1、 基因技術(shù)大連醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室孔英 教授人類基因組：3 x 109 bp細菌基因組大腸桿菌： 4 x 106 bp如何研究基因的結(jié)構(gòu)、功能如何檢測基因的表達水平基因表達調(diào)控機制、調(diào)控后表達變化 基因工程 Genetic engineering 重組DNA技術(shù) Recombinant DNA Technology本章教學(xué)要求基因工程所需的酶、載體、操作過程分子雜交PCR原理、過程及應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動物、克隆動物、基因敲除基因診斷、基因治療方法、意義基因技術(shù)(4學(xué)時) Creating Dolly！1997年2月，英國“Nature”刊登了愛丁堡羅斯林研究所維爾穆特的研究成果，即“多

2、莉”羊的克隆成功，從此震驚了世界。取一普通綿羊乳腺細胞 將細胞核移植到一個剔除細胞核的卵子中 使之融合、分裂、發(fā)育成胚胎 移植到第三頭羊的體內(nèi)共培育277個胚胎，只有多莉成功出生核移植：利用顯微外科手術(shù)將胚胎細胞或成體細胞的細胞核移入去核的卵母細胞中，構(gòu)建成重組胚，培養(yǎng)后、胚胎移植，產(chǎn)生與供體細胞基因型相同的后代的技術(shù)，又稱動物克隆。根據(jù)核供體來源不同，分為胚胎細胞克隆動物和體細胞克隆動物。1998年4月與威爾士山羊戴維產(chǎn)下邦尼，證明克隆動物也能生育。2003.2.14日多莉因早衰并患有肺炎，被迫實施了安樂死。由于早衰問題，人們懷疑“多莉是穿著羔羊服裝的老羊” 多莉的生命歷程克隆(clone)

3、來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。技術(shù)水平：分子克隆(molecular clone) 即DNA 克隆(DNA cloning)細胞克隆器官（或組織）克隆個體克隆（動物或植物） DNA 重組技術(shù) (Recombinant DNA techniques) 利用限制性內(nèi)切酶、連接酶等在體外將不同生物體 DNA 片段 進行重新組合的技術(shù)。重新組合的 DNA片段稱重組 DNA 分子 又稱分子克隆（molecular cloning） DNA克隆（DNA cloning） 基因克隆（gene cloning) 基因工程（ Genetic en

4、gineering ）（目的基因的無性繁殖） 利用DNA 重組技術(shù)將目的基因與載體重組，再導(dǎo)入受體細胞 進行擴增和表達基因組 DNA克隆載體限制性內(nèi)切酶消化限制性內(nèi)切酶消化、電泳分離、純化DNA 連接酶重組DNA分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌宿主細胞細胞增殖分子克隆的基本過程在大腸桿菌宿主細胞中復(fù)制、擴增，從而獲得單一DNA分子的大量拷貝目的DNA片段能自主復(fù)制的遺傳元件基因組 DNA載體 (環(huán)狀 DNA)可被克隆的目的 DNA 片段線狀 DNA 載體篩選含目的基因的重組子限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌重組 DNA 分子組 織mRNAcDNA部分或全部酶切的 DNA加銜接物分子DNA 連接

5、酶反轉(zhuǎn)錄分分切接切接轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)篩篩克隆目的基因后，針對該基因進行特定蛋白質(zhì)或多肽制備以及定向改造基因結(jié)構(gòu)所用的方法及相關(guān)的工作統(tǒng)稱為基因工程（genetic engineering）。因此，重組DNA技術(shù)又稱為基因工程技術(shù) 工具酶 載體 目的基因 基因組 DNA 文庫篩選、PCR 產(chǎn)物 cDNA文庫篩選、RT-PCR 產(chǎn)物 化學(xué)合成 宿主細胞 導(dǎo)入重組 DNA 分子到宿主細胞 篩選攜帶目的基因的宿主細胞分子克隆的所需的條件工具酶在重組DNA技術(shù)中特殊用途工 具 酶功 能限制性內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5磷酸基和3羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個D

6、NA分子或片段連接堿性磷酸酶切除末端磷酸基反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA；替代DNA聚合酶I進行填補，標(biāo)記或DNA序列分析末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶 在3羥基末端進行同聚物加尾DNA聚合酶合成雙鏈cDNA分子或片段連接；缺口平移制作高比活性探針；DNA序列分析；填補3末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA 3末端標(biāo)記等Taq DNA聚合酶 常用于PCR；產(chǎn)物的3末端帶有A，可用于T-A克隆多核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針限制性內(nèi)切酶和修飾酶(Restriction endonuc

7、leases and modifying enzymes) 一、限制性內(nèi)切酶用于切割DNA限制性內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE)是識別DNA的特異序列, 并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。限制性內(nèi)切酶是重組DNA技術(shù)中重要的工具酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H“限制性” 限制性內(nèi)切酶只降解外源 DNA 而不降解宿主 DNA；“內(nèi)切酶”是指酶切位點在 DNA 分子內(nèi)，而不是兩端。ApR: Ampicillin resistance generep (ori): replication originlacZ: N-t

8、erminal -galactosidaseMCS: multiple cloning sitesMCS (pUC18 )限制性內(nèi)切酶的分類同一細菌株中不同的限制性內(nèi)切酶被發(fā)現(xiàn)和分離的順序，用羅馬字表示屬名(大寫)EcoRI種名(小寫)細菌株名(大寫)Escherichia 屬coli 種R株第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫斜體；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫斜體；第四個字母（有時無）代表株（可大寫或小寫）；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。類型 II 限制性內(nèi)切酶1.回文結(jié)構(gòu) (palindrome) 是雙鏈 DNA 分子中的反向重復(fù)結(jié)構(gòu)，即每條鏈從 5 3 方向讀其核苷酸序列都

9、相同。5 GGATCC 33 CCTAGG 55 AGATCT 33 TCTAGA 55 CCCGGG 33 GGGCCC 52. 識別序列(1) 具有回文結(jié)構(gòu)BamHI5 GGATCC 33 CCTAGG 5KpnI5 GGTACC 33 CCATGG 5(2) 具有間斷的回文結(jié)構(gòu)HinfI (XmnI)5 GANTC 33 CTNAG 5(3) 具有簡并性堿基HincII5 GT(T/C)(A/G)AC 33 CA(A/G)(T/C)TG 5(4) 無回文結(jié)構(gòu)MboII5 GAAGA(N)8 33 CTTCT(N)7 5GAATTCCTTAAGCTTAA5 -3 -3 -5 5 -3 -3

10、 -5 GAATTCG 5 P- 3 OH - OH 3 - P 5 CTGCAGGACGTC5 -3 -3 -5 CTGCA5 -3 -G - OH 3 - P 5 ACGTC 5 P-3 OH-G-3 -5 EcoRIPstI3. 經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后所產(chǎn)生的末端類型(1) 粘性末端 (sticky ends, cohesive ends)5 凸端 (5 overhang) 粘性末端3 凸端 (3 overhang) 粘性末端CCCGGGGGGCCC5 -3 -3 -5 5 -3 - OH 3 - P 5 CCCGGGGGGCCC 5 P -3 OH-3 -5 SmaI-3 -5 5 -3

11、 -5 -3 - OH 3 - P 5 GGCC 5 P - 3 OH-3 -5 CCGGGGCCCCGGHaeIII(2) 平端或鈍端 (blunt ends)同尾酶（isocaudarner） 有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的黏端，這樣的酶彼此互稱為同尾酶。這兩個相同的黏端稱為配伍末端(compatible end)。Bam HBg l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A4. 不同的酶可以產(chǎn)生同樣的末端 GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCC

12、CTAGGGCCTAGGATCC G+BstCCCGGGGGGCCCCCCCGGCCGGG G+XmaCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCC+Sma能識別同一序列（切割位點可同或不同）但來源不同的兩種酶互稱同工異源酶（isoschizomer）或同裂酶。 5. 不同的酶可以識別同一個序列 酶活性單位：在 37C (某些限制性內(nèi)切酶用 25C 或 50C) 條件下，每1小時酶切 1 g DNA 所用的酶量。6. 類型 II 限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)條件常用的酶反應(yīng)體系為 50 l，即10X 緩沖液5 lDNA2 gddH2O42.5 l限制性內(nèi)切酶 (10U/l)0.5 lT4 DNA 連接

13、酶 (T4 DNA ligase) 堿性磷酸酶 (Alkaline phosphatase)-去除核酸分子末端的磷酸基團DNA 聚合酶 I 大片段 (Klenow)T4 DNA 聚合酶 (T4 DNA polymerase)T7 DNA 聚合酶 (T7 DNA polymerase) Taq DNA 聚合酶 (Taq DNA polymerase) 逆轉(zhuǎn)錄酶 (Reverse transcriptase)-以RNA為模板合成cDNA末端脫氧多核苷酸轉(zhuǎn)移酶 (Terminal deoxynucleotidyl transferase) -用于給DNA末端加尾以構(gòu)成黏性末端 多核苷酸激酶 (Pol

14、ynucleotide kinase)使寡核苷酸鏈5羥基末端磷酸化DNA 核酸酶 I (DNA nuclease I)S1 核酸酶 (S1 nuclease)外切核酸酶 III (Exonuclease III) 外切核酸酶 ( Exonuclease)修飾酶 (Modifying enzymes)T4 DNA 連接酶, ATPTGCTTAA5 - 3 -ACG-OH 3 -P 5AATTCGTGCA- 3 - 55 P - 3 OH -TGCTTAA5 - 3 -ACG AATTCGT GCA- 3 - 5T4 DNA 連接酶 (T4 DNA ligase)催化 DNA 的 3-OH 和 5

15、-P 之間形成磷酸二酯鍵連接帶粘性末端的兩個 DNA 分子T4 DNA連接酶, ATPACG5 - 3 -TGC-OH 3-P 5TAGCCGTATCGGCA- 3 - 5 5 P - 3 OH -5 - 3 -TGCTAGCCGTACGATCGGCA- 3 - 5連接帶平端的兩個 DNA 分子 粘性末端平端 大腸桿菌DNA聚合酶I（DNA polymerase I）是基因工程中常用的DNA聚合酶。具有53聚合酶活性外 35及53核酸外切酶活性 常用于DNA探針缺口平移法（nick translation）標(biāo)記。 DNA聚合酶I主要用于合成DNAE.coli DNA聚合酶 I Klenow片段

16、Klenow片段是 E.coli DNA 聚合酶 I 的羧基端片段，長度為全酶的 70。具有 5 3 聚合酶活性及 3 5 外切酶活性。蛋白酶酶切位點 Klenow 片段 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 EcoRI5 G 3 5 AATTC 33 CTTAA 5 3 G 5 Klenow, dNTPs5 GAATT 3 5 AATTC 33 CTTAA 5 3 TTAAG 55 3 聚合酶活性：補平限制性內(nèi)切酶酶切所產(chǎn)生的 3 凹端而形成平端 5 GGTACC 3 3 CCATGG 5 KpnI5 GGTAC 3 5 C 33 C 5 3 CATGG 5 Klenow5 G 3 5

17、 C 33 C 5 3 G 53 5 外切酶活性：去除限制性內(nèi)切酶酶切所產(chǎn)生的3凸端而形成平端Taq DNA聚合酶常用于PCR 具有良好的聚合活性和熱穩(wěn)定性，常用于PCR。 具有53聚合酶活性及53外切酶活性 沒有35外切酶活性，因而無校對活性 故在PCR反應(yīng)中如果發(fā)生堿基錯配，該酶沒有校正功能 目前研發(fā)多種高保真耐高溫DNA聚合酶，降低PCR堿基錯配 Taq DNA聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移酶作用，能在所合成DNA鏈的3末端加上一個單獨的腺苷酸殘基（A）。這樣PCR產(chǎn)物可直接與帶有3-T的線性化載體（T載體）連接（即T-A克隆）。逆轉(zhuǎn)錄酶 (Reverse transcriptase，RT) 逆轉(zhuǎn)錄

18、酶為依賴 RNA的 DNA聚合酶，具有 5 3 聚合酶活性外，以 RNA為模板合成 DNA。 逆轉(zhuǎn)錄酶還具有核糖核酸酶H (RNase H) 活性，可 從 5 末端或 3 末端降解RNA:DNA雜合鏈中的 RNA。 逆轉(zhuǎn)錄酶無 3 5 外切酶活性。禽類逆轉(zhuǎn)錄酶和鼠類逆轉(zhuǎn)錄酶的比較以 mRNA為模板合成第一條 cDNA鏈，所用的引物包括 Oligo (dT)12-18特定序列的寡核苷酸 隨機序列的寡核苷酸 構(gòu)建 cDNA 文庫：用 Oligo (dT)12-18 引物 克隆特定的 cDNA：用特定序列的寡核苷酸引物 RT-PCR：用特定序列的寡核苷酸引物 制備 cDNA 探針：用特定序列的寡核苷

19、酸引物或 隨機序列的寡核苷酸引物MMLV RT催化的 cDNA合成 來自于大腸桿菌（bacterial alkaline phosphatase，BAP）或小牛腸（calf intestinal alkaline phosphatase，CIP）。用于脫去DNA（RNA）5末端的磷酸基團，使5 -P成為5 -OH，該過程稱核酸分子的脫磷酸作用。堿性磷酸酶能去除核酸分子末端的磷酸基團 P5OH3OH3P5OH5OH3OH3OH5 5 35533 53OHGGG GGdGTP末端轉(zhuǎn)移酶末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶用于給DNA末端加尾以構(gòu)成黏端 多核苷酸激酶可使寡核苷酸鏈5羥基末端磷酸化 常用的是T4多核苷

20、酸激酶（T4 polynucleotide kinase），該酶含5多核苷酸激酶和3磷酸酶活性，能催化ATP的-位磷酸向DNA和RNA的5-羥基轉(zhuǎn)移。 該酶常用于： DNA或RNA的5末端標(biāo)記； 使沒有5-末端磷酸的DNA片段磷酸化，以供連接和克隆之用。載體和宿主細胞 (Vectors and Host cells)載體（vector）是為攜帶感興趣的外源DNA，實現(xiàn)外源DNA在受體細胞中的無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子 按功能分克隆載體（cloning vector）表達載體（expression vector） 按基本元件的來源不同質(zhì)粒載體噬菌體載體黏粒載體病毒載體人工

21、染色體載體等載體概述載體 (Vectors) 克隆載體 (Cloning vector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設(shè)計的載體稱為克隆載體(用于構(gòu)建基因組文庫、cDNA文庫、克隆某一特定基因或 cDNA 以測定其核苷酸序列。 (1) 質(zhì)粒 (plasmid) (2) 噬菌體載體 ( phage) (3) 粘粒 (cosmid) (4) 細菌人工染色體 (Bacterial artificial chromosome, BAC) (5) 酵母人工染色體 (Yeast artificial chromosome, YAC) 表達載體 (Expression vector)為使插入的外源DN

22、A序列可轉(zhuǎn)錄和翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達載體。 用于表達某一基因或 cDNA以獲得目的蛋白質(zhì)，包括原核表達載體和真核表達載體，可根據(jù)要表達的目的蛋白的特點來選則載體。（一）克隆載體應(yīng)具備的主要特點至少有一個復(fù)制起點（origin of replication, ori）至少有一個選擇性標(biāo)志（selection marker）多個有適宜的限制性內(nèi)切酶的單一切點：稱多克隆位點（multiple cloning sites，MCS）應(yīng)有較高的拷貝數(shù)。 pBR322質(zhì)粒圖譜 克隆載體宿主細胞載體結(jié)構(gòu)外源插入片段質(zhì)粒大腸桿菌環(huán)狀質(zhì)粒0.1 - 10 kb 噬菌體載體大腸桿菌線狀病毒8 - 25

23、 kb粘粒大腸桿菌環(huán)狀質(zhì)粒35 - 45 kb細菌人工染色體大腸桿菌環(huán)狀質(zhì)粒50 - 300 kb酵母人工染色體酵母線狀染色體100 - 1000 kb不同類型克隆載體的比較用于外源DNA的克隆和無性繁殖 質(zhì)粒是存在于細菌染色體 (基因組) 外的 DNA 分子，其大小在 1 kb - 200 kb 范圍內(nèi)。 質(zhì)粒是雙鏈、共價閉合的環(huán)狀 DNA 分子，以超螺旋形式存在，帶有某些遺傳信息。 質(zhì)粒具有復(fù)制起始點，可在細胞中進行自我復(fù)制，并將質(zhì)粒 DNA 分配給子細胞。高拷貝數(shù)質(zhì)粒：10-200個/細胞低拷貝數(shù)質(zhì)粒：幾個/細胞 質(zhì)粒還含有在特定環(huán)境條件下所必需的基因，如抗生素的抗性基因。質(zhì)粒 (pla

24、smid)質(zhì)粒載體所攜帶的復(fù)制子基因組 DNA質(zhì)粒 DNA細菌基因組 DNA 和質(zhì)粒 DNA超螺旋質(zhì)粒 DNA閉環(huán)質(zhì)粒 DNA細菌克隆質(zhì)粒 (Cloning plasmid)(1) 為低分子量且高拷貝數(shù)質(zhì)粒。低分子量的質(zhì)粒易于提取并且不容易發(fā)生斷裂；高拷貝數(shù)質(zhì)粒可大量擴增被克隆的目的基因、DNA 片段或 cDNA。(2) 含有一個或幾個可供選擇的標(biāo)記，包括抗生素的抗性基因、細菌的 lacZ 基因片段及 ccdB 致死基因等。(3) 含多克隆位點 (Multiple cloning site, MCS)，即在質(zhì)粒的基因內(nèi)有多個限制性內(nèi)切酶單一識別位點，并允許外源 DNA 插入。抗生素的作用位點C

25、CONHCCCNOSHCH3HCH3HOOCH2NH氨芐青霉素-內(nèi)酰胺環(huán)-內(nèi)酰胺酶作用位點抗生素的抗性基因產(chǎn)物及其功能ApR: Ampicillin resistance generep (ori): replication originlacZ: N-terminal -galactosidaseMCS: multiple cloning sitesMCS (pUC18 ) 克隆質(zhì)粒帶有E. coli 乳糖操縱子的 lac 啟動子及編碼 - 半乳糖苷酶氨基端 (-供體片段，146 氨基酸) 的 DNA 片段。 E. coli 宿主細胞 (DH5, JM109, XL1-Blue 菌株)的乳糖

26、 操縱子的 -半乳糖苷酶基為缺陷型，只能編碼 -半乳糖 苷酶的羧基端片段 (-受體片段)。 異丙基 -D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 誘導(dǎo)質(zhì)粒上的 -供體 片段和宿主細胞的 -受體片段的表達，兩者結(jié)合后才有 -半乳糖苷酶活性，使底物5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖 苷 (X-gal) 產(chǎn)生藍色。兩個無活性片段組合而成為功能完 整的 -半乳糖苷酶的過程稱為 -互補。-互補 (-complementation)lacIPlacOCRP siteMCS lacZ”PlacOCRP site質(zhì)粒 lacZ宿主細胞基因組無外源 DNA 片段 插入 MCS-半乳糖苷酶氨基端 (-供體片段)IPTG 誘

27、導(dǎo)-半乳糖苷酶羧基端 (-受體片段)水解 X-gal (藍色菌落)-互補lacIIPTG 誘導(dǎo)-供體片段-受體片段-半乳糖苷酶活性X-gal.轉(zhuǎn) 化-半乳糖苷酶氨基端-半乳糖苷酶氨基端-半乳糖苷酶羧基端-半乳糖苷酶-半乳糖苷酶水解 X-gal，菌落呈藍色lacIPlacOCRP site外源 DNA 片段外源 DNA 片段破壞 lacZ外源 DNA 片段 插入 MCS質(zhì)粒宿主細胞基因組 lacZ”PlacOCRP site-半乳糖苷酶羧基端lacIIPTG 誘導(dǎo)IPTG 誘導(dǎo)無 -半乳糖苷酶氨基端產(chǎn)生 無 -半乳糖苷酶活性不水解 X-gal (白色菌落).外源 DNA 片段破壞 lacZ轉(zhuǎn) 化

28、無 -半乳糖苷酶氨基端-半乳糖苷酶羧基端無 -半乳糖苷酶活性不水解 X-gal，菌落呈白色 噬菌體 由 噬菌體改造而成的載體，可容納 5-25 kb的外源 DNA 片段，常用于構(gòu)建基因組文庫或 cDNA 文庫。(1) 插入型載體 只有一個目標(biāo)位點可供外源 DNA 插入的載體為插入型載體。可在克隆位點插入 5-11 kb 的外源 DNA 片段。(2) 置換型載體 在非必需 DNA 兩側(cè)有一對克隆位點的噬菌體載體稱作置換型載體。中部的 DNA 由外源 DNA 片段 (8-25 kb) 所置換。 噬菌體載體 ( Phage vector)外源 DNA重組 DNA 分子體外包裝攜帶重組 DNA 分子的

29、 噬菌體DNA 連接酶限制性內(nèi)切酶(1) 粘粒載體是質(zhì)粒和 噬菌體的重組體，將含有 cos 位 點的部分 DNA 插入到質(zhì)粒中即構(gòu)建成粘粒載體。(2) 粘粒載體可容納 35-45 kb 的外源 DNA 片段，用于構(gòu) 建基因組 DNA 文庫。(3) 粘粒載體可經(jīng)體外包裝而形成感染顆粒，然后轉(zhuǎn)導(dǎo)入 大腸桿菌，具有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)率。粘粒 (Cosmid)(1) BAC是環(huán)狀 DNA 分子，包括 MCS 抗生素抗性基因、 復(fù)制子：來源于大腸桿菌 F 因子 RepE：調(diào)節(jié)復(fù)制復(fù)合物在復(fù)制位點處組裝 parA-C 基因：確保子細胞含有單拷貝質(zhì)粒 cos 位點：用于噬菌體外殼蛋白包裝(2) BAC 可容納至 1

30、 Mb 大小的外源 DNA 片段。用電穿孔 方法將 BAC 與外源 DNA 片段的連接物導(dǎo)入大腸桿菌 或經(jīng)噬菌體外殼蛋白包裝后轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌。 細菌人工染色體(Bacterial artificial chromsome，BAC) 宿主細胞的選擇由所用的載體來決定，即細胞必須與載體匹配。1. 克隆用宿主細胞(1) 基因組修飾的大腸桿菌菌株，如 DH5, NovaBlue, JM109, XL1-Blue 等(2) 酵母細胞 Saccharomyces cerevisiae2. 表達用宿主細胞(1) 大腸桿菌菌株，如 BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS 等(2) 酵母細胞(3) 昆

31、蟲細胞系(4) 各種高等真核生物組織細胞宿主細胞 (Host cells)轉(zhuǎn)化 (Transformation)：將外源 DNA 導(dǎo)入細菌的過程。轉(zhuǎn)染 (Transfection)： 將外源 DNA 導(dǎo)入真核細胞的過程。 轉(zhuǎn)導(dǎo) (Transduction)：利用噬菌體將外源 DNA 導(dǎo)入細菌 的過程。感染 (Infection)： 利用病毒將外源 DNA 導(dǎo)入真核細胞的 過程。載體導(dǎo)入宿主細胞的方法 感受態(tài)細胞 (Competent cells) 是有利于外源 DNA分子進入的細胞。所用的轉(zhuǎn)化方法不同，處理細胞使其進入感受態(tài)的方法也不同。 化學(xué)轉(zhuǎn)化 (Chemical transformati

32、on) 用 30 mM-100 mM 的 CaCl2 處理大腸桿菌，細胞周圍的 CaCl2 促進 DNA 結(jié)合到細胞表面并增加細胞對 DNA 的 通透性。轉(zhuǎn)化率為 5 X 106-2 X 107 轉(zhuǎn)化子/g DNA。 物理轉(zhuǎn)化 (Physical transformation) 電穿孔法 (Electroporation): 當(dāng)細胞經(jīng)受高壓電流脈沖 時，細胞膜上可逆地形成小至 2 n m大小的孔洞，介質(zhì)中 的 DNA 分子很容易通過孔洞進入細胞質(zhì)。轉(zhuǎn)化率為 109 轉(zhuǎn)化子/g DNA。轉(zhuǎn)化方法風(fēng)格法如何獲得目的基因(1) 基因組文庫中獲得(2) cDNA文庫中獲得(3) 通過PCR技術(shù)獲得 (

33、4) 人 工 合 成 ,基因組 DNA 的制備(Preparation of genomic DNA)從細胞或組織中提取的基因組 DNA 可用于: 建立基因組文庫； 克隆特定的基因； 用 Southern 印跡檢測某一基因的存在和拷貝數(shù)； 用 PCR 反應(yīng)檢測基因的存在和突變等； 蛋白酶 K 和 SDS 可破壞細胞膜及細胞中的蛋白質(zhì)，使 基因組 DNA 從破碎的細胞中釋放出來。 酚/氯仿去除核酸溶液中的蛋白質(zhì)以純化 DNA。 鹽離子存在時乙醇或異丙醇沉淀基因組 DNA以濃縮 DNA。 從 1 g 哺乳動物組織或 109 培養(yǎng)細胞中可得到 2 mg 基因組 DNA。從細菌或真菌中制備基因組 DN

34、A 時，首先用溶菌酶破壞其細胞壁結(jié)構(gòu)。基因組DNA的制備原理(1) 細胞裂解 在 50C條件下用裂解緩沖液 (100 mM NaCl；10 mMTris-Cl, pH 8.0；25 mM EDTA, pH 8.0；0.5% SDS；0.1 mg/ml 蛋白酶 K； 100 g/ml RNase A) 消化組織細胞 16-18小時；消化培養(yǎng)細胞 2-3 小時。(2) 蛋白質(zhì)淬取 用酚/氯仿/異戊醇 (25/24/1) 淬取蛋白質(zhì)。(3) 基因組 DNA 沉淀 用 0.1 倍體積的 3 M NaAC 和 2.5 倍體積的 100% 乙醇沉淀 DNA, 用 70% 乙醇除去 DNA 沉淀中的鹽離子。

35、(4) 將基因組 DNA 溶解在 TE 緩沖液中，使其終濃度為 1 mg/ml，置 4C 保存。基因組DNA的制備方法(1) 防止內(nèi)源性 DNase 應(yīng)快速分離、剪切、勻漿組織或快速洗滌培養(yǎng)細胞。一旦組織 被冷凍或培養(yǎng)細胞被加到裂解緩沖液中，DNA 將免于被 DNase 降解。盡量將組織切得小一些，便于蛋白酶 K 和 SDS 快速、有 效的作用于組織塊。(2) 保證得到高分子量的基因組 DNA，以便于構(gòu)建基因組文庫。 應(yīng)減少物理機械作用，如不要使用旋渦振蕩儀等。(3) 保證基因組 DNA 不被蛋白質(zhì)所污染，否則將影響限制性內(nèi)切酶 對 DNA 的酶切作用。高純度 DNA 的 OD260/OD 2

36、80 值大于 1.8； 50% 蛋白質(zhì) /50% DNA 混合物的 OD260/OD280 值大約為 1.5。制備基因組DNA時的注意事項小鼠基因組 DNA1. 未被酶切的 DNA2. HindIII 酶切產(chǎn)物3. MboI 酶切產(chǎn)物1 2 3基因組DNA的檢測總 RNA 的制備(Preparation of total RNA) 從組織或細胞中提取總 RNA 的目的是: 純化 mRNA； 建立 cDNA文庫； 克隆特定的 cDNA； 用 Northern 印跡方法檢測某一特定基因的表達； 用 RT-PCR 方法檢測某一特定基因的表達。 異硫氰酸胍和十二烷基肌氨酸鈉為強烈的蛋白質(zhì)變 性劑，能迅

37、速溶解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)破壞，使 總 RNA 從細胞中釋放出來。 異硫氰酸胍和 -巰基乙醇等還原劑使內(nèi)源性 RNA 酶 (RNase) 變性失活, 防止 RNA 被降解。異硫氰酸胍法提取總 RNA焦碳二乙酯 (DEPC) 使外源性 RNase 變性并失活。 用 0.1% DEPC 處理 ddH2O 16-20 小時，再用 DEPC- ddH2O 配制緩沖液，然后高壓滅菌除去 DEPC。 用 0.1% DEPC 浸泡 EP 管、Tip 頭 16-20 小時，然 后高壓滅菌除去 DEPC。 置玻璃勻漿器、量筒和燒杯等于 180C 烤箱中烘烤 小時。提取 RNA 時所用緩沖液及器皿的處理用 TRI

38、zol 試劑 (Invitrogen/GIBCO 公司) 提取總 RNA的方法 ; TRIzol 試劑的主要成分為異硫氰酸胍、-巰基乙醇和十二烷基肌氨酸鈉。用 TRIzol 試劑處理細胞或勻漿組織氯仿萃取蛋白質(zhì)沉淀 RNA洗滌 RNA 沉淀用 RNase-free ddH2O 溶解 RNA，并置-20C保存檢測 RNA (加l RNA到% 瓊脂糖凝膠中)總RNA提取過程 rRNA 80%哺乳動物細胞的總 RNA tRNA 和 snRNA 10% mRNA 1-3%MRNA分子量標(biāo)準(zhǔn) (RNA ladder)1, 2人肝細胞總 RNA 28S rRNA (5025 bp) 18S rRNA (1

39、868 bp)28S rRNA 條帶強度是18S rRNA 條帶強度的 2 倍。RNA 的檢測線狀 DNA(Linear DNA, L) 超螺旋 DNA (Supercoiled DNA, SC)帶缺口的閉環(huán) DNA (Opened circular DNA, OC) 閉環(huán) DNA (Closed circular DNA) (2) 質(zhì)粒的電泳加樣孔OC L SC 5 kb4 kb850 bp3 kb1 kb2 kb 1.6 kb650 bp500 bppUC18 質(zhì)粒 DNADNA/RNA 電泳(DNA/RNA Electrophoresis)電泳 (electrophoresis)帶電荷物

40、質(zhì)在電場中移動的現(xiàn)象叫電泳。 DNA 或 RNA分子帶負電荷，在電場作用下，DNA 或 RNA 分子由負極向正極移動。 DNA 或 RNA 分子量越大，遷移速率越慢，反之， 分子量越小，遷移速率快。 不同構(gòu)象的 DNA 或 RNA 分子，遷移速率不同。DNA 或 RNA 電泳原理 用瓊脂糖凝膠電泳分離、鑒定和純化 DNA 分子 用變性瓊脂糖凝膠電泳分離和鑒定 RNA 分子 用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離 DNA 測序反應(yīng)中 合成的系列單鏈 DNA 片段 (5-500 bp)核酸電泳類型 VmA 遷移方向電泳儀樣品槽負極正極電泳緩沖液水平電泳槽瓊脂糖凝膠槽 瓊脂糖 (agarose) 是 D- 和

41、 L-半乳糖殘基通過 -(13) 和 -(14) 糖苷鍵交替構(gòu)成的線狀聚合物，瓊脂糖凝膠 可形成孔徑為 50 nm 到 200 nm 的分子篩。 瓊脂糖凝膠的分辨率較低，但分離范圍較大。DNA 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠濃度與線狀 DNA 分子的有效分離范圍瓊脂糖凝膠濃度 (%)線狀 DNA 分子的有效分離范圍 (kb)0.530 1.00.712 0.81.010 0.51.27 0.41.53 0.2常用電泳緩沖液6X 樣品緩沖液0.25 溴酚藍0.25 二甲苯氰 FF40 蔗糖(1) 溴酚藍和二甲苯氰 FF 在電場中向正極移動，用來預(yù)測 DNA 樣品的電泳情況。在 0.5X TBE瓊脂糖凝

42、膠電泳中: 溴酚藍 300 bp 的線狀雙鏈 DNA 二甲苯氰 FF 4000 bp 的線狀雙鏈 DNA(2) 蔗糖可以增加樣品密度以保證 DNA 沉入加樣孔內(nèi)。樣品緩沖液NH2C2 H5H2N N+Br-溴化乙錠 (Ethidium bromide, EB)EB/2.5 堿基瓊脂糖凝膠中 DNA 的檢測EB 染色方法EB 終濃度： 0.5 g/ml(1) 將 EB 直接加入瓊脂糖凝膠中染色。 便于觀察 DNA 的電泳情況，但 EB 嵌入 DNA 分子 后， 會改變 DNA 分子的遷移速率 。(2) 電泳結(jié)束后將瓊脂糖凝膠浸入 EB 染色液中染色。注意：EB 是潛在的致癌劑，須小心操作。SYB

43、R (綠色熒光染料) 安全性高； 敏感性是 EB 的 2 倍； 用于 DNA 和 RNA 的染色； 檢測方便激發(fā)光波長：280 nm 和 502 nm 發(fā)射光波長： 530 nm可用紫外光透射儀、可見光透射儀或激光掃描儀檢測。 二甲苯氰 FF 溴酚藍 凝膠電泳成象結(jié)果 為防止單鏈 RNA 形成空間結(jié)構(gòu)，需用變性的瓊脂糖 凝膠即甲醛-瓊脂糖凝膠分離 RNA分子。 為防止外源性 RNase 的污染，所用的托盤、梳子、 倒膠槽、電泳槽等需要用焦碳酸二乙酯 (DEPC) 或 H2O2處理；所用的緩沖液要用 DEPC 處理的 ddH2O 來配制。 注意：DEPC是潛在的致癌劑，須小心操作。RNA 瓊脂糖

44、凝膠電泳110X MOPS 電泳緩沖液200 mM MOPS 3-(嗎啉代)-丙磺酸, pH 7.050 mM NaAc10 mM EDTA, pH 8.0 使用前，將 10X MOPS 稀釋至 1X MOPS2甲醛-瓊脂糖凝膠的制備 甲醛的終濃度：7.73電泳前 RNA 樣品的處理 用甲醛和甲酰胺等處理 RNA 樣品以打開的 RNA 發(fā) 夾結(jié)構(gòu)4電泳結(jié)束后用 EB 染色液染色。 聚丙烯酰胺凝膠的分辨率較高，所以聚丙烯酰胺凝 膠電泳用于分離 DNA 測序反應(yīng)中的系列 DNA 片段。 在聚丙烯酰胺凝膠中加入了尿素作為變性劑，以確 保 DNA 片段保持單鏈狀態(tài)并以線狀 DNA分子的形 式泳動。 所

45、用的電泳緩沖液為 1X TBE。 大型垂直板電泳變性聚丙烯酰胺凝膠電泳聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)一. PCR 的基本原理 根據(jù)細胞分裂中 DNA 半保留復(fù)制機理在體外快速擴增某一特定 DNA 片段的方法。利用DNA變性與復(fù)性原理在體外擴增特異DNA片段,在一個簡單的試管中反應(yīng)，用極少量基因組DNA作模板,在一對引物介導(dǎo)下，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在短時間內(nèi)即可將所需目的DNA片段擴增至100萬倍以上PCR技術(shù) 特點 敏感度高、特異性強、產(chǎn)率高、 重復(fù)性好、操作簡便、快速 PCR工作原理是以要擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板5末端和3末端相互補的寡核

46、甘酸片段為引物、在4種脫氧核糖核甘酸存在的條件下，依賴DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。 PCR特異性取決于人工合成的一對引物和模板DNA結(jié)合的特異性。 PCR體系基本組成模板DNA： （102-5）拷貝dNTP底物：20200umol/L，過高將加快反應(yīng)速度， 同時增加堿基的錯誤摻入率特異性引物： 0.10.5 umol/LDNA聚合酶： Klenow T4 、 T7聚合酶 TaqDNA聚合酶具有良好的熱穩(wěn)定性。并具有5-3聚合酶活性及3-5外切酶活性，因此可以校正PCR反應(yīng)中某些單核甘酸的錯配。含Mg2+的緩沖液： Mg2+ 能影響反應(yīng)特異性和擴增片段的產(chǎn)率，一般為1.52.0mmol/L，過量

47、將增加非特異性條帶的產(chǎn)生。反應(yīng)分三步：1 變性 denaturation： 加熱90-95，模板DNA雙鏈解離形成單鏈DNA；2 退火 annealling： 溫度突然降低,引物與模板DNA結(jié)合, 40-60,Tm值4（G+C）+2（A+T）-5. 3 延伸 extension： TaqDNA聚合酶以4dNTP為底物，在Mg2+ 存在 的條件下，催化DNA合成。70-75 時間-要擴增片段長度決定循環(huán)次數(shù)取決于模板DNA的濃度30次擴增100萬倍引物設(shè)計原則引物長度15-30bp引物堿基盡可能隨機分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堆積現(xiàn)象，引物G+C含量宜在45-55%左右。引物的內(nèi)部不應(yīng)形成二級結(jié)構(gòu)，

48、兩個引物間不應(yīng)有互補鏈存在引物的堿基順序不應(yīng)與非擴增區(qū)域有同源性。計算機分析。引物3末端堿基原則上與模板配對，3末端堿基最好不是A。引物5末端堿基無嚴格限制，只要與模板DNA結(jié)合的引物長度足夠，末端可以游離。因此可以在引物5末端加上限制性內(nèi)切酶位點。 Tm = 69.3 + 0.41 (%G + C) PCR產(chǎn)物的檢測 瓊脂糖凝膠電泳；（EB）分子雜交；限制性內(nèi)切酶酶切分析；微孔板夾心雜交法；直接測序反轉(zhuǎn)錄 PCR (RT-PCR) RT-PCR 將以 RNA 為模板的 cDNA 合成同 PCR 結(jié)合在一起，提供了一種分析基因表達的快速靈敏的方法。53AAAAA535335533553RT-PCR 原理mRNA1st cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶、下游引物、dNTPsTaq DNA聚合酶、上游及下游引物、dNTPs5533特異 PCR