1、研究生：石成奎 導 師：王 俊 副教授 謝俊霞 教 授 專 業：神經生物學 時 間：2015-12-22 -突觸核蛋白（-synuclein）在小膠質細胞鐵代謝中的作用及其分子機制1 研究背景2 立題依據3 技術路線4 實驗目標目 錄1 研究背景帕金森病（Parkinsons disease, PD）帕金森病是一種目前無法治愈的神經退行性疾病，其特點是錯誤折疊和聚集-突觸核蛋白，通常被稱為突觸核蛋白病病理特征： 黑質致密部多巴胺能神經元進行性死亡，以及出現異常聚集的-突觸核蛋白構成的路易氏小體。臨床表現：靜止性震顫 肌僵直 運動不能 姿勢反射障礙1-突觸核蛋白（-synuclein）：是一個由

2、140 個氨基酸組成的可溶性蛋白，認為在突觸囊泡釋放和轉運的調節起著重要的作用，還與脂肪酸結合，和神經元存活有關。雖然神經病理學研究發現-突觸核蛋白異常聚集通常伴有鐵的沉積，說明鐵與-突觸核蛋白聚集之間存在一定聯系。但是，目前研究仍然沒有對于三種狀態-突觸核蛋白的毒性形成共識，阻礙我們將該蛋白作為干預治療PD的目標。1 研究背景22 立題依據-突觸核蛋白具有單體、寡聚體、多聚體三種形態。在腦內，主要由神經元分泌并釋放進入胞外空間，并可被相鄰的神經元，小膠質細胞及少突細胞吞噬。已有研究組測試了神經元細胞、小膠質細胞、星形膠質細胞對胞外聚集化的-突觸核蛋白的內吞能力，發現小膠質細胞對-突觸核蛋白的

3、內吞能力是最強的。32 立題依據同時研究發現小膠質細胞有鐵的沉積，下面以小腸鐵轉運為例說明-突觸核蛋白是否參與小膠質細胞鐵代謝。42 立題依據 十二指腸細胞色素b（Dcytb）是一種鐵還原酶，近年來的研究發現-突觸核蛋白也是一種鐵還原酶，能將細胞內的Fe3+還原成 Fe 2+。這表明-突觸核蛋白可能作為一種鐵代謝的調節蛋白，參與了小膠質細胞鐵的沉積。DMT1-synFe3+Fe2+Fe2+FPN1-synFe3+Fe2+猜 想microglia52立題依據 -突觸核蛋白三種形式具有不同的生物學功能。其單體可以同多種磷脂發生作用，寡聚體主要擾亂帶負電荷的囊泡，而多聚體能夠作用于負電荷的囊泡和細胞

4、膜。 已有研究證明寡聚體和多聚體形式的-突觸核蛋白對細胞毒性作用是通過與細胞膜相互作用和破壞膜完整性完成的，但是目前研究仍然沒有對三種形態-突觸核蛋白的毒性強弱達成共識。因此，確定-突觸核蛋白三種形態毒性的強弱是必要的。了解哪種形式-突觸核蛋白對小膠質細胞鐵轉運影響最大。63技術路線 -突觸核蛋白寡聚體的制備1 將100 uM -突觸核蛋白單體溶解于0.01M PBS中（pH 7.0），過濾除菌。將溶液200-300ul裝在Eppendorf管中，在37度恒溫搖床230rpm振蕩孵育。2 Eppendorf管傾斜，振蕩時間應大于72-96小時。每天觀察有無沉淀，如果有明顯沉淀，說明有纖維形成，

5、最好在沒有纖維形成前停止。3 Western blot檢測，凝膠的濃度10%。 7 -突觸核蛋白多聚體的制備1.-突觸核蛋白單體（200Mm）溶解在包含50Mm trisHCl（pH值7.5）及150MmKCl中，通過0.22m過濾器過濾除菌。2 600rpm 37C 振蕩4天。3.多聚體15000rpm離心10min，PBS重新懸浮沉淀。重復兩次。4.電鏡檢測多聚體。3技術路線8雙擊添加標題文字IRPs表達變化HIF表達變化DMT1表達量變化FPN1表達量的變化鐵轉入轉出變化monomers/oligomers/fibrils小膠質細胞原代培養BV2小膠質細胞系培養3技術路線9monomersoligomersfibrilsBV2小膠質細胞系培養小膠質細胞原代培養3技術路線IRPs表達變化HIF表達變化DMT1表達量變化FPN1表達量的變化鐵轉入轉出變化-突觸核蛋白抗體10黑質上方注射-突觸核蛋白的小鼠動物模型0X-42/DMT1共表達0X-42/FPN1共表達鐵水平變化3技術路線11-突觸核蛋白抗體黑質-突觸核蛋白的攝取4實驗目標1.確定三種形態-突觸核蛋白（單體、寡聚體、多聚體）的高鐵還原酶活性的大小，確定外源性-突觸核蛋白對小膠質細胞DMT1，FPN1以及IRP1和HIF表達量的影響及胞內鐵轉入轉出的變化。2.抑制-突觸核蛋白鐵還原酶的活性，觀察小膠質細胞DMT