1、真核細胞培養、凍存、計數實驗 （上）指導老師：鞏麗云 7121一、基本目的了解細胞培養的常規知識和無菌操作的基本原則掌握貼壁細胞的復蘇方法；掌握鏡下觀察貼壁細胞生長狀態的方法了解細胞培養的基礎知識2二、實驗內容 細胞復蘇 細胞觀察3三、實驗材料及儀器1、材料： 人肺癌細胞 細胞培養基（RPMI1640液體培養基,10胎牛血清,雙抗100單位/ml） PBS 細胞培養耗材2、儀器： 二氧化碳培養箱 倒置顯微鏡 生物安全柜 液氮罐 離心機4四、細胞復蘇方法（1）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37 38水浴中，使其融化（1分鐘左右）；（2）5分鐘內用培養基稀釋至原體積的10倍以上；（3）低速離心10分

2、鐘；（4）去上清，加新鮮培養基培養剛復蘇的細胞。5基本概念細胞系（Cell line）：原代培養物經首次傳代成功后即為細胞系。細胞株（Cell strain）：通過選擇法或克隆法從原代培養物或細胞系中獲得的具有特殊性質或標志的培養物稱細胞株。6有限細胞系（finite cell line）：細胞系形成后僅能維持有限傳代次數，最后死亡。連續或無限細胞系（ continuous cell line or infinite cell line）：具有無限繁殖能力（獲得不死性）和能反復進行傳代的細胞系。7細胞培養的優點可長時間監控、檢測，定量評估一部分活細胞的情況。研究條件可人為的控制。研究的樣本可以

3、達到比較均一性。研究的內容便于觀察、檢測和記錄。研究的范圍比較廣泛。研究的費用相對較經濟。8細胞培養的缺點生存在人工的培養環境中，雖然模擬體內環境，但仍有很大差異。9培養細胞的形態學方面檢測肉眼觀察培養基的顏色變化桃紅色：正常情況橙黃色: 細胞生長狀態良好淡黃色: 培養時間過長,營養不足,死亡細胞過多紫紅色: 細胞沒有生長、生長狀態不好、或已死亡10相差顯微鏡觀察活細胞細胞生長狀態良好：透明度大，細胞內顆粒少，沒有空泡，胞膜清晰。培養上清清澈透明，看不到懸浮的細胞或碎片。細胞生長狀態不良：胞質中常出現空泡、脂滴和顆粒物質，細胞形態可變得不規則，甚至失去原來特點。11無菌操作技術（一）實驗前的準

4、備根據實驗的要求，將所需物品及試劑滅菌消毒。清點所需用品，一并放入超凈臺內；12（二）無菌室和操作野消毒 實驗前，將實驗器材放人超凈臺內，打開超凈臺紫外線滅菌燈，照射30分鐘，關閉紫外線燈，同時起動超凈臺風機13（三）無菌操作基本要求洗手、著裝與外科臨床要求相同；手指不能觸及器材使用端 ；一切操作都要在火焰周圍進行，瓶口要順風斜放在支架上，試劑使用后立即封閉瓶口；細胞培養各用液要專管專用，并要勤換吸管 瓶口液滴不能再進入瓶內；動作要準確敏捷，盡量避免空氣流動；在實驗過程中，不要面向操作野講話或咳嗽。14（四）實驗后的要求關閉超凈臺風機和電源；用過的玻璃器材投入清水中浸泡，包裝紙疊卷，繩成束分類

5、歸放；最后用酒精紗布或棉球擦拭工作臺面。15細胞培養的基本條件無菌條件細胞生長條件細胞檢測條件細胞保存條件實驗室安全16細胞培養的無菌環境 無菌室的結構：一般由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。 （使用前）紫外照射（1小時）每周甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2小時）和每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進行消毒 17生物安全柜 使用前開啟柜內紫外燈照射30分鐘，預工作1015分鐘，以除去臭氧和使用工作臺面空間呈凈化狀態。使用完畢后，要用70%酒精將臺面和臺內四周擦拭干凈。還要定期用福爾馬林熏蒸。 1819火焰消毒在無菌環境進行培養時，首先要點燃酒精燈。以后一切操作，如打開或封閉瓶口等，都需在火焰近

6、處并經過燒灼進行。培養瓶滴管、試管、吸管20細胞培養的實驗用品 細胞培養瓶 25平方厘米，正方斜頸25平方厘米，三角斜頸75平方厘米，正方斜頸75平方厘米，三角斜頸150平方厘米，正方斜頸 21細胞培養板 6孔12孔24孔48孔96孔22細胞培養皿35mm60mm100mm23凍存管1.2ml 2ml5ml24離心管15ml50ml細胞刮25濾 器26液氮罐272829細胞的營養碳水化合物、氨基酸和脂類三大類也需要一定量的無機鹽、維生素和微量元素30細胞培養液 水平衡鹽溶液 pH調節液消化液抗生素溶液培養基 31平衡鹽溶液主要由無機鹽和葡萄糖配制而成作用：維持滲透壓、緩沖和調節酸堿度 常用的緩

7、沖液： 生理鹽水 PBS Hanks液 （D-Hanks常用于配制胰酶溶液）32 pH調節液(1) 碳酸氫鈉液 (2) Hepes緩沖液 是一種可以保持細胞培養過程中pH值較長時間穩定的氫離子緩沖劑通常使用濃度為1015mM 33 消化液胰蛋白酶溶液 主要作用是使細胞間的蛋白質水解，從而使貼壁細胞從瓶壁上脫落并使細胞游離分散開來 常用濃度為0.25%或5%胰蛋白酶。(2) EDTA溶液 作用機制是破壞細胞間的連接。 對于一些貼壁特別牢固的細胞，可用EDTA和胰酶的混合液 EDTA溶液的使用濃度為0.02%，配制時應加堿助溶 (3)膠原酶溶液 膠原酶在上皮類細胞原代培養時經常使用，膠原酶作用的對

8、象是膠原組織，因此不容易對細胞產生損傷。 34抗生素溶液通常是青霉素和鏈霉素聯合使用，俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要是對革蘭陽性菌有效，鏈霉素主要對革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預防絕大多數細菌污染。 培養基內青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素：每毫升100單位 35培養基分天然培養基和合成培養基天然培養基： 血清 血漿 組織提取液（如雞胚和牛胚浸液） 36合成培養基根據細胞生存所需物質的種類和數量，用人工方法模擬合成的。包括四大類物質：無機鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物目前常用培養基：RPMI-1640、DMEM、MEM另有無血清培養基、無蛋白培養基37牛血清胎牛血清應

9、取自剖腹產的胎牛新牛血清取自出生24小時之內的新生牛小牛血清取自出生1030天的小牛使用濃度： 一般為520，最常用是10 38無機鹽CaCl2 、KCl 、MgSO4、 NaCl 、NaHCO3 、NaH2PO4對調節細胞滲透壓、某些酶的活性及溶液的酸堿度都是必須的。 39氨基酸 纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)細胞用以合成蛋白質的必需原料，不能由其他氨基酸或糖類轉化合成谷氨酰胺具有特殊的作用，補加一定量的谷氨酰胺 。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性 。 40真核細胞培養、凍存、計數實驗 （下）指導老師：鞏麗云 楊一生物化學和分子

10、生物學教研室 醫學院71241傳代將細胞從一個培養瓶轉移到另一個培養瓶即稱為傳代培養原代培養的細胞在生長、繁殖一定時間后，由于空間不足或細胞密度過大導致營養枯竭，會影響細胞的生長，因此需要進行擴大培養，即傳代或稱為傳代培養。 HepG2細胞 細胞種類：人肝腫瘤細胞； 培養的天數：傳代培養2天； 細胞狀態與特征簡述：呈多角型、不規則 貼壁生長，成團聚集。 42傳代注意事項接種數量為51048105個/ml 傳代密度太低，細胞容易死亡，表現出細胞在達到增長前有較長的滯留期。培養液由于pH下降而呈現黃色，表明細胞已經達到最大密度需要換液或進行傳代培養。如果是單層貼壁的細胞，等長滿培養瓶表面，即可進行

11、傳代。 43體外培養細胞的分型 44貼附型大多數培養細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞，大致分成以下四型：成纖維細胞上皮型細胞游走細胞型多型細胞型451、成纖維細胞型名稱：凡在培養中形態與成纖維細胞類似的來源：由中胚層間充質組織起源的組織如：真正的成纖維細胞，心肌，平滑肌，成骨細胞，血管內皮形態：胞體梭形或不規則三角形，胞質向外伸出23個長短不等 的突起，中有卵圓形核生長特點：排列成放射狀，漩渦狀 細胞細胞接觸易斷開而單獨行動，游離的單獨的成纖維 樣細胞，常有幾個伸長的細胞突起46成纖維細胞47 HUVECs人臍靜脈內皮細胞1.細胞種類：人臍靜脈內皮細胞；2.培養的天數：4d；原代培養；3.放大

12、倍速：倒置顯微鏡 X20；4.培養基種類：DMEM+15胎牛 血清；5.細胞狀態與特征簡述：細胞呈梭 形，扁平形或多角形，貼壁生長。 骨髓間充質干細胞1.細胞種類：人骨髓間充質干細胞原代；2.培養天數：7天；3.放大倍數：200倍，倒置顯微鏡；4.培養基種類：DF12+10FBS；5.細胞狀態與特征簡述：使用percoll密度梯度離心法分離人骨髓細胞。首次換液48h，這是7天后的骨髓間充質干細胞擴增情況。 482、上皮型細胞名稱：僅形態上似體內，實際上不完全相同來源：來源于外胚層、內胚層細胞, 如： 皮膚及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性腫瘤形態：類似體內的上皮細胞扁平，不規則多角形，中

13、有圓形核 生長特點：易相連成片，相靠緊密相連成薄層鋪石狀生長時呈膜狀移動，很少脫離細胞群而單個活動49上皮型細胞50 SKOv3 （卵巢癌細胞）1.細胞種類：SKOv3（卵巢癌細胞）2.培養的天數：傳代后3d；3.放大倍速：倒置顯微鏡 X10；4.培養基種類：DMEM+5%胎牛血清；5.細胞狀態與特征簡述：細胞貼壁生 長，生長速度較快。 CCL-1491.細胞種類：大鼠肺泡上皮細胞；2.培養的天數：1d（種在48孔板中）；3.放大倍速：倒置顯微鏡 X20；4.培養基種類：F12K+10%胎牛血清；5.細胞狀態與特征簡述：細胞呈梭形，透亮貼壁生長，34天傳代一次，Giemsa染色。513、游走細

14、胞型：呈散在生長，一般不連成片，胞質常突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規則。此型細胞不穩定，有時難以和其他細胞相區別。 CNE11.細胞種類：高分化鼻咽癌細胞系；2.培養的天數：3d；3.放大倍速：相差100；4.培養基種類：PMI1640+10%CS；5.細胞狀態與特征簡述：貼壁細胞， 梭型成團生長。 524、多型細胞型有一些細胞，如神經細胞難以確定其規律和穩定的形態，可統歸于此類。 SD大鼠神經元 原代1.細胞種類：腦皮質細胞；2.培養的天數：4-5天；3.放大倍速：電鏡20000；4.培養基種類：DMEM+10%小牛血清+10%馬 血清；5.細胞狀態與特征簡述：貼壁細胞，有多量軸 突和

15、樹突。53懸浮型概念：培養時不貼附于底物而呈懸浮狀態生長來源：自血，脾或骨髓，尤以血中白細胞癌腫細胞特點：在懸浮中生長良好細胞圓形，單個或小細胞團優點：生存空間大，提供數量大，傳代方便(不需消化)，易于收獲，可獲得穩定狀態缺點：觀察不方便，很多細胞不能懸浮生長(尤以正常細胞)54 HL-60 分化細胞Giemsa染色1. 細胞種類：HL-60； 2. 培養的天數：ATRA 1微摩爾作用5天；3. 放大倍速：倒置顯微鏡 X10；4. 培養基種類：1640+8胎牛血清；5. 細胞狀態與特征簡述：懸浮細胞，分化的細胞核漿比例減小，核仁減少或 消失，胞核呈桿狀或分葉狀。 55 KU8121.細胞種類：

16、人嗜堿細胞性白血病細胞系；2.培養的天數：5d；3.放大倍速：倒置顯微鏡 X20；4.培養基種類：RPMI1640+10%新生牛血清；5.細胞狀態與特征簡述：細胞呈圓形，懸浮生長。 56 HeLa細胞1.細胞種類：人HeLa細胞傳代培養；2.培養的天數：7d；3.放大倍速：倒置顯微鏡 X200；4.培養基種類：DMEM+10%小牛血清；5.細胞狀態與特征簡述：細胞呈多角形，貼壁生長。 57 K562細胞1.細胞種類：K562（人慢性紅白血病細胞株）；2.培養的天數：傳代后2天；3.放大倍數：倒置顯微鏡 X10；4.培養基種類：RPMI1640+10%胎牛血清，4mM Glutamine；5.細

17、胞狀態與特征簡介：懸浮生長，少數貼壁，喜愛成團懸浮。 58 每代貼壁細胞的生長過程游離期貼壁期潛伏期對數生長期停止期（平臺期）59游離期 懸浮，胞質回縮，全部細胞變為圓球形。吸附期 貼附底物，一般24小時內貼壁。潛伏期 此時細胞有生長活動，基本無增殖。 細胞株潛伏期一般為624小時。對數生長期 細胞數隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進 行實驗研究。停止期（平臺期） 細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂 機制：接觸抑制、密度依賴性60細胞培養的污染和檢測細胞污染的種類 細菌、酵母菌、霉菌和病毒污染源 無菌操作技術不當 操作室環境不佳 污染之血清 污染之細胞 61 細菌培養液被洋蔥佰克霍爾德

18、菌污染了。洋蔥佰克霍爾德菌（Burkholderiacepacia）原屬假單胞菌屬，是植物病原菌。 62白色念珠菌污染 63真菌感染64支原體污染電鏡照片, 煎蛋狀和其他形狀 65熒光染色法(33258)顯示染色體，細胞周圍亮點為支原體66Giemsa染色法，附于胞質上黑點為支原體67掃描電鏡法顯示支原體，附于細胞表面眾多的圓形顆粒為支原體68根據細胞生長的恃點，傳代方法有3種：1懸浮生長細胞傳代 離心法傳代：離心（1000轉/分）去上清，沉淀物加新 培養液后再混勻傳代。 2半懸浮生長細胞傳代（Hela細胞） 此類細胞部分呈現貼壁生長現象，但貼壁不牢，可用 直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。3貼壁生長細胞傳代 采用酶消化法傳代。 常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。細胞傳代方法6970細胞計數計數結果以每毫升細胞數表示細胞計數的原理和方法與血細胞計數相同血細胞計數器：手工計數細胞Coulter計數儀：人工計數71細胞計數步驟1、將血球計數板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數板上。2、將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數板之間。3、靜置3分鐘。4、鏡下觀察，計算計數板四大格細胞總數。細胞數/ml4大格細胞總數/ 4104注意：壓線細胞只計左側和上方的。 鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個