1、臨床分子生物學檢驗第九章細菌感染的分子生物學檢驗方法細菌感染是致病菌或條件致病菌入侵機體，并在機體中生長繁殖，產生毒素或其他代謝產物所引起的全身性感染，臨床上以寒戰、高熱、關節疼痛等為特征，部分患者還可以出現煩躁、四肢厥冷、發紺、呼吸加速、血壓下降、感染性休克等臨床癥狀。傳統上對于細菌感染的病原體檢測主要采用免疫學、微生物學和血液學等相關技術，但這些技術方法受靈敏度和特異性的限制，不易達到早期診斷。利用分子生物學技術檢驗感染性病原體自身遺傳物質（RNA或DNA），從而達到早期、快速、敏感、特異地檢測已經成為臨床檢驗的主流技術之一。第一節 細菌感染的分子生物學檢驗策略分子生物學檢驗是以核酸（DN

2、A或RNA）或蛋白質分子為檢驗目標，通過檢查人體內源基因或外源（病原體）基因的存在、缺陷或表達異常，對人體狀態或疾病作出特異性診斷的方法和過程。機體感染細菌后，應用分子生物學技術直接測定這些細菌病原體基因，不僅可以對微生物感染作出明確診斷，同時也能診斷出帶菌者或潛在性感染，還可以對感染性病原體進行分型和耐藥性監測。一、細菌感染的一般性檢出策略細菌感染性的分子生物學檢驗的一般性檢出就是以感染病原體的特異核酸序列作為檢測目標序列，利用分子生物學技術對目標序列進行檢測，從而直接判斷有無細菌感染和是何種病原體感染。二、細菌感染的完整性檢出策略完整性檢出策略，即不僅對病原體作出快速準確診斷，還需要對其進

3、行分型（包括亞型）和耐藥性等方面的檢測，盡可能地為臨床診療提供更為詳盡的細菌病原體的相關信息。第二節 結核分枝桿菌的分子生物學檢驗結核分枝桿菌(TB)，簡稱結核桿菌，是引起結核病的病原體。隨著抗結核藥物的不斷發展和衛生生活狀況的改善，結核的發病率和死亡率曾一度大幅下降。近年，由于艾滋病和結核分枝桿菌耐藥菌株的出現、免疫抑制劑的應用、吸毒、貧困及人口廣泛流動等因素，全球范圍內結核病的疫情死灰復燃。據WHO統計，全世界約1/3的人感染了結核分枝桿菌，在某些發展中國家成年人中群中結核分枝桿菌攜帶率高達80%，其中的5%10%攜帶者可發展為活動性結核病。TB是一種革蘭氏陽性菌，G+C含量高，其細胞壁除

4、肽聚糖層外，還含有另外一層由特殊脂質、糖脂和多糖組成的附加層。TB呈細長略彎曲，常聚集成團，用抗酸性染色被染成紅色。對養要培求特殊條件，一般要經4-6周才出現肉眼可見的菌落。TB通過呼吸道、消化道和破損的皮膚粘膜侵入機體，它被吞噬后能在吞噬細胞內繁殖，導致巨噬細胞裂解，還可在細胞外繁殖。TB的培養特點：饞、懶、丑。饞-營養要求較高，必須在含血清、卵黃、馬鈴薯、甘油以及含某些無機鹽類的特殊培養基（羅氏）上才能生長良好。懶-生長緩慢，1418h分裂1次，在固體培養基上25w才出現肉眼可見的菌落。丑-典型菌落為粗糙型，表面干燥呈顆粒狀，不透明，乳白色或淡黃色，如菜花樣。TB具有合成所有必需氨基酸、維

5、生素和酶輔助因子的潛在能力。該菌具有代謝各種各樣碳水化合物、乙醇、酮和羧酸的能力。此外，還具有許多涉及脂代謝、糖酵解、磷酸戊糖途徑、三羧酸和乙醛酸循環所必須的酶分子。 結核分枝桿菌天然地對很多抗生素有抵抗力，使得治療極其困難。該菌的藥物抵抗力主要由于其具有高度疏水的細胞壁充當滲透屏障。同時，在基因組中還發現有許多藥物抗性決定因子的編碼序列，包括水解酶或者藥物修飾酶，例如乙酰轉移酶和很多藥物外排泵系統。抵抗力特點：“三耐四敏” 耐干燥、耐酸堿、耐孔雀綠（1：13000） 對濕熱、70乙醇、紫外線、常用抗結核藥物（但長期使用易產生耐藥性）變異性 典型形態多形性 R型菌落S型菌落 有毒無毒（用于制備

6、疫苗） 抗結核藥敏感耐藥目前結核桿菌常規檢測方法痰涂片法陽性率低，且易受非結核桿菌的污染。培養法目前認為是診斷的“金標準”但結核桿菌生長緩慢，不利于臨床上的及時診斷和治療。血清學試驗由于分枝桿菌屬各菌之間抗原有著廣泛的交叉，特異性不強。TB H37Rv 全基因組為環狀雙鏈DNA，長約4 411 529bp，共有4000基因， G+C平均值65.6%，其基因序列高度保守。H37Rv 基因組中有50 個編碼功能RNA 的基因，其中 45 個 tRNA基因，3 個 rRNA 基因和 2 個核穩定（stable）RNA基因，這些 RNA分子是由特異的核糖體RNA 操縱子產生的。一、結核分枝桿菌的基因組

7、結構特征在H37Rv 全基因組中有16個拷貝的IS6110插入序列和6個拷貝的IS1018，大多數插入序列位于基因間或非編碼區，通常靠近tRNA基因聚集成串，插入序列在染色體中主要分布在重復區。TB H37Rv 基因組中共有3924個開放閱讀框，其中91%有潛在的編碼能力，ORF中最常見的起始密碼子61%為ATG，35%為GTG。187個ORF參與脂類代謝、細胞壁合成，360個參與細胞壁代謝， 66個參與脂類合成，287個參與能量代謝， 95個參與氨基酸合成， 38個與細菌毒力相關， 69個參與DNA合成。所編碼的蛋白約有40%的為功能性蛋白，44%的與已知蛋白有相似性信息，16%的則為未知蛋

8、白。TB不同菌株之間存在多個差異基因。基因組中有3個毒力因子：mce、過氧化氫酶-過氧化物酶和sigA。除了這些單基因毒力因子，細菌的胞壁也對致病性起著重要的作用。二、結核分枝桿菌的分子生物學檢驗內容（一）結核分枝桿菌核酸的檢測可采用PCR、real-time PCR、PCR-RFLP、線性探針雜交、鏈替代擴增技術、擴增結核分枝桿菌直接試驗、基因芯片技術、全自動結核檢測平臺等方法檢測標本中的TB DNA。1、 PCR PCR擴增所選靶序列主要有65kD抗原基因、MPB蛋白基因、rRNA基因、TB IS6110插入序列、染色體DNA的重復序列等。常規PCR的不足：產物的交叉污染、假陽性、假陰性、

9、實驗室污染。2、real-time PCR 與傳統PCR相比，具有敏感度、特異性高及方便快速等優點，特別是對難以培養與生長緩慢的結核桿菌的檢測更有優勢。3、PCR-RFLP 通過PCR擴增分枝桿菌染色體上一段DNA，將擴增產物經限制性內切酶消化（最常用的內切酶是Pvu)，將消化的樣品進行瓊脂糖凝膠電泳分析，不同分枝桿菌酶切片段的數量或大小不同，電泳圖譜呈現多態性。4、線性探針雜交 其原理是應用生物素標記的特異引物進行靶核酸的擴增，將產物變性后與固定在尼龍膜上的特異寡核苷酸探針雜交，通過酶免疫顯色法顯示結果，一次雜交可以檢測多種靶序列。簡便、快速、敏感。5、鏈替代擴增技術 （ SDA） SDA是

10、一種基于酶促反應的新的DNA體外等溫擴增技術。基本原理：引物與靶DNA序列上對應的DNA單鏈雜交，在聚合酶作用下產生帶Hinc識別位點含5和3端的靶DNA序列，該靶序列進入DSA循環；Hinc限制性核酸內切酶切割識別位點，依賴DNA聚合酶在切割處延伸3端，并替代另一條DNA鏈；該替代鏈與引物雜交后又依次作為另一擴增反應的靶源，這些步驟在反應體系中不斷重復，使靶DNA序列呈指數性增長；37 40進行23次循環后，2h內靶序列可得到108擴增放大。SDA法以IS6110和16SrRNA基因為擴增靶點。6、擴增結核分枝桿菌直接試驗（ AMTDT）AMTDT以結核分枝桿菌的16SrRNA為擴增模板，采

11、用轉錄介導的擴增技術對靶核酸進行擴增，采用化學發光物吖啶酯標記的cDNA探針與擴增的靶基因雜交，探針與擴增產物雜交后利用雜交保護試驗除去未雜交的標記探針，最后利用化學發光儀檢測化學發光信號。AMTDT方法具有高度的敏感性特異性。對涂片陽性TB診斷的敏感性達到92%100%，對所有臨床標本檢測的特異性均在95%以上，因此具有極大的臨床應用價值。7、基因芯片技術、1999年 Troesch 等開發出首塊結核病相關芯片，包括兩部分，一部分是在結核分枝桿菌有種間的多態性的16SrRNA 基因片段，借以鑒別結核桿菌與非結核桿菌；另一部分則用于分析耐利福平菌株rpoB基因突變的發生情況，可用于結核分枝桿菌

12、對利福平耐藥性的快速檢測。8、GeneXpert全自動結核檢測平臺將樣品前處理、核酸提取、PCR檢測和結果分析等全過程結合在一起，最大程度上提高檢測自動化和靈敏度。XpertMTB/RIF，通過六重熒光定量PCR對結核分枝桿菌和利福平耐藥性進行快速檢測。（二）結核分枝桿菌的耐藥性檢測結核分枝桿菌耐藥的分子機制是由于結核桿菌的特定基因某些堿基出現突變（插入、缺失、替換）而造成。1、結核分枝桿菌的耐藥機制（1）耐利福平分子機制：是由于其作用靶標結核桿菌DNA依賴RNA聚合酶亞單位的編碼基因（rpoB）突變所致。當rpoB中507533位密碼子的核心區域耐利福平決定區(RRDR)發生突變時，使DNA

13、依賴RNA聚合酶亞單位酶結構改變利福平不能與細菌的RNA聚合酶亞單位結合而表現為耐藥。其中以編碼531位氨基酸的堿基TCGTTG和編碼526位氨基酸的堿基CACTAC的突變最常見。（2）耐異煙肼分子機制：結核桿菌耐異煙肼與過氧化氫酶-過氧化物酶編碼基因(katG)、烯酰基還原酶編碼基因(inhA)、烷基過氧化氫酶還原酶編碼基因(ahpC)、2S酮酰基酰基運載蛋白合成酶編碼基因(kasA)有關。主要是katG基因的點突變、缺失、插入，完全缺失占異煙肼耐藥菌株的7%24%，主要出現于高水平耐異煙肼分離株中，隨機突變占50%70%，常見的點突變是315位AGCACC和463位CGGCTG。inhA基

14、因突變約占異煙肼臨床耐藥株的10%35%。耐藥的發生可由于inhA結構基因突變造成異煙肼與DADH的親和力下降，或是inhA啟動子-15的CT的點突變可能創造一個強有力的啟動，使inhA蛋白過度表達從而提高對異煙肼活性形式所需的濃度，引起對異煙肼耐藥， inhA基因的突變常出現低水平異煙肼耐藥性。（3）耐氨基糖苷類藥物分子機制：耐鏈霉菌的結核桿菌主要由于編碼核算糖體16S rRNA的rrs基因與編碼核糖體蛋白S12的rpsL基因發生突變，從而降低了氨基糖苷類藥物結合到核糖體上的能力，形成耐藥。 rpsL基因中編碼第43位氨基酸的堿基AG的突變是常見的突變位點出。Rrs基因突變點為512、513

15、位的堿基插入，這些堿基突變均可導致高水平的耐藥。（4）耐吡嗪酰胺分子機制：吡嗪酰胺需經結核分枝桿菌體內的吡嗪酰胺酶催化才能轉變成具有活性的吡嗪酸。耐吡嗪酰胺主要由 pncA 基因突變所造成的吡嗪酰酶的蛋白結構改變，失去了將吡嗪酰胺轉換成活性形式的能力，形成耐藥。（5）耐乙胺丁醇分子機制：耐乙胺丁醇主要與操縱子cmbB基因有關， cmbB突變導致糖基轉移酶結構，影響乙胺丁醇和糖基轉移酶的結合而產生耐藥，其中第306位密碼子的錯義突變最為常見。（6）耐氟喹諾酮類藥物分子機制：氟喹諾酮類藥物主要靶位是結核桿菌的DNA旋轉酶，該酶由gyrA和gyrB兩種基因編碼的兩個A亞單位和兩個亞單位組成。其中編碼

16、的gyrA基因發生突變則導致氟喹諾酮類藥物結合位點構象改變，從而產生耐藥性。突變大多數發生在gyrA基因保守區67106位密碼子區，常見有94位GACGCC或CAC或TAC，90位GCCGTG的突變。2、結核分枝桿菌耐藥性檢測的分子生物學技術（1）DNA測序：該技術是檢測基因突變的金標準，不僅可用于突變的篩選，而且能確定突變堿基的部位和分布。（2）PCR-SSCP（3）PCR-RFLP（4）PCR-ROB（5）基因芯片技術三、分子生物學檢驗的臨床意義傳統的結核病的臨床診斷主要是根據病史、細菌培養、涂片抗酸染色找TB、免疫學方法檢測TB抗原或抗體、胸片等可對大多數患者做出正確的臨床診斷，但對部分

17、病人可造成誤診或漏診。分子生物學方法為TB的臨床診斷提供了一種快速、準確的診斷方法，具有以下特點：1、在TB感染早期，特別是在 TB 病灶通過血源性外傳播時及在外周血中存在極少量的TB 時，分子生物學方法能通過體外擴增進行確診。而早期診斷在臨床診療中具有重要的指導意義，可以防止繼發性TB病灶的形成。 2、PCR檢測TB僅需24小時，克服了傳統TB培養方法需時間長、痰涂片檢查陽性率低的缺點，提高了臨床檢測的敏感性和特異性。3、可以通過分子生物學技術進行結核耐藥的早期快速檢測，為臨床診療提供快速、準確的結核耐藥信息，有效指導臨床抗結核用藥。4、有利于疾病的鑒別診斷，對于肺結核來說，其中的結核球和成

18、人原發型結核等經常易于同肺癌的診斷相混淆。病灶中心經常出現既未見TB又末見癌細胞的壞死區。此時涂片檢測常是陰性，利用分子生物學檢測技術就能夠進行鑒別診斷。5、抗結核治療的評價，通過分子生物學技術可以通過定期檢測，評價抗結核藥物的療效及殘存菌的數量和活性度。第三節 淋病奈瑟菌的分子生物學檢驗淋球菌又名淋病奈瑟菌（NG），是淋病的病原菌。淋球菌革蘭染色陰性，是嚴格的人體寄生菌，常存在于急性尿道炎和陰道炎的膿性分泌物的白細胞中，形態染色類似于腦膜炎球菌。人類是淋球菌唯一的自然宿主，淋病主要由性接觸而傳播。淋球菌侵入泌尿生殖系統繁殖，男性發生尿道炎，女性引起尿道炎和子宮炎。如果治療不徹底，可擴散至生殖

19、系統。女性出現前庭大腺炎和盆腔炎等，是導致不育原因之一.胎兒可經產道感染造成新生兒淋病性急性結膜炎。人類對淋球菌直接涂片染色鏡檢 采取尿道膿性分泌物涂片，革蘭氏染色鏡檢，如在中性粒細胞中發現革蘭氏陰性雙球菌時，就有診斷價值。該方法敏感度和特異性差，尤其是在女性患者中檢出率僅為50%左右，不能用于確認； 分離培養法 是臨床診斷淋病奈瑟菌(NG)感染的金標準, 但該方法對標本和培養營養要求高，培養周期長，出臨床報告慢，難以滿足臨床需要。免疫學方法 由于分泌物標本中的非特異性反應嚴重以及抗體方法間的穩定性和條件限制，使推廣應用受限。淋球菌感染的確認主要依靠實驗室檢查。目前，實驗室診斷淋球菌感染的方法

20、有：一、淋病奈瑟菌的基因組結構特征淋病奈瑟菌FA1090菌株的染色體DNA長度為2.15Mbp，其中G+C含量為52.68%。編碼區的DNA長度占總長度的78%。包括2002個具有編碼功能的基因和67個編碼結構性RNAS基因。NCCP11945菌株的染色體DNA長度為，據估計可以編碼2622個開放性閱讀樞。同時， NCCP11945含有1 個能編碼12個ORFS的質粒。整個基因組的編碼基因的密度為87%。全基因組平均G+C含量為52.4%，這與FA1090菌株相類似。二、淋病奈瑟菌的分子生物學檢驗內容（一）淋病奈瑟菌核酸的檢測1、PCR 是淋病奈瑟菌基因診斷中最基本的方法。PCR引物選擇的靶基

21、因多采用：隱蔽質粒ccpB基因(ccpBHO1/3、1/2及ccpBN3/4); 16SrRNA基因(SL67/59、NGP1/2)；porA假基因；編碼外膜蛋白基因（omp基因）；opa基因；胞嘧啶DNA甲基轉移酶基因。2、實時熒光定量PCR技術目前臨床檢測NG的主要的分子生物學技術。3、連接酶鏈反應用于LCR方法檢測的NG靶基因主要有opa基因和Pilin基因。對咽拭子標本具有很好的敏感性，但應注意避免污染導致的假陽性抑制物所致的假陰性。4、鏈替代擴增技術特異性擴增NG染色體PivNg基因，然后用熒光標記的探針檢測其相對應的DNA靶序列。（二）淋病奈瑟菌的耐藥性檢測1、淋病奈瑟菌的主要耐藥

22、基因gyrA和parC基因：DNA 旋轉酶是氟喹諾酮類藥物作用的靶位，由 gyrA 和parC 基因編碼， gyrA基因突變可導致酶結構的改變，阻止氟喹諾酮類藥物進入靶位，引起耐藥。gyrA基因突變與淋球菌低水平和中度水平氟喹諾酮類藥物耐藥有關，而對氟喹諾酮類藥物高水平耐藥是gyrA和parC共同參與基因突變的結果， gyrA和parC 是氟喹諾酮耐藥決定區（QRDR）中的兩個重要基因。(2)penA、ponA基因：青霉素結合蛋白(PBPS)為淋球菌重要的外膜蛋白。編碼PBPS的基因主要有PenA、PonA基因，如果上述基因中發生突變，就會導致PBPS結構的改變，使PBPS與青霉素的親和力下降

23、，細胞膜對青霉素的滲透性降低，細菌產生耐藥性。(3)porB基因：孔蛋白是鑲嵌在淋球菌外膜的主要蛋白，與細菌的侵襲力有關，此外還具有物質運輸功能。主要由porB基因編碼，如果發生基因突變，導致孔蛋白120與121位氨基酸的改變，最終導致孔蛋白對親水性抗生素滲透性下降，使藥物在細胞內蓄積不足，從而產生耐藥性。(4)Mtr系統調控基因：MtrR調控基因的突變，導致它編碼的MtrR阻遏蛋白減少或消失， Mtr操縱子的轉錄增強，使 MtrCDE 基因的表達增加，編碼的泵蛋白外排活性增加，加大脂溶性抗生素的排出，使菌體內藥物蓄積不足，從而導致耐藥。(5)erm基因： erm基因編碼erm酶，如果發生突變

24、， erm基因編碼的酶可以使rRNA自動甲基化，從而使大環內酯類藥物作用靶位核糖體50S亞基蛋白改變，使藥物與靶位親和力下降引起耐藥2、淋病奈瑟菌耐藥檢測的分子生物學技術（1）DNA測序：目前應用該技術進行檢測的淋病奈瑟菌耐藥基因主要有gyrA基因、parC基因、erm基因等。（2）PCR-SSCP（3）PCR-RFLP（4）基因芯片技術三、分子生物學檢驗的臨床意義1、克服了淋球菌培養時間長等缺點，提高了臨床標本檢測的陽性率和準確性。2、通過分子生物學技術可以進行淋球菌感染的流行病調查。3、可以準確、快速評價藥物治療的效果。4、有利于淋病的鑒別診斷。第四節O157型大腸埃希菌的分子生物學檢驗感

25、染性腹瀉是世界范圍內重要的公共衛生問題，其主要菌型是腸出血性大腸埃希氏菌O157:H7，其產生強有力的細胞毒素志賀菌樣毒素Stx1和（或）Stx2。其主要作用部位是右半結腸，在盲腸、闌尾和升結腸引起黏膜的充血、水腫和細胞變性壞死，甚至血性腹瀉，嚴重者可以導致死亡。E.coliO157:H7引起的出血性結腸炎是1982年在美國俄勒崗州和密執安州，因食用漢堡包引起的食物中毒的病人糞便中被分離并命名的。據美國疾病控制中心(CDC)報告，每年全國約發現2萬多例病人。死亡人數200-500人，以后陸續在全球五大州20多個國家被發現或引起暴發和流行。自82年發現至今，發生規模最大的一次爆發是97年5月下旬

26、，日本岡山、廣島等縣幾十所中學和幼兒園相繼發生6起集體食物中毒事件，人數多達1600人，導致3名兒童死亡，住院兒童達80人。同時日本仙臺和鹿兒島形成中毒人數過萬人，死亡11人，波及44個都府縣的爆發性食物中毒，引起全世界的關注。此外美國、加拿大、瑞典、澳大利亞、蘇格蘭、威爾士等國家和地區也相繼報道了EHEC的散發性感染和暴發流行。我國自1986年徐州首次分離O157:H7以來，福建、甘肅、浙江、江蘇和安徽等省市相繼從人和動物中分離出O157:H7。1999年在江蘇淮北部分地區及鄰近的安徽部分地區發生的O157:H7感染暴發，患者超過2萬人，死亡177人，流行長達7成個月，被認為是迄今為止世界范

27、圍內規模最大、死亡人數最多、時間最長、發病原因最復雜的一次。一、O157型大腸埃希菌的基因組結構特征大腸埃希菌的基因組由一個環狀染色體和大質粒組成。O157:H7 EDL933株，有1387種大小不同的可能的至病基因，編碼可能的致病因子、選擇性新陳代謝能力和一些原噬菌體及新功能基因；有21個特異性序列，編碼溶血素、菌毛、侵襲性相關蛋白及鐵、脂肪和糖代謝相關的因子等；O157:H7 Sakai株與非致病的實驗株E.coli K-12 MG1655株的全基因組序列進行比較。 O157:H7 Sakai株染色體大小為55Mb，比K-12大895kb，兩者有約的高度保守序列。O157:H7 Sakai株染色體中包含5361開放閱讀框架，其中3729個ORF存在于K-12中，其余1632個ORF在K-12中不存在。1632個ORF中有873個ORF的功能是已知的，369個ORF與未知功能的蛋白質相似，其余ORF則是