1、細胞培養技術的公開課主要內容 1.細胞原代傳代培養概念及培養細胞的應用 2.細胞培養的條件及環境 3.體外培養細胞類型及形態 4.細胞培養基本技術 5.細胞原代培養方法 6.培養細胞活性測定 7.細胞傳代培養方法、細胞保存細胞原代傳代培養概念及培養細胞的應用 Wilhelm Roux (1850-1924 ) 1885年Roux最早嘗試使組織離體培養，材料是雞胚神經板，采用生理鹽水為培養液，并首次采用組織培養這個術語。前 言 Alexis CarrelFranceRockefeller Institute for Medical Research New York, NY, USAb. 187

2、3d. 1944 1907年Harrison 和1912年Carrel開始把組織培養作為一種方法，用于研究離體動物細胞的培養。 他建立的雞胚胎成纖維細胞持續了34年之久(1912-1946) One of Carrels D-flasks which were manufactured from PYREX glass 細胞培養的條件及環境 - 營養條件- 無菌環境- 恒定溫度- 氣體- PH值 無菌條件：凈化工作室，風淋室，傳遞窗，高效過濾器，潔凈層流罩，生物安全柜，超凈工作臺，紫外燈，電熱干燥箱，濾器，高壓滅菌器，抗生素細胞生長條件：純水蒸餾器，純水儀，培養板，培養瓶，CO2培養箱，培養基

3、，血清細胞檢測條件：倒置顯微鏡，酶標儀，微孔板震蕩器，高速離心機，移液器細胞保存條件：液氮罐實驗室安全： 超凈工作臺 超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機驅動空氣通過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內構成無菌環境。紫外燈：紫外線消毒。主要用于培養室空氣、操作臺、塑料培養皿和培養板等表面消毒紫外燈大約分為3種，分別是UVA、UVB和UVC。UVC是目前工業上所應用的紫外線殺菌燈(253.7nm)，是最常見的一種。高功率紫外線燈經8000小時，一般紫外線燈則在3000小時後功率會降至原來70，這時就應該更換。國內的標準是：30W新燈管的輻射強度90uw/

4、cm2為合格；使用中輻射強度應70uw/cm2。少于此標準就要更換。大容量高壓滅菌器手提式高壓滅菌器濾菌器培養器材CO2培養箱自動雙重純水蒸餾器 純水儀液氮罐培養細胞的生長條件細胞培養用液的配制水：新鮮的三蒸水或去離子水培養基：合成培養基： 合成培養基是根據細胞生存所需物質的種類和數量，用人工方法模擬合成的。目前已設計出許多種培養基，如M199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。 合成培養基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質。 優點：標準化生產，組分和含量相對固定。成本低。缺點：缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。抗菌素的使用：在培養液配制后，培養液內

5、常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細菌的生長。通常是青霉素和鏈霉素聯合使用。培養基內青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素：每毫升100單位方便、廣譜、穩定。完全培養基的組成培養基的配制平衡鹽溶液 主要用于作為稀釋和灌注的液體，維持細胞滲透壓，提供緩沖系統，使培養液的酸堿度維持在培養細胞生理范圍內，提供細胞正常代謝所需的水分和無機離子等。常用的有PBS，Hanks等。其它添加成分 緩沖系統，常用為HEPES（N-2-hydroxy-ethylpiperazine-N-ethanesulfonic acid），緩沖效能(pKa)在20時為7.55，37為7.31； HEPES不是起

6、維持pH恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速pH變化的，所以調整pH常常用NaHCO3溶液。有機補充物，如丙酮酸鈉， 谷胺酰氨等。促細胞分裂因子，如生長因子類的FGF(成纖維細胞生長因子)，EGF(表皮生長因子)。貼壁和鋪展因子，如膠原蛋白，纖粘蛋白等。可根據培養細胞的特殊要求進行添加。 （一）貼壁型：大多數培養細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞，判斷細胞形態時不能按照體內組織學標推判定，僅大致分成以下四型： -成纖維細胞型 -上皮型細胞 -游走細胞型 -多型細胞型體外培養細胞的形態 名稱：凡在培養中形態與成纖維細胞類似的來源：由中胚層間充質組織起源的組織如：真正的成纖維細胞，心肌，平滑肌，成骨細胞

7、，血管內皮 形態：似體內成纖維細胞的形態，胞體梭形或不規則三角形，胞質向外伸出23個長短不等的突起，中有卵圓形核 生長特點：排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連成片，細胞細胞接觸易斷開而單獨行動，游離的單獨的成纖維樣細胞，常有幾個伸長的細胞突起成纖維細胞型成纖維細胞 心肌細胞 2、上皮型細胞： 細胞呈扁平不規則多角形，中央有圓形核，細胞彼此緊密相連成單層膜。生長時呈膜狀移動，處于膜邊緣的細胞總與膜相連，很少單獨行動。起源于內、外胚層的細胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態。 名稱：僅形態上似體內，實際上不完全相同 來源：來源于外胚層、內胚層細胞, 如：皮膚及其衍生物

8、,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性腫瘤 形態：類似體內的上皮細胞扁平，不規則多角形，中有圓形核 生長特點：易相連成片，相靠緊密相連成薄層鋪石狀生長時呈膜狀移動，很少脫離細胞群而單個活動上皮型細胞 3、游走細胞型： 呈散在生長，一般不連成片，胞質常突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規則。此型細胞不穩定，有時難以和其他細胞相區別。 4、多型細胞型： 有一些細胞，如神經細胞難以確定其規律和穩定的形態，可統歸于此類。多型細胞型游走細胞型 （二）懸浮型： 見于少數特殊的細胞，如某些類型的癌細胞及白血病細胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細胞容易大量繁殖。 概念：培養時不貼附于底物而呈懸浮狀態生長

9、 或以機械方法使保持懸浮狀態下生長 來源：自血，脾或骨髓，尤以血中白細胞癌腫 細胞也可能 特點： 在懸浮中生長良好細胞圓形，單個或小 細胞團 優點： 生存空間大，提供數量大，傳代方便(不 需消化)，易于收獲，可獲得穩定狀態缺 點：觀察不方便，很多細胞不能懸浮生 長(尤以正常細胞)細胞培養條件 細胞潔凈間實驗設備手術器械玻璃器材細胞原代培養方法- 組織塊消化法- 直接貼壁法 培養細胞活性測定 臺盼藍排斥法FDA-PI雙色熒光檢測法 MTT法方法： 1、將細胞懸液以0.5ml加入試管中； 2、加入0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分 鐘； 3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片； 4、鏡下

10、取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數，計細胞活力；死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。活力測定可以和細胞計數合起來進行，但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用。臺盼藍法臺盼藍法FDA-PI雙色熒光檢測法 在藍色光激發下( 495nm ), 活細胞被雙醋酸熒光素FDA 染成亮綠色, 死亡細胞被碘化丙錠PI染成紅色。四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍；MTT比色法的原理：活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍紫色產物(formazan, 甲攢)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結晶物，溶液顏色深淺與所含

11、的formazan量成正比。再用酶標儀測定OD值； MTT法簡單快速、準確，廣泛應用于新藥篩選、細胞毒性試驗、腫瘤放射敏感性實驗等。四唑鹽（MTT）比色法細胞傳代培養方法 細胞消化細胞傳代方法 細胞保存 細胞凍存和復蘇 細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規工作。細胞凍存與細胞傳代保存相比可以減少入力、經費，減少污染，減少細胞生物學特性變化。凍存和復蘇的原則：慢凍快融 當細胞冷到零度以下，可以產生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內不致產生大的冰晶；相反，冰晶很大，大冰晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融，目的是防止

12、小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。慢凍程序 標準程序： 當溫度在-25以上時，12/min 當溫度達-25以下時，510/min 當溫度達-100時，可迅速放入液氮中 簡易程序： 將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降12的速度，在40分鐘內降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。低溫保護劑的應用 在細胞凍存時加入低溫保護劑，能大大提高凍存細胞存活率。 常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結過程，能使細胞內水分在凍結前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。細胞凍存方法1.預先配制凍存液：含20%血清培養基，10% DMSO，DMSO液用培養液配好，避免因臨時配制產熱而傷害細胞；2.取對數生長期細胞，經胰酶消化后，加入適量凍存液,用吸管吹打制成細胞懸液（1106 5 106細胞/ml)；3.加入1ml細胞于凍存管中，密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍日期。Mr Fros