1、聚合酶鏈反應極其相關技術研究分析 聚合酶鏈反應于1983年由美國Cetus公司K. Mullis博士建立，并和定點突變的發明者M. Smith一起榮獲1993年度諾貝爾化學獎，為生命科學領域的研究開創了嶄新時代。PCR反應的特點特異性強 引物與模板結合的特異性及聚合酶的忠實性 靈敏度高 指數增長，從pg (10-12)可擴增至 mg (10-6)水平 簡便、快速 24小時完成擴增對標本的純度要求相對較低 DNA 粗制品及總RNA均可作為擴增模板 一、PCR反應原理和反應過程Amplification of DNA in vitro including: 變性（denaturation）: 94

2、 C95 C 退火（annealing）: 40 C70 C 延伸（extension）: 72 C 三個步驟作為PCR的一個循環，每當完成一個循環，一個分子的模板被復制為二個，產物量以指數形式增長。二、PCR的反應體系和反應條件PCR反應體系參與PCR反應的主要成份(principle components):Template、Primers、dNTPTaq DNA polymeraseBuffer模板(Template)基因組DNA、RNA、質粒DNA、線粒體DNA等RNA作為模板時，須先將RNA逆轉錄cDNA，再以 cDNA作為擴增的模板模板量：1000ng、500ng、100ng、50

3、ng引 物（Primers) 引物決定PCR擴增產物的特異性和長度，是化學合成的寡核苷酸片段。化學合成的寡核苷酸能與模板特異地結合引物決定產物的特異性和長度引物設計時必須遵循相關原則 設計引物的原則二條引物分別位于被擴增片段的兩端，與模板正負鏈序列互補長度為18 25個核苷酸二條引物之間避免形成引物二聚體引物的堿基組成應平衡引物退火溫度計算：Tm=2(A+T)+4(C+G)引物的5端可被修飾（引入酶切位點、引入突變位點、生物素等標記）引物濃度：0.1 0.2 mol/L, 濃度過高容易生成引物二聚體Tm is defined as the temperature at which half t

4、he molecules are single-strandedEffect of % GC Content on TmEffect of Salt on Tm脫氧核苷三磷酸（dNTP） dATP、dCTP、dGTP和dTTP 4種脫氧核苷三磷酸的混合物 反應體系中各種核苷酸的濃度必須一致 濃度過高雖能加快反應速度，但非特異性擴增也隨之增加 dNTP濃度：20 200mol/L, 濃度升高增加非特異性擴增DNA聚合酶(DNA polymerase)從一種生活在熱泉水（8090）中的水棲噬熱菌（Thermus aquaticus, Taq）中提取，有很高的耐熱穩定性 Taq 酶的作用: 在模板指

5、引下以dNTP為原料，在引物3-OH末端加上脫氧單核苷酸，形成3, 5 -磷酸二酯鍵，使DNA鏈沿53方向延伸，催化DNA合成最適酶量：1U （酶量過多導致非特異性擴增）Taq DNA聚合酶復制的保真性：Taq DNA聚合酶無35外切酶活性，因而無校正功能，在復制新鏈的過程中會發生堿基錯配Taq DNA聚合酶在每次循環中產生的移碼突變率為1/30000，堿基替換率為1/8000，故擴增片段越長，錯配的機率越高耐熱的 DNA多聚酶Pwo DNA polymerase、Tth DNA polymerase、Pfu DNA polymerase具有較高的熱穩定性，較高的保真性，降低堿基錯配率2 10

6、倍鎂離子濃度鎂離子濃度是一個至為關鍵的因素，對于穩定反應系統、穩定核苷酸和提高Taq 酶的活性有直接影響雖然Taq 酶的活性只與游離的Mg2+濃度有關，但PCR反應體系中dNTP、引物、模板DNA及鰲合劑的存在均可與Mg2+結合而降低游離Mg2+的濃度從而影響酶的活性當dNTP濃度為200 mol/L時，MgCl2的濃度為1.5mmol/L較宜。其它反應因素 pH：調節至酶反應所需的最適左右）鹽： 合適的鹽濃度有利于穩定雜交體，有利于引物與模板雜交基質：BSA、gelatin、Tween 20、DTT等（牛血清白蛋白或明膠等基質可以保護Taq 酶的活性）PCR的反應條件 反應溫度（變性、退火、

7、延伸）反應時間（變性、退火、延伸）循環次數（PCR效率及產物量）溫度 變性溫度：94 97退火溫度：低于引物Tm 5左右 溫度過高降低擴增效率；溫度過低：增加非特異性擴增延伸溫度：72 此時Taq酶具有較高的酶促活性時間 第一次變性應給予足夠時間（5 7分鐘）每一個步驟所需時間取決于擴增片段的長度，一般為30秒1分鐘，時間過長易導致非特異性擴增循環次數 重復次數一般設為2535個循環擴增反應的平臺效應： 理論上PCR反應產物呈指數性增長，但在擴增2535個循環以后便放慢直至停止，達到反應平臺，此時擴增產物量不再隨循環次數的增加而呈指數增長指數增長期平臺期循環數 # 理論值 實際值Log 產物D

8、NAPCR的擴增過程平臺出現得遲早與模板的初始量有關，模板初始量越多，平臺出現得越早平臺效應產生的因素： 引物二聚體的產生、反應產物、各組分的消耗和變性、引物和已擴增的DNA片段間的競爭等以PCR為基礎的相關技術以PCR為基礎的相關技術逆轉錄PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)定量PCR (quantitative PCR )實時PCR (real time PCR )多重PCR (multiplex PCR) 免疫PCRPCR誘導定點突變原位PCR (in situ PCR) 逆轉錄PCR（RT-PCR）以細胞內總RNA或mRNA為材料進行體外擴增的

9、技術主要用于克隆 cDNA、合成cDNA探針檢測RNA病毒、分析基因表達等逆轉錄生成cDNA方式以隨機進行的PCR擴增所需的下游引物作為逆轉錄反應的引物以oligo(dT)作為引物，mRNA3末端polyA尾與之互補以人工合成的隨機序列六核苷酸混合物作為引物，進行擴增定量PCR對DNA或RNA樣本的靶序列進行定量分析主要用于基因表達的分析、病原體核酸的檢測等在定量PCR反應體系中，除了常規PCR反應所需的材料和試劑外，還必須引入內參照系統（相對定量），因為多種因素會影響最終產物量內參照系統一般選用與待測序列結構無關的基因，如-肌球蛋白基因、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(glyceraldehyde

10、-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) 等相對定量PCR通過凝膠電泳分析靶基因和內參照的PCR產物量，實現對樣本中靶基因的相對定量內參照基因一般選擇與靶基因序列無關的 “管家基因” 這些基因的含量相對豐富，轉錄比較穩定 相對定量PCR設計相對定量PCR實驗方案時須注意：預先確定最佳模板量和PCR循環數，使所采用的各反應參數在擴增指數范圍內，避免平臺效應相對定量RT-PCR將RNA逆轉錄為cDNA靶基因與“管家基因”同管擴增PCR產物的凝膠電泳分析不同模板量時線性擴增循環數的確定模板量62.5250ng時，27個循環內為線性擴增反應期不同循環次數時模板量的確定 62

11、.5250ng模板量至27個循環內為線性擴增相對定量PCR管家基因與靶基因擴增產物的長度應不同，以使電泳能將兩者分離開分別掃描管家基因和靶基因的條帶密度，二者之比即為靶基因擴增條帶的相對密度分析各靶基因相對密度的變化B-actin相對定量PCR 相對定量PCR的優勢與不足不需要特殊的檢測設備和試劑即可以對靶基因進行相對定量內對照系統無法排除參照基因本身表達變化的影響及參照基因和靶基因兩者擴增效率不同等因素對實驗結果的干擾對核酸擴增反應進行直接和動態監測，實現對靶基因的實時定量分析實時PCR（real time PCR）熒光定量PCR fluorescence quantitative PCR,

12、 FQ-PCR是一種實時PCR，通過監測熒光信號對PCR過程中產物量進行實時檢測，計算出PCR的初始模板量技術原理DNA交聯熒光染料技術基于熒光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer, FRET）技術DNA交聯熒光染料技術在PCR反應體系中加入SYBR Green I染料，該染料能選擇性地摻入至雙鏈DNA分子中，并且產生強烈熒光，結合的熒光信號和DNA含量成正比熒光信號的檢測在每一個循環的延伸期完成后進行成本較低，無須對引物或探針進行預先的熒光標記，適用于任何反應體系特異性不高，染料分子也會結合到非特異性擴增產生的雙鏈分子和引物二聚體中FRE

13、T技術水解探針技術 (hydrolization probe)技術雜交探針 (hybridization probe) 技術 分子信標 (molecular beacon) 技術 TaqManTM 技術原理5533d.NTPsThermal Stable DNA PolymerasePrimers5353535353535353Add Master Mix and SampleDenaturation535353535353AnnealingReaction TubeTaql53RQProbe53RQ5353TaqManTM 技術原理53RQExtension Step53Strand Dis

14、placement Taq3QR5533QTaqR5CleavagePolymerizationComplete53QTaqR35 Detection533QTaqR5lR臨床標本實時定量PCR的擴增曲線 Relative FluorescencePCR產物的終點檢測同一份標本作96復管的測定結果Lockey etal. (1998) Biotechniques 24:744-6終點檢測與實時監測的結果比較CtCt值的概念 Ct值：擴增曲線與基線交叉處的循環數(可以更為客觀地反映樣本中靶基因的初始拷貝數)定量PCR的外參照系統標準曲線的制備制備標準品并計算標準品濃度系列稀釋的標準品與被檢樣本同

15、時擴增儀器軟件繪制標準曲線并依據被檢樣品的Ct值給出每一反應中靶基因的拷數標準品的擴增曲線r = 實測數據與所得標準曲線的線性吻合度標準曲線實時定量RT-PCR檢測CEA基因拷貝數在監測胃腸癌微轉移中的應用 CEA基因在消化系統上皮腺癌，尤 其是直結腸癌和胃癌中高表達，因 此在腫瘤細胞內可檢測到其轉錄本。 在正常成人體內極少表達。正常成人體內CEA基因表達狀況胃腸癌腫瘤組織中CEA基因表達狀況 在腫瘤發生血道轉移時，外周血中有少 量腫瘤細胞殘留。用靈敏、特異的技術 檢測到這些腫瘤細胞中CEA基因的轉錄 本，是發現腫瘤早期轉移的關鍵。胃腸癌患者外周血中CEA基因表達狀況多重PCR (Multip

16、lex PCR ) 在同一反應體系中加入多對引物，同時擴增一份DNA樣本中多個不同序列的靶片段DMD基因外顯子缺失的檢測差異顯示PCR（differential display PCR, DD-PCR）一種以逆轉錄PCR為基礎的研究基因表達差異的技術DD-PCR 主要用于腫瘤和多種疾病的分子遺傳學研究，是目前篩選基因表達差異比較有效的方法之一 差異顯示RT-PCR (Differential display RT-PCR)PCR誘導定點突變 (PCR mutagenesis)產物末端引入點突變ABABP2P1PCR用酶A和B消化，將突變位點引入PCR產物（末端）PCR產物中間引入點突變EcoR

17、IHindIIIIsolate products, mixAmplifydigest, subclone sequencePvuIIPCR產物中引入片段性缺失ABP1P2P3P4PCRABPCRABPCR產物的檢測PCR-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP） 等位基因特異性寡核苷酸（allele specific oligonucleotide, ASO）單鏈構象多態性（single strand conformation polymorphism, SSCP） 變性梯度凝膠電泳（DGGE） 融點曲線分析（melting curve analysis）序列分析 PCR-RFLP利用正常序列

18、或突變序列是否處于限制性內切酶的酶切位點點突變處于某一限制性內切酶的酶切位點內，可在突變點兩側設計引物，使PCR產物含有該突變序列用相應的內切酶對正常產物和突變產物進行水解并作電泳分離，可根據水解片段的大小和電泳位置區分二者RFLP診斷鐮狀細胞貧血Southern blot analysisSouthern印跡雜交Southern blot analysisResults of Southern BlotControl TissueCancer TissueprobeEEPCR-SSCP單鏈DNA分子具有特定的二級空間構象，取決于該分子本身的堿基組成突變DNA的PCR產物經變性后產生與正常DN

19、A空間構象不同單鏈在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中時，不同構象的單鏈片段具有不同的電泳遷移率，從而能區別正常與突變的DNA 不同順序 不同構象 不同電泳行為DGGE是一種篩查單堿基突變及多態性的方法被檢DNA雙鏈分子的解鏈溫度因存在突變而發生改變，從而使電泳遷移率發生改變DGGE的突變檢出率可達90%100%變性梯度凝膠電泳 (DGGE)(-)(+)Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)(-)(+)LowHighDenaturant熔點曲線分析(melt

20、ing curve analysis)野生型序列和突變序列因不同Tm而產生不同的融點曲線熒光染料標記的雙鏈DNA分子或熒光標記的探針被儀器的檢測系統所識別DNA分子在復性時結合熒光最強，隨溫度的上升熒光量逐漸降低溫度升至其融點溫度（Tm）時熒光量急劇下降而形成融點曲線，其波峰所在溫度即代表被檢DNA分子的Tm值Tm值取決于DNA分子的長度和其序列中G/C堿基含量當被檢片段中存在突變時，就會有不同于野生型的Tm值而呈現不同的波峰如果一個被檢片段中存在一個以上的突變時，可以出現一個以上的波峰，從而可以將突變序列檢測出來 高分辨率熔點分析技術（high resolution melting, HRM

21、） 溫度 普通熔點曲線分析中每個監測點溫度升高的幅度為0.51.0，而HRM時則為0.020.1，即在同一溫度變化范圍內能獲得更多的監測數據點，體現了 “高分辨率”染料 一般常用的熒光染料為非飽和染料，在反應體系中如果加入過多量會抑制PCR擴增，因此實際使用濃度未達到飽和，此時染料不足以與DNA雙螺旋結構完全結合在DNA雙鏈解鏈過程中，非飽和染料會從已經完成解鏈的DNA序列上解離下來，再重新結合到未完全與染料結合的DNA雙鏈上，造成檢測結果不準確HRM中使用的染料不抑制PCR反應，可以加入較多量使之形成飽和狀態，占據雙鏈DNA的所有堿基對當雙鏈DNA局部解鏈時，游離下來的染料不會再重新結合到DNA分子上去，熒光強度的降低能更精確地反映出DNA分子的解鏈情況，更可靠地分辨出單個堿基序列的變化特異性 避免生成引物二聚體和非特異性擴增長度增加時，野生型和純合突變型片段Tm值差異變小，將對HRM的特異性和靈敏度造成一定影響