入侵以及昆蟲的襲擊也可以導致愈傷組織產生。Wound callus on the stemof an Erythrina tree1.3.1.1 愈傷組織的誘導愈傷組織起源于母體組織增

41、殖細胞。在培養時，通過把全植株的一小部分（外植體）在無菌條件下放到支持生長的培養基上來產生愈傷組織。激素改變了細胞的代謝使之從靜止轉變為具有活性。來自于葉組織來源于根來源于維管組織來源于胚組織培養條件固體培養基暗培養液體培養基的缺點污染損失大不利于氣體交換，影響愈傷組織形成。誘導期（啟動期）細胞準備分裂。因植物種類和外植體狀況而異。對大多數植物，愈傷組織建立相對比較容易；如雙子葉植物、單子葉植物、裸子植物、蕨類植物以及苔蘚等。來自多種器官的組織在適當的培養基上可能都有分裂和增生擴散的潛能，然而，某些組織似乎比另一些更傾向于使細胞快速分裂。一般需要1天到幾天。1.3.1.2 愈傷組織的生長誘導期

42、后，外植體外層細胞開始分裂，在組織受傷表面形成一種創傷形成層，愈傷組織的細胞數目迅速增加。特點：細胞分裂速率大大超過細胞伸長速率，單個細胞的平均重量下降，體積變小。如菊芋外植體培養7d后，細胞數目增加10倍以上，鮮重僅增加1倍。愈傷組織類型質地：松脆、致密高生長素：致密變松脆。低或無生長素或高細胞分裂素：松脆變致密。 顏色：白色、黃色、綠色、紅色1.3.1.3 愈傷組織的保持一段時間后，由于基本培養物的損耗、凝膠的干燥以及代謝物的積累，需要將愈傷組織轉到新鮮的培養基上進行繼代培養。愈傷組織繼代培養時要有適當的大小，以保證在新鮮培養基上可以重建生長。通常每36周進行繼代培養。Typical ca

43、llus growth curve. X indicates time for subculture大多數情況下，隨繼代培養代數的增加和培養時間的延長，愈傷組織出現生長勢下降、褐變、分化和形態發生能力逐漸降低甚至死亡或發生能力完全喪失。遺傳因素：染色體畸變、基因突變。生理因素：細胞內激素平衡或細胞對外源生長物質的敏感性發生改變。延長培養期可能使愈傷組織對生長素的需求發生變化，導致生長素的自給或自養，出現馴化現象。一般1年以上或10代以上出現。生理因素導致的形態發生能力下降可通過改變培養條件而恢復。1.3.2 愈傷組織再分化 愈傷組織生長過程中，開始細胞分裂局限在外層細胞，當表面細胞分裂逐漸減慢

44、并停止時，內部較深處的細胞才開始分裂，且分裂的方向也發生改變，形成了維管化組織和瘤狀結構，這是愈傷組織生長的一個共同特征。很多情況下，它們往往變成生長中心，但不進一步分化，并從它們的周圍產生薄壁細胞，結果形成一種“泡沫球”增殖物，這仍然是生長活躍的愈傷組織的特點。隨后這些小疣狀物可以經歷另一個發育過程，出現器官分化和體細胞胚狀體的發生。在愈傷組織的培養過程中細胞分化的程度和類型有相當大的可變性。很難找到由完全一致的實質細胞組成的均一的愈傷組織。當形成導管元件、篩管元件、栓化細胞、分泌細胞等時就發生了細胞分化。一些分裂的細胞形成擬分生組織或維管節結，以后它們將變成芽頂點、根原基或初始胚形成的中心

45、。xylem tissuemeristematic activityunorganised tissue再分化途徑器官發生途徑：愈傷組織先產生芽（或根），再在另一種培養基上產生根（或芽），然后形成完整植株。胚狀體發生途徑：愈傷組織形成胚狀體，再在另一種培養基上同時發展成帶有根的苗。也叫無性胚胎發生（無性系）。胚狀體是指愈傷組織中形成的與種子中胚相似的具有苗端和根端的雙極性結構。也叫體細胞胚。 1.3.2.1 器官發生先形成芽，后在芽基部長根。先形成根，后在根基部形成芽。在愈傷組織的不同部位分別形成芽和根，然后根、芽的維管束接通形成完整植株。僅形成芽或根。如茶樹花粉愈傷組織往往只能形成根。Sho

46、ot (caulogenesis) (a) and root development (b & c) on callus of Hypoxis1.3.2.2 體細胞胚胎發生起源：合子胚是配子細胞融合的產物，即受精卵；對體細胞胚而言（合成的無性胚）融合是不需要的。形態：一個完全發育的胚是具有兩極的軸，一端是芽分裂組織，另一端是根分裂組織；也可以根據一種特殊類型的葉片子葉來辨別。進化：胚胎發育有連續的典型形態階段（球形胚、心形胚和魚雷胚）。 體細胞胚胎的特征：體胚最根本的特征是具有兩極性。即在發育的早期階段從方向相反的兩端分化出莖端和根端，而不定芽或不定根都是單向極性。體胚的維管組織與外植體的該組

47、織無解剖結構上的聯系，而不定芽或不定根往住總與愈傷組織的維管組織聯系。體胚的維管組織的分布是獨立的Y字形，而不定芽的維管組織則無此現象。Typical morphological stages during embryo development: (A) globular, (B) heart shaped, (C) torpedo體胚發生的方式體胚發生的方式分為直接發生和間接發生兩類。直接發生是指體胚直接從原外植體的胚性細胞不經愈傷組織階段發育而成；而間接發生是體胚從愈傷組織或懸浮細胞、有時也從已形成的體胚的一組細胞中發育而成。多數體胚是間接發生。直接發生胚性細胞：與分生組織細胞類似，通常較

48、小，近圓形，具有較大的核和核仁并能高度染色，胞質濃厚，可直接發育成體細胞胚胎。如柑橘的珠心組織、茶樹和龍眼的子葉、香雪蘭的花序等外植體。間接發生胚胎發生叢（EC）的形成：EC是愈傷組織中一種液泡小、胞質濃的小細胞聚集成的叢狀結構。其表面是高度分生組織化的細胞團，每個表面細胞都可能發育成胚狀體。EC原培養基上不能使其表面的胚狀體發育，但可增殖、崩潰而不衰。EC在轉入降低或去除生長素、降低還原氮的培養基后，才能完成胚狀體的發育。人工種子合成或人工種子是獨立包埋的體細胞胚。通常術語“embling”用來描述從人工種子發育而來的植株。通常用海藻酸鈉作為人工種子的包埋劑。也發展了用新的自裂膠珠的方法。直

49、到現在人工種子的質量和保真度仍然是人工種子產品發展和大量生產的制約因素。1.4 植物組織培養的基本程序無菌外植體的獲得初代培養物的建立形態發生和植株再生培養產物的觀察記載1.4.1 無菌外植體的獲得外植體攜帶有各種微生物，這些微生物一旦進入培養容器，會造成培養基和培養材料污染，實驗無法進行。所以，污染是組織培養的一大障礙，需要利用各種滅菌劑進行外植體的滅菌。不同器官的滅菌方法莖尖、莖段、葉片根、塊莖、鱗莖花蕾果實、種子1、莖尖、莖段、葉片的滅菌清水沖洗（茸毛較多的先用皂液洗滌），吸水紙吸干。0.10.2氯化汞浸泡210min；或70酒精浸數秒，再在10次氯酸鈣浸泡520min（或21530mi

50、n）。無菌水沖洗35次，吸干。適當切塊，接種。2、根、塊莖、鱗莖的滅菌帶土，易損傷。仔細刷洗，切除損傷部位，增加滅菌時間或濃度。0.10.2氯化汞浸泡512min；或70酒精浸數秒，再在610次氯酸鈣浸泡520min。3、花蕾的滅菌花蕾中的花藥處于無菌狀態，采摘后可直接滅菌。70酒精浸1030s， 0.1氯化汞浸泡310min（或1次氯酸鈣1020min）。4、果實、種子的滅菌有些表面具茸毛或蠟質，需加吐溫-80。果實：70酒精浸數秒，2次氯酸鈣1020min。種子： 0.10.2氯化汞浸泡510min（或10次氯酸鈣2030min）。1.4.2 初代培養物的建立無菌環境：外植體、培養基、接種

51、器械、接種工作臺。規范操作：無菌操作合適條件：培養基、激素、其他添加物、外植體、培養條件等。抗生素的使用外植體滅菌是表面滅菌，無法除去侵入組織內部的微生物。有時可以考慮在培養基中加入抗生素。抗生素對植物生長可能有抑制作用，需摸索其合適的種類和濃度。注意添加方式，一般不能高壓滅菌，有些需要過濾除菌。1.4.3 形態發生和植株再生 體細胞胚 植株外植體（愈傷組織） 具根、莖的兩極器官 植株 器官分化 單極器官 先莖后根 植株 先根后莖 植株1.4.4 培養產物的觀察記載愈傷組織誘導率產生愈傷組織的外植體數/外植體總數*100胚狀體誘導率產生胚狀體的外植體數/外植體總數*100芽分化率產生芽的外植體

52、數/外植體總數*100發根率發根芽數/培養芽數復習思考題：簡述植物細胞全能性的概念。什么是植物細胞脫分化和再分化？愈傷組織是如何形成和生長的？植物離體培養中再生植株有哪些途徑？何謂植物體細胞胚胎？其發生有哪些途徑？影響植物離體形態發生的因素有哪些？為什么愈傷組織誘導一般選用固體培養基？愈傷組織的形成時期及特點。簡述繼代培養的原因及要點。體細胞胚胎的特征及發生方式。4 植物器官培養植物器官培養是指對植物某一器官的全部或部分或器官原基進行離體培養的技術。根、莖、葉、花器、果實、種子。4.1 根的培養根系生理代謝研究的良好實驗體系；研究器官分化、形態建成的良好體系；建立根無性系，用于制藥；誘變育種。

53、4.1.1 離體根的培養方法固體培養法：平放液體培養法：振蕩固體液體雙層培養法：根段形態學上端插入固體培養基，下端朝上浸露在液體培養基中。其他特殊方法4.1.2 離體根所用培養基WhiteMS、B5等大量元素減半或減2/34.1.3 影響離體根生長因素基因型營養條件：氮源、碳源、微量元素、維生素B1激素：生長素pH光照和溫度：一般黑暗有利于根的形成。4.2.1 莖段培養植物莖段培養是指對植物的帶有一個以上定芽或不定芽的外植體（包括塊莖、球莖、鱗莖在內的幼莖切段）進行離體培養的技術。4.2 莖段和莖尖培養莖段培養的目的進行植物的離體快速繁殖。研究莖細胞的分裂潛力和全能性。誘導細胞變異和突變體的獲

54、得。莖段培養的特點和優點特點：以芽生芽的方法進行增殖。優點：容易成功、變異小、性狀均一、繁殖速度快。莖段培養產物單苗（芽）叢生苗（芽）單生芽和叢生芽的增殖方式適宜植物的離體快速繁殖。完整植物愈傷組織影響因素基因型激素配比：生長素、細胞分裂素4.2.2 莖尖培養莖尖培養（shoot tip culture or apical meristem culture）是指對植物頂端的原分生組織和它衍生的分生組織的培養。材料莖尖分生組織培養：1mm(帶有12個葉原基的生長錐），可去毒。普通莖尖培養：幾毫米至幾十毫米的莖尖、芽尖及側芽培養。Shoot tip culture 莖尖培養的一般方法材料制備：精心

55、預處理嚴格滅菌小心取材：體視顯微鏡、解剖針莖尖培養注意事項取材大小：脫毒小于1mm，快繁可數毫米。莖尖微小趨向于形成愈傷組織。培養基：多為MS，避免2,4-D（促使外植體愈傷組織化）。莖尖分生組織培養與脫毒普通莖尖培養與繁殖技術無菌物的建立芽的增殖中間繁殖體的增殖誘導生根移栽概念：Micropropagation生長狀態及原因生長太慢：莖尖不見明顯增大，但顏色轉綠。進入休眠生長素太低溫度低生長過旺：莖尖明顯增大，基部產生愈傷組織，莖尖難于伸長，色澤較淡。生長素偏高用了2,4-D光照太弱溫度過高生長正常：莖尖逐漸轉綠，基本逐漸膨大，有時形成少量愈傷組織，莖尖逐漸伸長，最終形成小枝。影響莖尖微繁的

56、因素基因型外植體的大小供試植株的生理狀態芽的著生部位褐變玻璃化極性后生變化形態發生能力遺傳穩定性4.3 葉的培養離體葉：葉原基、葉柄、葉鞘、葉片、子葉等葉組織。意義：研究葉形態建成、光合作用、葉綠體形成等；葉細胞全能性；原生質體融合；無性繁殖系；誘變育種。影響葉組織培養的因素基因型細胞分裂素細胞分裂素和生長素的組合供試植株的發育時間和葉齡葉脈極性損傷離體葉組織發育途徑直接產生不定芽由愈傷組織產生不定芽胚狀體其他將鑷子、解剖刀置于含有70酒精的清潔瓶內。葉片浸于該液1分鐘作表面消毒。將葉片置于10漂白粉水溶液中（1/4杯漂白粉+2 杯水+幾滴洗潔精）10分鐘，并不時用鑷子攪動。如果葉片浮在水上，

57、則需用鑷子夾入水底。10分鐘后，將漂白粉水溶液中的葉片轉移到盛有無菌水的瓶子內，一次放入一片。將葉片轉移到消毒過的盤上準備切割。切去葉的邊緣，再將剩下的葉片切成24片，并分別將它們接入紫羅蘭培養基上。經消毒的非洲紫羅蘭葉片切成0.5-1英寸寬，接種于新鮮的培養基上。3周后葉片周圍及表面腫脹，并有芽生成。芽伸長成苗。有時葉片表面都被誘導的芽所包圍。接種56周后將接種的葉片1分2，并轉入無激素的培養基中以利于苗的生長及生根。一個即將用于移栽的生根的紫羅蘭試管苗。移栽到土壤中的小苗的前幾天要用塑料袋罩上，直到小苗適應低濕度的環境。復習思考題植物根培養主要有哪幾種方法？什么是莖段培養？有何特點及用途？

58、何謂莖尖培養？有何類型？需注意什么？葉培養有哪些意義？4 植物器官培養植物器官培養是指對植物某一器官的全部或部分或器官原基進行離體培養的技術。根、莖、葉、花器、果實、種子。4.1 根的培養根系生理代謝研究的良好實驗體系；研究器官分化、形態建成的良好體系；建立根無性系，用于制藥；誘變育種。4.1.1 離體根的培養方法固體培養法：平放液體培養法：振蕩固體液體雙層培養法：根段形態學上端插入固體培養基，下端朝上浸露在液體培養基中。其他特殊方法4.1.2 離體根所用培養基WhiteMS、B5等大量元素減半或減2/34.1.3 影響離體根生長因素基因型營養條件：氮源、碳源、微量元素、維生素B1激素：生長素

59、pH光照和溫度：一般黑暗有利于根的形成。4.2.1 莖段培養植物莖段培養是指對植物的帶有一個以上定芽或不定芽的外植體（包括塊莖、球莖、鱗莖在內的幼莖切段）進行離體培養的技術。4.2 莖段和莖尖培養莖段培養的目的進行植物的離體快速繁殖。研究莖細胞的分裂潛力和全能性。誘導細胞變異和突變體的獲得。莖段培養的特點和優點特點：以芽生芽的方法進行增殖。優點：容易成功、變異小、性狀均一、繁殖速度快。莖段培養產物單苗（芽）叢生苗（芽）單生芽和叢生芽的增殖方式適宜植物的離體快速繁殖。完整植物愈傷組織影響因素基因型激素配比：生長素、細胞分裂素4.2.2 莖尖培養莖尖培養（shoot tip culture or

60、apical meristem culture）是指對植物頂端的原分生組織和它衍生的分生組織的培養。材料莖尖分生組織培養：1mm(帶有12個葉原基的生長錐），可去毒。普通莖尖培養：幾毫米至幾十毫米的莖尖、芽尖及側芽培養。Shoot tip culture 莖尖培養的一般方法材料制備：精心預處理嚴格滅菌小心取材：體視顯微鏡、解剖針莖尖培養注意事項取材大小：脫毒小于1mm，快繁可數毫米。莖尖微小趨向于形成愈傷組織。培養基：多為MS，避免2,4-D（促使外植體愈傷組織化）。莖尖分生組織培養與脫毒普通莖尖培養與繁殖技術無菌物的建立芽的增殖中間繁殖體的增殖誘導生根移栽概念：Micropropagatio