1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。in situ hybridization-原位核酸分子雜交技術原位核酸分子雜交技術簡稱原位雜交(insituhybridizationISH)是應用已知堿基順序并帶有標記物的核酸探針與組織、細胞中待檢測的核酸按堿基配對的原則進行特異性結合而形成雜交體，然后再應用與標記物相應的檢測系統，通過組織化學或免疫組織化學方法在被檢測的核酸原位形成帶顏色的雜交信號，在顯微鏡或電子顯微鏡下進行細胞內定位。這一技術為研究單一細胞中DNA和編碼各種蛋白質、多肽的相應mRNA的定位提供了手段，使從分子水平研究細胞內基因表

2、達及有關基因調控提供了有效的工具。可視為組織化學或免疫細胞化學中革命性的突破。原位雜交技術已應用于基礎研究如基因組圖(Genemapping),轉基因檢測,基因表達定位(localizationofgeneexpression),核DNA和RNA的mRNA的排列和運輸(arrangementandtransportofmNA),復制(replication)和細胞的分類(Sortingofcells)。臨床研究應用在細胞遺傳學(Cytogenetics),產前診斷(Prenataldiagnosis),腫瘤和傳染性疾病的診斷,生物學劑量測定(biologicaldosimetry)和病毒學的病

3、原學診斷等。隨著核酸探針的制備,標記方法和基本操作方法的不斷改進,新的技術不斷涌現,相信在不久的將來,原位雜交技術將會更廣泛的被應用于各個學科,并不斷為生命科學提供新的資料,開拓新的領域。第一節原位核酸分子雜交技術的發展原位雜交1969年美國耶魯大學Gall和Pardue首先創立的，他們用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細胞雜交，確定該基因定位于卵母細胞的核仁中。與此同時，BuongiornoNardelli和Amaldi,John及其同事等相繼利用同位素標記核酸探針進行了細胞或組織的基因定位。Orth(1970)應用3H標記的兔乳頭狀瘤病毒cRNA探針與兔乳頭狀瘤組織的冰凍切片進行雜交，首次用原位

4、雜交技術檢出了病毒DNA在細胞中的定位。由于同位素標記探針具有放射性既污染環境，又對人體有害，且受半衰期限制等特點，因此研究用非放射性的標記物標記核酸探針進行原位雜交，引起了許多學者的重視和探索。Bauman(1981)等首先應用熒光素標記cRNA探針做原位雜交，然后用熒光顯微鏡觀察獲得成功。Shroyer(1982)報道用2，4二硝基苯甲醛(DNP)標記DNA探針，使該DNA探針具有抗原性，然后用兔抗DNP的酶標抗體來識別雜交后的探針，最后經免疫過氧化物酶組織化學的方法顯示雜交信號。Brigat(1983)首先建立生物素標記的探針在組織切片上檢出了病毒DNA，通過生物素與抗生物素結合，過氧化

5、物酶抗過氧化物酶顯示系統顯示病毒DNA在細胞中的定位，生物素標記探針技術目前已被廣泛應用，特別是在病毒學和病理學的臨床診斷中。BoeringerMannhemBiochemisca于1987年將地高辛標記的有關試劑及藥盒投放市場，和其它非放射性標記物一樣，地高辛較放射性標記系統安全，方便、省時間。同時在敏感性和質量控制方面比生物素標記技術要優越，地高辛標記法顯示的顏色為紫藍色(標記堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶顯色系統)，有較好的反差背景，更有利于與免疫組織化學相結合，同時可以檢測基因表達。核酸探針根據標記方法的不同可粗略分為放射性探針和非放射性探針兩類。根據探針的核酸性質不同又可分為DNA探針、RN

6、A探針、cDNA探針、cRNA探針和寡核甘酸探針等。DNA探針還有單鏈DNA(Singlestranded,ssDNA)和雙鏈DNA(Doublestranded,dsDNA)之分。所以原位雜交可分為DNADNA，cDNARNA,RNARNA和寡核苷酸探針與DNA或RNA等雜交方式。原位雜交技術在生命科學的研究中可視為一頂革命性的技術。它使我們的研究從器官、組織和細胞水平走向分子水平。為各個學科的研究帶來突破性的進展.。第二節原位分子雜交技術的基本方法原位雜交技術的基本方法包括：雜交前準備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強核酸探針的穿透性、減低背景染色等；雜交；雜交后處理；顯示(vi

7、sualization)：包括放射自顯影和非放射性標記的組織化學或免疫組織化學顯色。(一)固定原位雜交固定的目的是為了保持細胞形態結構，最大限度地保存細胞內的DNA或RNA的水平；使探針易于進入細胞或組織。DNA是比較穩定的，mRNA是相對穩定的但易為酶合成和降解。RNA更易被酶降解，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解減少到最低限度，取材后應盡快予以冷凍或固定。在解釋結果時應考慮到取材至進入固定劑或冰凍這段時間對RNA保存所帶來的影響，因組織中mRNA的降解是很快的。1最常用多聚甲醛固定組織，因其不會與蛋白質產生廣泛的交叉連接，不會影響探針穿透入細胞或組織。2醋酸酒精的混合液和Bouins

8、固定劑也能獲得較滿意的效果。3mRNA的定位將組織固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中12h，在冷凍前浸入15%蔗糖溶液中，置4冰箱過夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機或振蕩切片機切片。4組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入4%多聚甲醛約10min，空氣干燥后保存在-70。如冰箱溫度恒定，在-70切片可保存數月之久不會影響雜交結果。在病理學活檢取材時多用福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標本對檢測DNA和mRNA有時也可獲得雜交信號，但石蠟包埋切片由于與蛋白質交聯的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號常低于冰凍切片。同時，在包埋的過程中可減低mRNA的含量。其它固定劑如應用多聚甲醛蒸

9、汽固定干燥后的冷凍切片也可獲滿意效果。各種固定劑均有各自的優缺點，如沉淀性(Precipitating)固定劑：酒精/醋酸混合液、Bouins液、Carnoys液等能為增加核酸探針的穿透性提供最佳條件，但它們不能最大限度地保存RNA，而且對組織結構有損傷。戊二醛較好地保存RNA和組織形態結構，但由于和蛋白質產生廣泛的交聯，從而大大地影響了核酸探針的穿透性。(二)玻片和組織切片的處理1玻片的處理玻片包括蓋片和載玻片應用熱肥皂水刷洗，自來水清洗干凈后，置于清潔液中浸泡24h，清水洗凈烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸餾水沖洗、烘干、烘箱溫度最好在150或以上過夜以去除任何RNA酶。蓋玻片在有條件時最

10、好用硅化處理，錫箔紙包裹無塵存放。要應用粘附劑預先涂抹在玻片上，干燥后待切片時應用，以保證在整個實驗過程中切片不致脫落。常用的粘附劑有鉻礬明膠液，其優點是價廉易得，粘附效果較差。多聚賴氨酸液具有較好的粘附效果，但價格昂貴。一種新的粘附劑APES粘附效果好，價格較多聚賴氨酸便宜，制片后可長期保存應用。2增強組織的通透性和核酸探針的穿透性增強組織通透性常用的方法如應用稀釋的酸洗滌、去垢劑(detergent)或稱清洗劑TritonX100、酒精或某些消化酶如蛋白酶K，胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶和淀粉酶(diastase)等。這種廣泛的去蛋白作用無凝可增強組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高雜交

11、信號，但同時也會減低RNA的保存量和影響組織結構的形態，因此，在用量及孵育時間上應填為掌握。蛋白酶K(ProteinaseK)的消化作用的濃度及孵育時間視組織種類、應用固定劑種類、切片的厚薄而定。一般應用蛋白酶K1g/ml(于01mol/LTris/50mmol/LEDTA,pH8.0緩沖液中)，37孵育1520min，以達到充分的蛋白消化作用而不致影響組織的形態為目的。蛋白酶K還具有消化包圍著靶DNA的蛋白質的作用，從而提高雜交信號。甘氨酸是蛋白酶K的抑制劑，常用01mol/L的甘氨酸溶液(在PBS中)清洗以終止蛋白酶K的消化作用，Burns等(1987)報道應用胃蛋白酶(Pepsin)20

12、100g/ml(用01NHCl配)37、30min進行消化，所獲實驗結果優于蛋白酶K。為保持組織結構，通常用4%多聚甲醛再固定。3減低背景染色背景染色的形成是諸多因素構成的。雜交后(Posthybridization)的酶處理和雜交后的洗滌均有助于減低背景染色。在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐(aceticanhydride)和三乙醇胺(triethanolamine)中以減低靜電效應，減少探針對組織的非特異性背景染色。預雜交(Prehybridizaiton)是減低背景染色的一種有效手段。預雜交液和雜交液的區別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖(Dextransulphate)。將組織切片浸入預雜交液

13、中可達到封閉非特異性雜交點的目的，從而減低背景染色。在雜交后洗滌中采用低濃度的RNA酶溶液(20g/ml)洗滌一次，以減低殘留的內源性的RNA酶，減低背景染色。4防止RNA酶的污染由于在手指皮膚及實驗用玻璃皿上均可能有RNA酶，為防止其污染影響實驗結果，在整個雜交前處理過程都需戴消毒手套。所有實驗用玻璃器皿及鑷子都應于實驗前一日置高溫(240)烘烤以達到消除RNA酶的目的。要破壞RNA酶，其最低溫度必需在150左右。(三)雜交(Hybridsation)雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片，或采用無菌的蠟膜代替硅化的蓋玻片，加蓋片防止孵育過程中雜交液的蒸發。在蓋玻片周圍加液體石蠟封固

14、或加橡皮泥封固。硅化的蓋玻片的優點是清潔無雜質，光滑不會產生氣泡和影響組織切片與雜交液的接觸，蓋玻片自身有一定重量能使有限的雜交液均勻覆蓋。可將復有硅化蓋玻片進行雜交的載玻片放在盛有少量5SSC或2SSC(standardsalinecitrate,SSC)溶液的濕盒中進行孵育。(四)雜交后處理(Posthybridisationtreatment)雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。特別因為大多數的原位雜交實驗是在低嚴格度條件下進行的，非特異性的探針片段粘附在組織切片上，從而增強了背景染色。RNA探針雜交時產生的背景染色特別高，但能通過雜交后的洗滌有效地減低背景染色，獲得較好

15、的反差效果。在雜交后漂洗中的RNA酶液洗滌能將組織切片中非堿基配對RNA除去。一般遵循的共同原則是鹽溶液濃度由高到低而溫度由低到高。必須注意的是漂洗的過程中，切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很難減少非特異性結合，從而增強了背景染色。(五)顯示(Visualization)顯示又可稱為檢測系統(Detectionsystem)。根據核酸探針標記物的種類分別進行放射自顯影或利用酶檢測系統進行不同顯色處理。細胞或組織的原位雜交切片在顯示后均可進行半定量的測定，如放射自顯影可利用人工或計算機輔助的圖象分析檢測儀(computerassistedimageanalysis)檢測銀粒的數量和

16、分布的差異。非放射性核酸探針雜交的細胞或組織可利用酶檢測系統顯色，然后利用顯微分光光度計或圖象分析儀對不同類型數量的核酸顯色強度進行檢測。但做半定量測定必須注意嚴格控制實驗的同一條件，切片的厚度和核酸的保存量如取材至固定的間隔時間等。如為放射自顯影，核乳膠膜的厚度與稀釋度等必須保持一致。(六)對照實驗和結果的判斷對照試驗的設置須根據核酸探針和靶核苷酸的種類和現有的可能條件去選定，常用的對照試驗有下列幾種。1將cDNA或cRNA探針進行預雜交(吸收試驗)。2與非特異性(載體)序列和不相關探針雜交(置換試驗)。3將切片應用RNA酶或DNA酶進行預處理后雜交。應用同義RNA探針(Senseprobe

17、)進行雜交。4以不加核酸探針雜交液進行雜交(空白試驗)。5組織對照用已知確定為陽性或陰性組織進行雜交對照。6應用未標記探針做雜交進行對照。第三節原位DNA和DNA分子雜交方法DNA探針在病毒的檢測等領域中得到廣泛的應用。雜交時需先在高溫8095短時處理，使DNA探針及細胞內靶DNA變性，解離成單鏈，迅速置于冰上冷卻。然后置于3742雜交過夜。(一)地高辛(Dig)標記DNA探針在石蠟切片檢測病毒DNA的方法1組織切片的預處理(1)固定：組織以10%中性福爾馬林液或Bouins液固定，常規石蠟包埋，切片厚46m，粘附于涂有粘附劑的玻片上，入烤箱608068h，使切片更緊粘貼于玻片。(2)脫蠟：二

18、甲苯10min2,自100%乙醇和，95%，90%，70%，50%，30%各5min。入PBS(含5mmol/LMgCl2,pH7374)5min2。(3)入02mmol/LHCl20min以去除蛋白。(4)502SSC,含5mmol/LEDTA溶液中30min。(5)蛋白酶K(1g/ml溶于01mol/LPBS中)，372025min。(6)02mol/L甘氨酸液：室溫10min,中止蛋白酶反應。(7)4%多聚甲醛(PBS新鮮配制),室溫20min。(8)PBS/5mmol/LMgCl2漂洗10min2。(9)脫水，自低濃度到高濃度至無水乙醇各3min，空氣干燥。2預雜交封閉非特異性雜交位點

19、，加預雜交液20l/每張切片，42水浴半小時。3雜交加雜交液1020l/每張切片，加蓋硅化蓋片，將切片置于9510min，使探針及病毒DNA變性，然后迅速置于冰上1min，再將切片置于盛有2SSC濕盒內，42過夜(1618h)。4雜交后漂洗(1)2SSC液內振動移除蓋片。(2)2SSC5510min2。(3)05SSC505min2。(4)緩沖液(含05%封阻試劑，用緩沖液溶解)3730min。(5)緩沖液(100mmol/LTrisHCl,150mmol/LNaClpH75)15min,室溫。(6)酶標地高辛抗體(15000，應用緩沖液解釋)3730min。(7)緩沖液15min2，室溫。(

20、8)緩沖液(100mmol/LTrisHCl,100mmol/LNaCl,50mmol/LMgCl2,pH95)室溫，2min。5顯色(1)顯色液配制：在緩沖液1ml中加入45l四氮唑藍(NBT)，35lX磷酸鹽(5溴4氯3吲哚磷酸鹽(BCIP)配成。30l/每張切片，置暗處顯色(30min到2h。定時抽查切片，鏡檢其顯色情況。(2)緩沖液(10mmol/LTrisHCl,1mmol/LEDTA,pH80)10min終止反應，用核固紅或甲綠復染5min，二甲苯透明，DPX封固，鏡檢。6結果雜交陽性信號呈紫蘭色，細胞核呈紅或綠色。(二)生物素標記HPVDNA探針在石蠟切片上檢測HPVDNA的方法

21、。1玻片的預處理組織細胞原位核酸雜交主要在載玻片上進行，因此玻片的處理至關重要。載玻片(或蓋玻片)一般要經過1mmol/LHCl溶液或重鉻酸鉀硫酸溶液的浸泡，取出后充分用自來水沖洗，用雙蒸水洗三遍，然后置于60烤箱中烤干。將烤干的玻片分別插在染色架中，置250烤箱中烘烤4h，目的是去除玻片上殘留的核酸酶。為了防止組織或細胞在雜交過程中脫落，原位核酸雜交所需的玻片必需進行硅化處理。把經過250烘烤過的玻片用2%3氨丙基三乙氧基硅烷(APES)丙酮液處理玻片，有助于組織和載玻片的粘附。APES對甲醛固定的組織粘附效果好，可使組織與載玻片發生共價結合。玻片硅化方法：(1)室溫下將高溫處理過的載玻片用

22、2%APES丙酮液浸泡3min；(2)用丙酮洗去多余的APES；(3)用DEPC處理的蒸餾水或高壓消毒的蒸餾水清洗玻片12次；(4)40烤干玻片，防污保存在干燥器皿中待用。整個處理過程均要戴消毒手套進行操作。2組織切片常用的原位雜交標本有石蠟切片、冰凍切片和細胞培養標本。無論是哪一類的標本，在制備時都要盡量避免RNase污染。操作時要戴手套，要用75%的酒精擦洗工作面和切片刀、鑷子等。石蠟切片時，展片要用高壓消毒處理過的蒸餾水，裱片后把切片置60烤箱中烤片13h。置室溫下保存備用。新鮮組織切片最好先用固定劑固定(如用4%多聚甲醛或冷丙酮固定10min)，吹干后-70保存或在70%酒精中4保存，

23、培養細胞標本的處理方法與冰凍切片法相似。3雜交前處理目的在于提高組織的通透性,以防止DNA探針與細胞、組織之間的非特異結合，以增強雜交信號,減少背景著色。(1)脫蠟石蠟切片必需充分脫蠟,因為石蠟未脫凈會影響探針的穿透力,因而脫蠟用的二甲苯盡可能新鮮。常規石蠟切片用二甲苯脫蠟3次,每次5min;脫蠟后用逐級梯度酒精(100%、95%、90%、80%、70%)清洗,然后用蒸餾水洗3min,必須用高壓處理過的蒸餾水。(2)蛋白酶處理蛋白酶的消化能使固定后被遮掩的靶核酸暴露,以增加探針與靶核酸結合的機會。常用的蛋白酶有蛋白酶K(proteinaseK)、鏈霉蛋白酶(pronase)和胃蛋白酶(peps

24、in)、蛋白酶BP等。蛋白酶的濃度及消化時間,視組織種類、固定類型、切片厚度而定,一般使用1g/ml蛋白酶K(用含50mmol/LEDTA的pH80,01mol/LTrisHCl緩沖液配制),也可用001%蛋白酶BP(用pH80PE配制)37孵育1030min。蛋白酶具有消化包圍靶DNA的蛋白質的作用,促進探針滲透,從而提高雜交信號。但過度的蛋白酶消化會引起細胞形態結構的破壞及靶核酸的減少,也會導致標本從載玻片上的脫落。4雜交反應(1)變性和雜交進行雜交反應時,探針和靶核酸都必須是單鏈。如果用雙鏈cDNA探針檢測,則探針和靶核酸都必須先解鏈,也就是變性。將生物素標記的雙鏈探針雜交液滴在待檢組織

25、上,然后加蓋經250高溫處理過的蓋玻片,勿產生氣泡,并在蓋玻片周邊用石蠟油封邊(目的是防止探針和雜交液在雜交過程中蒸發),將含有探針的載玻片放入已經加熱煮沸(95100)的水浴箱的密封盒中(容器底部預先加入適量的蒸餾水)變性510min。探針和靶DNA同時變性,變性的單鏈探針與靶DNA隨即進行雜交反應。如果用單鏈探針與靶DNA進行雜交,雖然探針本身并不需要變性,但也可將探針加在組織標本上,用上述方法使靶DNA變性。變性完畢將切片放在冰塊上迅速降溫12min,然后將切片移入濕盒內置37培養箱雜交60min。如有條件也可用原位雜交儀進行變性和雜交,先調整好原位雜交儀的變性、雜交時間和溫度,將玻片放

26、入雜交儀內進行變性雜交,當雜交儀升溫至95時即可進行變性,變性后溫度迅速下降到37時即可進行雜交反應。(2)雜交后漂洗其目的是去除未參與雜交體形成的過剩探針,消除與組織或細胞之間的非特異性結合的探針,降低背景染色,增加信/噪比。將雜交玻片從濕盒(或雜交儀)中取出,用2SSC將蓋玻片洗脫,2SSC30洗2次,每次15min;1SSC42洗2次,每次15min;05SSC37洗2次,每次15min,TBS緩沖液洗2次。注意在漂洗過程中切不要使切片干燥。(3)雜交信號的檢測探針與靶核苷酸結合形成雜交體,對其檢測的方法因探針的標記物不同而異,一般與免疫組化方法類似,當帶有酶的抗半抗原抗體(或者抗生物素

27、蛋白)通過搭橋(或直接)與探針連接后,催化底物混合液中的底物發生反應,使其產生有色沉淀物即為陽性反應。現在大多數的研究都是采用堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶與抗半抗原抗體(或抗生物素蛋白)連接進行檢測。在切片組織上滴加堿性磷酸酶標記的鏈菌素(streptavidinalkalinephosphataseconjugated)溶液,室溫孵育2040min,TBS緩沖液洗3次5min,加入BCIP/NBT室溫暗處顯色1030min,TBS緩沖液洗,01%核固紅復染切片5min,蒸餾水沖洗,酒精脫水,中性樹膠封片。(4)雜交結果DNA原位核酸分子雜交陽性反應為靶基因存在的部位,一般在細胞核內,呈紫藍色顆

28、粒狀,若靶基因數量多或顯色時間長,則整個細胞核呈濃染藍色,陰性細胞核呈紅色。(5)對照試驗陽性對照:用已知含靶核酸序列的組織作對照。陰性對照:用已知不含待測靶核酸序列的組織作對照。用免疫組化檢測方法來確定雜交信號的分布。省略標記探針。DNA酶消化靶DNA對照。HJ1(6)非特異性染色非特異性染色可能會來自探針、組織內源性酶、組織細胞、顯色系統等;探針特異性不高以及組織細胞內某些成分與顯示系統中的抗體成分非特異結合也可造成非特異性染色。組織細胞內源性酶是原位雜交中非特異性著色的重要原因,目前最常用的酶是過氧化物酶和堿性磷酸酶,這兩種酶都廣泛存在于組織細胞中,因此用這些酶時應有消除內源性酶的相應步

29、驟。如過氧化物酶用3%H2O2處理510min;10%冰醋酸處理組切片10min,或在底物顯色液中加入1mmol/L左旋咪唑可防止內源性堿性磷酸酶的染色。NBT/BCIP顯示堿性磷酸酶時如果在光照下顯色也會增強非特異性染色。必須根據檢測系統不同的標記酶作不同的內源酶處理。第四節RNA原位核酸雜交方法一、基本原理RNA原位核酸雜交(RNAnucleicacidhybridizationinsitu)又稱RNA原位雜交組織化學(RNAinsituhybridizationhistochemistry)或RNA原位雜交6,7,25(RNAinsituhybridizationRISH)。該技術是指運

30、用cRNA或寡核苷酸等探針檢測細胞和組織內RNA表達的一種原位雜交技術。其基本原理是：在細胞或組織結構保持不變的條件下，用標記的已知的RNA核苷酸片段，按核酸雜交中堿基配對原則，與待測細胞或組織中相應的基因片段相結合(雜交)，所形成的雜交體(Hybrids)經顯色反應后在光學顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其細胞內相應的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位雜交技術經不斷改進，其應用的領域已遠超出DNA原位雜交技術。尤其在基因分析和診斷方面能作定性、定位和定量分析，已成為最有效的分子病理學技術，同時在分析低豐度和罕見的mRNA表達方面已展示了分子生物學的一重要方向。RNA原位雜交不同于DNA原位

31、雜交主要有：(1)使用的探針不同：RNA原位雜交中多采用RNA或寡核苷酸探針，因此避免了應用雙鏈DNA探針在雜交反應中存在的兩條鏈之間的復性和第二條鏈的競爭性雜交問題。cRNA-RNA之間形成的雜交體要比DNA-DNA、cDNA-RNA雜交體性能穩定，在雜交反應后可用RNA酶洗脫，以除去未結合的探針，因此特異性更強。(2)檢測的目的不同：RNA原位雜交檢測和分析的主要為內源性基因，包括細胞內固有基因、異常基因和變異基因。以正確反映組織與細胞之間相互關系及功能和代謝狀態、探索疾病發病機理、觀察治療的療效和評估疾病的預后等。其次為對外源性基因檢測，以獲得病毒和細菌類型等病原學診斷。而DNA原位雜交

32、主要為外源性基因檢測。(3)有較高的靈敏度：在檢出細胞和組織內在低拷貝核苷酸時，RNA原位雜交能獲得較好定位，而DNA原位雜交則難以信任。但RNA原位雜交也存在某些不足之處，為使RNA原位雜交標準化和克服其不足之處必須注意以下幾點：(1)不同探針種類的選擇、制備和標記要適合靶核酸和組織的特點；(2)有效制止組織和細胞內RNA降解；(3)實驗流程中嚴防RNA酶污染；(4)對雜交信號有效的放大和顯色技巧；(5)陽性結果判別,不僅需要有陽性和陰性標本對照，有條件的更需要觀測Northern雜交和免疫組化對同一組織的冰凍切片和石蠟切片中，基因及其產物兩者表達之間聯系。(6)在實驗流程的各個技術環節中熟

33、練運用技術控制是保證RNA原位雜交成功的必要條件。近幾年來RNA原位雜交已得到穩步發展。主要表現在：非同位素標記的探針制備和標記技術的進步、雜交信號放大的應用、組織預處理的改進、RNA原位雜交和免疫組化雙重檢測技術和激光共聚焦顯微鏡在多重RNA原位雜交中應用等。從理論上講，RNA原位雜交已趨成熟和完善，關鍵是在實際應用中能否被人們所受接并應用到各學科的研究中，促進人們對各類基因識別和表達規律的認識。二、RNA原位雜交中的探針(一)探針的種類RNA探針是指帶有標記的能與組織內相對應的核苷酸序列互補結合的一段單鏈cDNA或cRNA分子。根據在RNA雜交中所使用的探針依其來源可分為三種：即特異性cD

34、NA、cRNA探針和人工合成寡核苷酸探針。1.單鏈cDNA探針：由于cDNA中不存在內含子及其它高度重復序列，又克服了雙鏈cDNA探針在雜交反應中兩條鏈之間復性的缺點，從而提高了雜交反應的敏感性。但由于單鏈cDNA探針的制備比較困難，在RNA原位雜交中已很少見有應用。2.cRNA探針：是以cDNA為模板，通過體外轉錄而獲得的。因為它是一種單鏈探針，因此也避免了應用雙鏈cDNA探針做雜交反應時存在的兩條之間的復性問題。cRNA與RNA之間形成的雜交體要比cDNARNA雜交體穩定。cRNARNA之間形成的雜交體不受RNA酶的影響。因此雜交反應后可用RNA酶處理，以除去未結合的探針。由于cRNA探針

35、具有以上這些優點，cRNA探針的雜交飽和水平又比雙鏈DNA探針高出8倍，因此在原位雜交中應用廣泛。cRNA探針的缺點是：探針的制備過程比較復雜，需要較好的分子生物學實驗設備，它對RNA酶敏感，易受破壞，操作中要謹防RNA酶污染。3.寡核苷酸探針：人工合成的寡核苷探針是以核苷酸為原料，通過DNA合成儀合成，避免了真核細胞中存在的高度重復序列帶來的不利影響。由于大多數寡核苷酸序列較短，不需要純化，組織穿透性極好。根椐目的基因的特異性序列設計的探針，特異性較強。合成的寡核苷酸探針的缺點是：探針長度必須適宜，探針太長可造成內部錯誤配對雜交，探針太短可形成非特異性結合。它與mRNA形成的雜交體不如cRN

36、ARNA雜交體穩定，再則探針較短，所攜帶的標記物少，敏感性較低。依標記物不同，探針又可分為同位素標記探針和非同位素標記探針兩大類。前者主要包括3H、35C、32P和125I等，不同的同位素探針其穿透力，定位和半衰期各不相同，無一種同位素探針具有穿透力強、定位好和半衰期長所有優點。由于半衰斯短，性能不穩定，污染環境和危害健康等原因，在RNA原位雜交中應用同位素標記探針已日趨減少，而非同位素標記探針在近年來得到迅速發展，其標記物主要有生物素、地高辛、酶和熒光標記等。其中地高辛標記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標記優點，還克服了生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內源性生物

37、素干憂等缺點，其應用越來越廣泛。(二)探針的標記在RNA原位雜交中，不僅要選擇適當的探針，而且還要使探針得到有效的標記。探針標記法有酶反應法和化學反應法。1.酶反應法：用于RNA探針的酶反應法主要為末端標記法與體外轉錄法。末端標記法是將標記物導入線型DNA或RNA的5端或3端的一種標記法，末端標記適用于合成寡核苷酸探針的標記，用末端標記制備的探針一般攜帶的標記分子較少。2.體外轉錄法：體外轉錄法是一種制備與克隆片段序列相同的單鏈RNA探針的方法。進行體外轉錄時，先將靶核苷酸序列克隆到含噬菌體轉錄啟動子的載體中，然后在RNA聚合酶的作用下，以DNA為模板，以含有標記的三磷酸苷為原料，對啟動子下游

38、的序列進行轉錄，而啟動子本身并不被轉錄。體外轉錄常用噬菌體轉錄啟動子，如沙門氏菌噬菌體和大腸桿菌噬菌體T3、T7。當兩個不同的噬菌體轉錄啟動子結合在載體多克隆位點的兩側，用適當的限制性內切酶在插入序列的下游將質粒線性化。SP6噬菌體的RNA聚合酶對SP6啟動子序列具有高度的親和性，從而啟動下游的轉錄，在4種三磷酸核糖核苷和相應的噬菌體RNA聚合酶存在的條件下，即轉錄成RNA。如反應物中含有標記的三磷酸核糖核苷，所有的RNA就被標記。依標記物為同位素和非同位素，近年來非同位素標記探針已有了極大的近步。常用非同位素標記技術有生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶和熒光素。非同位素標記法又可分為直

39、接標記法和間接標記法。直接標記法是將標記物直接結合到探針上，當探針與組織內相應靶核苷酸結合后，即可顯色觀察。這類標記探針必須符合標記物在雜交過程中不丟失，又不影響雜交反應為條件。大量已發表的文獻表明，由于檢出雜交信號受到多種因素制抑，只能限于靶RNA豐富的細胞或組織中，RNA雜交對低拷貝的基因檢測不理想。近年來間接標記法得到較快發展，先將標記物結合在探針上，通過特異性抗體識別，由特異性抗體結合多種酶，對檢測的雜交信號作有放大，這一類標記法已展示極好的發展前景。(三)探針的純化某些標記探針必須經純化后方可使用。這是因為在探針標記過程中，反應液中仍存在一些未被結合到探針中去的剩余dNTP等小分子。

40、為將摻入并結合到cDNA、cRNA和標記寡核苷酸與游離的標記寡核苷酸分開，常使用乙醇沉淀法或酚/氯仿抽提法進行純化。乙醇沉淀法的原理是：DNA可被乙醇沉淀，而未摻入DNA的dNTP則保留在上清液中，由此反復乙醇沉淀能將兩者分開。核酸溶液中去除蛋白質的酚/氯仿抽提法的原理是：交替使用酚、氯仿這兩種不同的蛋白質變性劑，以增加去除蛋白質雜質的效果。因為酚雖能有效地變性蛋白質，但它不能完全抑制RNA酶的活性，而且酚能溶解10-15%的水，從而溶解一部分ploy(A)RNA。為克服這兩方面的局限，混合使用酚與氯仿，對于RNA提取，顯得更加重要，氯仿還能加速有機相與液相分層，去除植物色素和蔗糖。(四)雜交

41、前準備1.載玻片和蓋玻片的處理為有效防止外源性RNA酶的污染，雜交用的載玻片和蓋玻片可按以下步驟處理。將載玻片和蓋玻片分別浸泡在5潔消精（蘇洲吳縣化工二廠）中12小時，用35-40溫水中沖洗30min，再用雙蒸水漂洗3次，每次5min，室溫下干燥切片后,在180烤箱內烘烤46小時，蓋玻片可按近期內所需量，用鋁箔紙包裹后烘烤后存放。為防止組織或細胞標本在雜交過程中漂起或脫落，載玻片應涂以粘附劑，大的冰凍或石蠟切片建議用明膠粘附劑，活檢或較小的標本建議用多聚左旋賴氨酸或硅烷粘附劑。2.明膠涂片制備取10克明膠（Merck）溶于1000毫升4050雙蒸水中，待明膠完全溶解后加入4毫升25%硫酸鉻鉀溶

42、液(chromiumpotassiumsulfateCPS)，使CPS的終濃度為0.1。將烘烤后的載玻片浸泡在明膠溶液中10min，在室溫下干燥玻片。再將載玻片浸泡在含有1多聚甲醛，PH7.4的PBS溶液中10min；在室溫下干燥玻片后再將載玻片浸泡在含有1多聚甲醛，PH7.4的PBS中10min，在室溫下干燥玻片。60烤箱內過夜備用。3.多聚左旋賴氨酸涂片的制備取2-4mg多聚左旋賴氨酸(Sigma)，分子量在300000以上，溶于1ml消毒去離子水中。經旋渦器反復攪拌，吸取2030l滴加到玻片一側，再取另一張載玻片復合，將賴氨酸溶液均勻涂抹在裱組織切片處，并將涂有粘附劑的一面用鉆筆標出，室

43、溫下干燥切片后，在60烤箱內過夜備用。4.硅烷涂片的制備取5毫升氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilaneAPES)(Sigma)溶于250ml丙酮內。將烘烤后的載玻片浸泡硅烷溶液中60min，用雙蒸水漂洗2次，每次10min干燥玻片后，60烤箱內過夜備用。注意事項：載玻片的粘附劑及涂片制備，以組織切片或細胞不脫落，不干擾雜交信號，低背景，經濟及制備方便為原則，在制備過程中，需戴一次性手套及口罩，防止手指皮膚上的RNA酶的污染。多聚左旋賴氨酸溶液的溶度可按實際應用效果調整，并應注意有效期限，制備載玻片應盡快使用，防止賴氨酸解聚而失效。5.新鮮標本的儲存和冰凍

44、切片制備為RNA原位雜交作新鮮標本儲存和冰凍切片過程中，應嚴防RNA酶的污染，制備過程中所使用的容器、刀具等均經高壓消毒或清潔后用0.1%焦碳酸二乙酯(DiethylpyrocarbonateDEPC)水清洗。為防止RNA迅速降解，標本離體后，先切成1.51.2cm大小，其厚度不超過0.2cm，應迅速投入4多聚甲醛溶液內，置4冰箱內2-4小時。再將組織移入30蔗糖PBS溶液內，4冰箱內過夜。次日可將標本儲存于-80或-140超低溫冰箱內保存。如作冰凍切片，先將組織在-20恒冷切片機內停留,待溫度回升后，然后在恒冷冰凍切片機內切成7m薄片。40烤箱內干燥切片2小時后儲存在-80或-140超低溫冰

45、箱內備用。6.標本的固定和石蠟切片的制備石蠟切片作RNA原位雜交的，也應嚴防RNA酶的污染、容器、刀具等去除RNA酶的過程同冰凍切片。為防止RNA迅速降解，離體后標本應立即有效固定。為保存良好組織結構，有利探針的穿透力，應選用合適的固定劑。常用的化學固定劑可分為，沉淀固定劑和交聯固定劑兩類。前者有乙醇，甲醇和丙酮等，后者有多聚甲醛，甲醛和戊二醛等。經沉淀固定劑固定的組織通透性較好，利于探針穿入，但過長時間固定，可引起RNA降解。其不足之處是：組織形態結構的保持不如交聯固定劑。交聯固定劑能較好保存組織中RNA和組織形態結構，但固定時間過長，也可發生胞漿和胞核內大分子化合物形成交聯，影響探針的穿透

46、力，阻礙雜交體的形成。4多聚甲醛固定液取4g多聚甲醛和0.25g甘氨酸分別溶于100ml0.01mol/LPH7.0PBS溶液，組織在常溫下浸泡于4多聚甲醛中4小時，每1小時將組織在真空下吸干10min，再注入新的固定液，共4次。然后用0.01mol/LPH7.0的PBS漂洗2次，每次30min。福爾馬林醋酸固定液福爾馬林醋酸固定液由50酒精、10福爾馬林和5醋酸組成。在常溫下將組織浸泡4小時，每1小時在真空下吸干10分鐘，再注入新的固定液，共4次，然后用50酒精漂洗2次，每次30min。(五)雜交前探針的選擇1.RNA探針:RNA探針的長度以50-150堿基為佳，探針易進入細胞，雜交率高，雜

47、交時間短。長500個堿基的探針雜交時間約需20個小時左右，如超過500個堿基的RNA探針則在雜交前用有限堿基水解法控制其長度。(1)孵育時間t=Lf-Lo/KLoLf(Lo核酸探針原長度(kb)，Lf核酸探針水解后所需長度(kb)，K是常數率0.11kb/min)。(2)在室溫中加入下列試劑終止水解：3mol/L醋酸鈉，6.6l(終濃度0.1mol/L)，醋酸1.3l(終濃度為0.5%)。(3)加入下列試劑沉淀探針：7mol/L醋酸銨100l，100%乙醇750l，RNA(10mg/ml)2l，置-202小時后恢復到室溫，在1400rpm離心30min。(4)小心將乙醇倒出，待試管內干燥后再用

48、無菌ddH2O稀釋到10ng/l濃度。(5)最終探針長度可于10%聚丙稀酰胺凝膠在60的尿素中電泳檢測。2.探針的長度原位雜交反應中探針濃度應超過靶序列的濃度，探針濃度必須給予該實驗最大信噪比，因為背景著色度高低與探針濃度有關。最佳探針濃度是最低探針濃度達到靶核酸的最大飽和結合度為目的。探針濃度按其種類而略有不同，放射性標記cRNA探針的濃度為0.5ng/l，而非放射性標記cRNA探針的濃度1.0ng/l。雜交液的量要適當，每張切片以30-50l為宜。保持雜交液不流失的關鍵是，載玻片的清潔處理必須徹底，應用雜交罩等也很必要。3.雜交的溫度和時間設置和調整雜交溫度是RNA原位雜交的重要環節。雜交

49、溫度應低于解鏈或融解溫度(meltingtemperatureTm)20-30。多數RNA原位雜交Tm為95，由于這一溫度對保存組織形態完整和組織切片的粘附將產生不利影響，為此在雜交液中常以增加甲酰胺濃度來降低Tm值，因為每增加1甲酰胺濃度可降低0.72。另外雜交體中GC的百分比，雜交體長度以及雜交液中Na+的濃度也與Tm呈正相關。雜交反應的時間可隨探針濃度的增加而縮短，雜交時間過短會造成雜交不完全，雜交時間過長會增加非特異性著色。一般RNA原位雜交采用雜交孵育過夜，在黑暗環境下進行，可以避免光線對甲酰胺的電離作用。三、cRNA探針檢測組織切片中的RNA原位雜交(一)組織的前處理1.冰凍切片的

50、制備：(1)離體后組織應切成1.51.2cm，厚度為0.2cm。(2)立即投入4多聚甲醛溶液中（PBS新配制），4下固定2-4小時。(3)倒去固定液后，加入30蔗糖溶液（PBS新配制），4下過夜,次日將組織塊儲存在-80或-140超低溫冰箱內。(4)或將組織塊置于-20恒冷切片機內切成10m薄片，粘附于涂有粘附劑的載玻片上置室溫下，置40恒溫箱內過夜，或置40恒溫箱內至少2小時，后將切片放入切片盒在-80超低溫冰箱內存放備用。2.組織的固定和石蠟切片的制備：(1)離體后組織切成不大于1.51.2cm、厚0.2cm。(2)立即投入4%多聚甲醛溶液內(PBS新配制),或2.5戊二醛，在室溫下固定3

51、-4小時。(3)用PBS沖洗，經梯度酒精脫水、二甲苯透明和浸蠟包埋切片。(4)切成5m薄片粘附于涂有粘附劑的載玻片上，在40恒溫箱內過夜干燥切片，用新的二甲苯脫蠟210min和100、95、70、各級酒精15min，ddH2O漂洗25min。注意事項(1)切除的新鮮標本應立即作組織固定或低溫儲存，以免mRNA降解。(2)標本盡可能采多聚甲醛固定及蔗糖浸泡作冰凍切片，這一制備法既能避免mRNA降解，又能保持良好的組織形態。(3)對外檢病例中，采用10福爾馬林固定標本的，為利于mRNA檢測，固定時間不要超過36小時，以免引起RNA與蛋白質之間發生交聯。(4)在冰凍切片和石蠟切片制作過程中，所使用的

52、容器、器械都要經高壓消毒，或清潔后用0.1%DEPC水清洗，再經ddH2O沖洗，避免外源性RNA酶污染。(二)RNA探針的標記RNA探針的制備需將cDNA探針克隆到帶有RNA多聚酶啟動子的質粒，然后轉錄制成RNA探針。用EDTA緩沖液和DEPC處理的ddH2O將會影響RNA多聚酶中的質粒。RNA探針的長度應500bp，500bp的探針不易與mRNA形成雜交體。對探針標記、預雜交、雜交和后雜交流程中使用的容器、ddH2O均需經0.1%DEPC處理，為避免RNA酶污染，操作人員必須戴手套和口罩操作。RNA探針的純化：在雜交探針中加入5l10乙酸(aceticacicl)，11l3mol/L醋酸納P

53、H6.0，1l10mg/mltRNA，1.2l1mol/LMgCl2，300l冷酒精。在-20孵育4-16小時。在4下15min，使RNA發生沉淀。真空下干燥RNA沉淀物。用DEPC處理的ddH2O含標記的RNA探針1050g/ml。RNA探針的水解：按以下方法減少探針長度為近200bp，在Microcentrifuge管內加入50lRNA探針標記液，加入30l200mmol/LNa2CO3和20l200mmol/LNaHCo3。將雜交探針置于60條件下，按以下方法計算水解時間，t（L0Lf）/(K.LO.Lf)(L0RNA探針原長度(kb)，LfRNA探針水解后所需長度，K常數率（K=0.1

54、1kb/min），t水解時間)。(三)預雜交(1)切片用DEPC處理的PBSPH7.4(140mmol/LNaCl，2.7mmolKCl,10mmol/LNa2HPO4,1.8mmol/LKH2PO4)孵育25min，再用DEPC處理的含100mmol/L苷氨酸(Glycine)PBS孵育切片25min。(2)用DEPC處理的含0.3%TritonX-100PBS孵育15min。(3)用DEPC處理的PBS漂洗25min。(4)冰凍切片用TE緩沖液（100mmol/LTris-HCl,50mmol/LEDTAPH8.0）不含RNA酶的1g/ml蛋白酶K，在37下通透切片30min。石蠟切片用T

55、E緩沖液配制的不含RNA酶的5-20g/ml蛋白酶K，在37下通透切片30min。(5)在4下用DEPC處理的4多聚甲醛PBS溶液作后固定5min。(6)再用DEPC處理的PBS沖洗切片25min。(7)切片作酸酐處理，處理液含0.25醋酸酐、0.1mol/L三乙醇胺(TriethanolamineTEA)PH8.0，振蕩漂洗25min。(8)在37孵育切片后，雜交緩沖液沖洗（含50去離子甲酰胺的4SSC），至少10min。注意事項(1)切片的通透化是RNA原位雜交關鍵步驟，特別對回顧性資料尤為重要，因固定液種類和固定時間的不同，需作最佳通透化條件探索，包括蛋白酶K濃度，孵育時間20-30mi

56、n之間調整，甚至采用0.2mol/LHCL配制的0.1胃蛋白酶。(2)由于醋酸酐極不穩定，宜將醋酸酐在使用前加到TEA緩沖液中。(3)1SSC=150mmol/LNaCl,15mmol/LsodiumcitratepH7.2。(四)原位雜交(1)雜交液(40去離子甲酰胺、10葡聚糖、1Denhardts、0.02%Ficoll、0.02%聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、10mg/ml去RNA酶的牛血清、4SSC、10mmol/LDTT、1mg/ml變性的剪切鮭魚精子DNA）的準備。(2)瀝干后用雜交緩沖液漂洗，并沿組織周邊擦干，每張切片滴加30l探針雜交液(內含5-

57、10ng非同位素標記cRNA探針)。(3)用2430mm雜交罩(hydrophobicplasticcoverslip)復蓋雜交組織。(4)置42濕盒內過夜。注意事項：雜交液應新配制，并在-20下儲存，新配制雜交液能使用幾個月。(五)雜交后處理(1)揭去雜交罩將切片浸泡于2SSC中5-10min。(2)在37用2SSC215min、1SSC215min振蕩漂洗。(3)為消除未雜交單股cRNA探針，在37含RNA酶A的NTE緩沖液(500mmol/LNaCl,10mmol/LTris,1mmol/LEDTA,PH8.0)中漂洗30min。(4)置37用0.1SSC振蕩漂洗230min。注意事項在

58、同一容器中不能同時放入含不同探針切片。(2)如果雜交的背景較高，非特異性信號較多，可采用52含5甲酰胺的2SSC洗脫。(六)雜交后顯色(1)用BufferAPH7.5(100mmol/LTris-Hcl,150mmol/LNaCl)振蕩漂洗切片210min。(2)每張切片滴加封閉液40l(含0.1%TritonX-100和2%正常羊血清的BufferAPH7.5)。(3)抖去封閉液，每張切片加羊抗地高辛抗體AKP結合物30l(BufferA內含0.1TritonX-100,1%正常羊血清,羊抗地高辛抗體AKP結合物)在溫盒內2小時。(4)用BufferA振蕩漂洗切片210min。(5)用Buf

59、ferBPH9.5(100mmol/LTris-Hcl,100mmol/LNaCl，50mmol/LMgCl2)孵育切片10min。(6)顯色液配制：用10mlBufferBPH9.5，內含45l硝基四氮唑藍(NitrobluetetrazoliumNBT)(75mg/mlNBT,70%二甲基甲酰胺），35l5溴4氯3吲哚基磷酸鹽(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphateBCIP)或X-Phosphate(50mgX-Phosphate/ml,100%二甲基甲酰胺)。(7)每張切片200l顯色液，在黑暗條件下顯色2-24小時。(8)顯色滿意后用BufferCPH

60、8.1(10mmol/LTris-Hcl,1mmol/LEDTA)沖洗漂洗切片。(9)ddH2O中止反應。(10)用0.02亮綠或0.1%核固紅復染細胞核1-2min。(11)用自來水洗210min。(12)用即用型(GvaMount）水溶性封片劑封片。注意事項(1)顯色液的配制：10mlBufferBPH9.5溶液中含有45lNBT(70二甲基甲酰胺中含有75mg/1mlNBT），35lBCIP或X-磷酸鹽（100二甲基甲酰胺中含有50mg/mlX-磷酸鹽），1mmol/L左旋咪唑(levamisole)(2.4mg/10ml左旋咪唑Sigma)。(2)抗地高辛抗體AKP的最佳濃度探索可采用