1、第四講第四講 色譜技術及相關設備色譜技術及相關設備生物儀器分析生物儀器分析色譜法（色譜法（chromatographychromatography）又稱）又稱“色譜分析色譜分析”、“色譜分析法色譜分析法”、“層析法層析法”，是一種分離和，是一種分離和分析方法，在分析方法，在分析化學分析化學、有機化學、有機化學、生物化學生物化學等領域有著非常廣泛的應用。等領域有著非常廣泛的應用。是利用混合物不同組分在是利用混合物不同組分在和和中分中分配系數配系數( (或吸附系數、滲透性等或吸附系數、滲透性等) )的差異，使不的差異，使不同組分在作相對運動的兩相中進行反復分配，同組分在作相對運動的兩相中進行反復分

2、配，實現分離的分析方法。實現分離的分析方法。色譜法色譜法1 1 色譜法的發展色譜法的發展2 2 色譜法的分類色譜法的分類3 3 色譜法流出曲線及相關術語色譜法流出曲線及相關術語4 4 色譜法的原理色譜法的原理內容提要內容提要色譜法始于二十世紀初，經歷了整整一個世紀色譜法始于二十世紀初，經歷了整整一個世紀的發展到今天已經成為最重要的分離分析科學，的發展到今天已經成為最重要的分離分析科學，廣泛地應用于許多領域，如石油化工、有機合廣泛地應用于許多領域，如石油化工、有機合成、生理生化、醫藥衛生、環境保護，乃至空成、生理生化、醫藥衛生、環境保護，乃至空間探索等。間探索等。 將一滴含有混合將一滴含有混合色

3、素色素的溶液滴在的溶液滴在一塊布或一片紙上，隨著溶液的展開可以觀察一塊布或一片紙上，隨著溶液的展開可以觀察到一個個到一個個同心同心圓環出現，這種層析現象雖然古圓環出現，這種層析現象雖然古人就已有初步認識并有一些簡單的應用。人就已有初步認識并有一些簡單的應用。 TswettTswett俄國俄國植物學家關于色譜分離方法的研究始于植物學家關于色譜分離方法的研究始于19011901年，兩年后他發表了他的研究成果年，兩年后他發表了他的研究成果 一種新型一種新型吸附現象及其在生化分析上的應用，提出了應用吸吸附現象及其在生化分析上的應用，提出了應用吸附附原理原理分離植物色素的新方法。三年后，他將這種分離植物

4、色素的新方法。三年后，他將這種方法命名為色譜法（方法命名為色譜法（ChromatographyChromatography），很顯然色），很顯然色譜法譜法 （ChromatographyChromatography）這個詞是由希臘語中）這個詞是由希臘語中”色色“的寫法（的寫法（chromachroma）和）和”書寫書寫“(graphein)(graphein)這兩這兩個詞根組成的，派生詞有個詞根組成的，派生詞有chromatographchromatograph（色譜（色譜儀），儀），chromatogramchromatogram（色譜圖），（色譜圖），chromatographerchro

5、matographer（色譜工作者）等。由（色譜工作者）等。由TswettTswett的的開創性工作，因此人們尊稱他為開創性工作，因此人們尊稱他為 色譜學之父色譜學之父 ，而，而以他的名字命名的以他的名字命名的TswettTswett獎也成為了色譜界的最高獎也成為了色譜界的最高榮譽獎。榮譽獎。色譜法發明后的最初二三十年發展非常緩慢。液色譜法發明后的最初二三十年發展非常緩慢。液- -固色譜的進一步發展有賴于固色譜的進一步發展有賴于瑞典瑞典科學家科學家TiseliusTiselius（19481948年年Nobel Chemistry PrizeNobel Chemistry Prize獲得者）和

6、獲得者）和ClaessonClaesson的努力，他們創立了的努力，他們創立了液相色譜液相色譜的迎頭法和的迎頭法和頂替法。頂替法。分配色譜分配色譜是由著名的英國科學家是由著名的英國科學家MartinMartin和和 SyngeSynge創立的，他們因此而獲得創立的，他們因此而獲得19521952年的諾貝爾化年的諾貝爾化學獎。學獎。1941年，Martin和Synge采用水分飽和的硅膠為固定相，以含有乙醇的氯仿為流動相分離乙酰基氨基酸，他們在這一工作的論文中預言了用氣體代替液體作為流動相來分離各類化合物的可能性。 1951年，Martin和James報道了用自動滴定儀作檢測器分析脂肪酸，創立了氣

7、-液色譜法。 1958年，Golay首先提出了分離效能極高的毛細管柱氣相色譜法，發明了玻璃毛細管拉制機，從此氣相色譜法超過最先發明的液相色譜法而迅速發展起來，今天常用的氣相色譜檢測器也幾乎是在五十年代發展起來的。七十年代發明了石英毛細管柱和固定液的交聯技術。隨著電子技術和計算機技術的發展氣相色譜儀器也在不斷發展完善中，到現在最先進的氣相色譜儀已實現了全自動化和計算機控制，并可通過網絡實現遠程診斷和控制。 “色譜法色譜法” 名稱的由來名稱的由來石油醚石油醚(流動相流動相)碳酸鈣碳酸鈣( (固定相固定相) )色色譜譜帶帶色譜法起源于20世紀初，1906年俄國植物學家米哈伊爾茨維特用碳酸鈣填充豎立的

8、玻璃管，以石油醚洗脫植物色素的提取液，經過一段時間洗脫之后，植物色素在碳酸鈣柱中實現分離，由一條色帶分散為數條平行的色帶。氣相色譜和色譜理論的出現氣相色譜和色譜理論的出現 1952年馬丁和詹姆斯提出用氣體作為流動相進行色譜分離的想法，他們用硅藻土吸附的硅酮油作為固定相，用氮氣作為流動相分離了若干種小分子量揮發性有機酸。 氣相色譜的出現使色譜技術從最初的定性分離手段進一步演化為具有分離功能的定量測定手段，并且極大的刺激了色譜技術和理論的發展。相比于早期的液相色譜，以氣體為流動相的色譜對設備的要求更高，這促進了色譜技術的機械化、標準化和自動化；氣相色譜需要特殊和更靈敏的檢測裝置，這促進了檢測器的開

9、發；而氣相色譜的標準化又使得色譜學理論得以形成色譜學理論中有著重要地位的塔板理論和Van Deemter方程，以及保留時間、保留指數、峰寬等概念都是在研究氣相色譜行為的過程中形成的。 高效液相色譜高效液相色譜1960年代，為了分離蛋白質、核酸等不易汽化的大分子物質，氣相色譜的理論和方法被重新引入經典液相色譜。1960年代末科克蘭、哈伯、荷瓦斯、莆黑斯、里普斯克等人開發了世界上第一臺高效液相色譜儀，開啟了高效液相色譜的時代。高效液相色譜使用粒徑更細的固定相填充色譜柱，提高色譜柱的塔板數，以高壓驅動流動相，使得經典液相色譜需要數日乃至數月完成的分離工作得以在幾個小時甚至幾十分鐘內完成。 1971年

10、科克蘭等人出版了液相色譜的現代實踐一書，標志著高效液相色譜法 （HPLC）正式建立。1 1 色譜法的發展色譜法的發展2 2 色譜法的分類色譜法的分類3 3 色譜法流出曲線及相關術語色譜法流出曲線及相關術語4 4 色譜法的原理色譜法的原理內容提要內容提要 色譜法的分類色譜法的分類1 1 根據流動相的根據流動相的物態可分為物態可分為氣相色譜氣相色譜(GC)(GC)液相色譜液相色譜(LC)(LC)超臨界流體色譜超臨界流體色譜(SFC)(SFC)2 2 根據固定相的外形分根據固定相的外形分柱色譜柱色譜平板色譜平板色譜平平 板板 色色 譜譜吸附色譜：吸附色譜：利用吸附劑對不同組分的吸附性能的差別而進行分

11、離，常用的吸附劑有氧化鋁、硅膠、聚酰胺等有吸附活性的物質。包括氣-固吸附色譜和液-固吸附色譜。分配色譜：分配色譜：利用不同的組分在兩相間的分配系數的差別而進行分離，常用的載體有硅膠、硅藻土、硅鎂型吸附劑與纖維素粉等包括氣液分配色譜和液-液分配色譜。3 3 根據分離機理可分為根據分離機理可分為: :離子交換色譜離子交換色譜離子交換色譜中的固定相固定相是一些帶電荷的基團，這些帶電基團通過靜電相互作用與帶相反電荷的離子結合。如果流動相中存在其他帶相反電荷的離子，按照質量作用定律，這些離子將與結合在固定相上的反離子進行交換。固定相基團帶正電荷的時候，其可交換離子為陰離子，這種離子交換劑為陰離子交換劑；

12、固定相的帶電基團帶負電荷，可用來與流動相交換的離子就是陽離子，這種離子交換劑叫做陽離子交換劑。排阻色譜：排阻色譜：用化學惰性的多孔性凝膠作固定相，按固定相對樣品中各組分分子體積阻滯作用的差別來實現分離。當分子進入當分子進入色譜柱后，它們中的不同組分按其大小進入相色譜柱后，它們中的不同組分按其大小進入相應的孔徑內，大小大于所有孔徑的分子不能進應的孔徑內，大小大于所有孔徑的分子不能進入填充劑顆粒內部，在色譜過程中不被保留，入填充劑顆粒內部，在色譜過程中不被保留，最早被流動相洗脫至柱外，表現為保留時間較最早被流動相洗脫至柱外，表現為保留時間較短；大小小于所有孔徑的分子能自由進入填充短；大小小于所有孔

13、徑的分子能自由進入填充劑表面的所有孔徑，在柱子中滯留時間較長，劑表面的所有孔徑，在柱子中滯留時間較長，表現為保留時間較長；其余分子則按分子大小表現為保留時間較長；其余分子則按分子大小依次被洗脫。依次被洗脫。 1 1 色譜法的發展色譜法的發展2 2 色譜法的分類色譜法的分類3 3 色譜法流出曲線及相關術語色譜法流出曲線及相關術語4 4 色譜法的原理色譜法的原理內容提要內容提要色譜流出曲線及有關術語色譜流出曲線及有關術語圖4-1基線基線鋒高鋒高h ht 0 如果進樣量很小，濃度很低，在吸附等溫線的線性范圍內，色譜峰如果對稱，可用Gauss正態分布函數表示： 式中：C不同時間t時某物質的濃度，C0進

14、樣濃度，tr保留時間，標準偏差。)(21exp220rttCC1、基線 是柱中僅有流動相通過時，檢測器響應訊號的記錄值，即圖41中Ot線穩定的基線應該是一條水平直線 2、峰高 色譜峰頂點與基線之間的垂直距離，以h表示，如圖41中BA 3 區域寬度 色譜峰的區域寬度是組份在色譜柱中譜帶擴張的函數，它反映了色譜操作條件的動力學因素度量色譜峰區域寬度通常有三種方法： （1）.標準偏差標準偏差 即0.607倍峰高處色譜峰寬的一半，如圖41中EF距離的一半。 （2）.半峰寬半峰寬W1/2即峰高一半處對應的峰寬，如圖41中GH間的距離它與標準偏差的關系是： W1/2 = 2.354 （3 3）. . 基線

15、寬度基線寬度W W 即色譜峰兩側拐點上的切線在基線上的截距，如圖41中IJ的距離它與標準偏差的關系是： W = 4 2/17.1WW 保留值保留值定性定性1 1 死時間死時間t t0 0死時間死時間(dead time)-(dead time)-不保留組分的保留時不保留組分的保留時間間 不被固定相吸附或溶解的物質進入色譜柱時，從進樣到出現峰極大值所需的時間稱為死時間，如圖41中 OA。因為這種物質不被固定相吸附或溶解，故其流動速度將與流動相的流動速度相近測定流動相平均線速時，可用往長L與t t0 0的比值計算。流動相流動相平均線速度平均線速度0tLu 柱長柱長2 2 保留時間保留時間t tr

16、r試樣從進樣開始到柱后出現峰極大點時所經歷的時間，稱為保留時間，如圖41 OB它相應于樣品到達柱末端的檢測器所需的時間 3 3 校正校正( (調整調整) )保留時間保留時間保留時間是色譜法定性的基本依據，但同一組份的保留時間常受到流動相流速的影響，因此色譜工作者有時用保留體積等參數進行定性檢定 4 4死體積死體積 V V0 0 指色譜柱在填充后，柱管內固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測器的空間的總和當后兩項很小而可忽略不計時，死體積可由死時間與流動相體積流速F0（Lmin）計算： V0= t0F0 5 5保留體積保留體積 V VR R 指從進樣開始到被測組份在柱后出

17、現濃度極大點時所通過的流動相體積。保留體積與保留時間t的關系如下： VR = tRF0 6 6調整保留體積調整保留體積V VR 某組份的保留體積扣除死體積后，稱該組份的調整保留體積，即 VR= VR-V0 7 7相對保留值相對保留值2.1 某組份2的調整保留值與組份1的調整保留值之比，稱為相對保留值：12121.2RRRRVVtt 由于相對保留值只與柱溫及固定相的性質有關，而與柱徑、柱長、填充情況及流動相流速無關，因此，它是色譜法中，特別是氣相色譜法中，廣泛使用的定性數據 必須注意，相對保留值絕對不是兩個組份保留時間或保留體積之比 。8 分離因子 在定性分析中，通常固定一個色譜峰作為標準（s）

18、，然后再求其它峰（i）對這個峰的相對保留值此時，ri/s可能大于1，也可能小于1在多元混合物分析中，通常選擇一對最難分離的物質對，將它們的相對保留值作為重要參數在這種特殊情況下，可用符號表示： 式中tR2為后出峰的調整保留時間，所以這時總是大于1的 。12RRtt色譜流出曲線上的信息1 根據色譜峰的個數，可判斷樣品所含的最少組份數。2 根據色譜峰的保留值，可以進行定性分析。3 根據色譜峰的面積或峰高, 可以進行定量分析4 色譜峰的保留值及其區域寬度是評價色譜柱分離效能的依據5 色譜峰兩峰間的距離，是評價固定相(或流動相)選擇是否合適的依據。1 1 色譜法的發展色譜法的發展2 2 色譜法的分類色

19、譜法的分類3 3 色譜法流出曲線及相關術語色譜法流出曲線及相關術語4 4 色譜法的原理色譜法的原理內容提要內容提要色譜分析的基本原理組分保留時間為何不同？色譜峰為何變寬？ 色譜法分析的基本原理 色譜分析的目的是將樣品中各組分彼此分離，組分要達到完全分離，兩峰間的距離必須足夠遠，兩峰間的距離是由組分在兩相間的分配系數決定的，即與色譜過程的熱力學性質有關。但是兩峰間雖有一定距離，如果每個峰都很寬，以致彼此重疊，還是不能分開。這些峰的寬或窄是由組分在色譜柱中傳質和擴散行為決定的，即與色譜過程的動力學性質有關。因此，要從熱力學和動力學兩方面來研究色譜行為。 (一）分配系數K和分配比kmsccK 組分在

20、固定相中的濃度組分在流動相中的濃度1 分配系數k 如前所述，分配色譜的分離是基于樣品組分在固定相和流動相之間反復多次地分配過程，而吸附色譜的分離是基于反復多次地吸附一脫附過程。這種分離過程經常用樣品分子在兩相間的分配來描述，而描述這種分配的參數稱為分配系數見它是指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動相之間分配達平衡時的濃度之比值，即 組分一定時，K 主要取決于固定相性質組分及固定相一定時,溫度增加,K 減小試樣中的各組分具有不同的K 值是分離的基礎選擇適宜的固定相可改善分離效果影響影響K K 的因素的因素固定相、溫度2 分配比(容量因子)k 分配比又稱容量因子，它是指在一定溫度和壓力下，組分

21、在兩相間分配達平衡時，分配在固定相和流動相中的質量比。即 msmmk 組分在固定相中的質量 組分在流動相中的質量K與k都是與組分及固定相的熱力學性質有關的常數。K與k都是衡量色譜柱對組分保留能力的參數，數值越大，該組分的保留時間越長。k可直接從色譜圖上獲得。 k值越大，說明組分在固定相中的量越多，相當于柱的容量大，因此又稱分配容量或容量因子。它是衡量色譜柱對被分離組分保留能力的重要參數。k值也決定于組分及固定相熱力學性質。它不僅隨柱溫、柱壓變化而變化，而且還與流動相及固定相的體積有關。 mmssmsVCVCnnkmm3 滯留因子 Rs 設流動相在柱內的線速度為u，組分在柱內線速度為us，由于固

22、定相對組分有保留作用，所以usu此兩速度之比稱為滯留因子Rs。 rmssttuuR0Rs若用質量分數表示，即 對組分和流動相通過長度為L的色譜柱，其所需時間分別為sruLtknnnnnRmssmms1111mmmmmuLtm0可得： )1 (kttmr0mrmrmmrVVtttttk00004. 分配系數K與分配比k的關系 其中稱為相比率，它是反映各種色譜柱型特點的又一個參數。例如，對填充柱，其值一般為6-35；對毛細管柱，其值為60-600。 5分配系數K及分配比k與分離因子的關系 根據上述式子，對A、B兩組分的選擇因子，用下式表示 )()()()()()(AKBKAkBkAtBtrr 上式

23、表明：通過選擇因子把實驗測量值k與熱力學性質的分配系數K直接聯系起來，對固定相的選擇具有實際意義。如果兩組分的K或k值相等，則=1，兩個組分的色譜峰必將重合，說明分不開。兩組分的K或k值相差越大，則分離得越好。因此兩組分具有不同的分配系數是色譜分離的先決條件。6 6 分離度分離度)WW()tt (2)WW(21ttR211r2r211r2r 定義：相鄰兩組分的色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰底寬均值的比值tr2, tr1: 組分組分2和組分和組分1的保留時間的保留時間W2, W1: 組分組分2和組分和組分1的峰底寬度的峰底寬度R=1.5完全分離完全分離 (二）色譜理論-塔板理論 最早由Marti

24、n等人提出塔板理論，把色譜柱比作一個精餾塔，沿用精餾塔中塔板的概念來描述組分在兩相間的分配行為，同時引入理論塔板數作為衡量柱效率的指標。 該理論假定： （i）在柱內一小段長度H內，組分可以在兩相間迅速達到平衡。這一小段柱長稱為理論塔板高度H。 （ii）以氣相色譜為例，載氣進入色譜柱不是連續進行的，而是脈動式，每次進氣為一個塔板體積（Vm）。 （iii）所有組分開始時存在于第0號塔板上，而且試樣沿軸（縱）向擴散可忽略。 （iv）分配系數在所有塔板上是常數，與組分在某一塔板上的量無關。 為簡單起見，設色譜往由5塊塔板（n5，n為柱子的塔板數）組成，并以r表示塔板編號，r=1，2，nl；某組分的分配

25、比k=1. 根據上述假定，在色譜分離過程中，該組分的分布可計算如下： 開始時，若有單位質量，即m=1（例1mg或1g）的該組分加到第0號塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ms=mm故mm=ms=0.5。當一個板體積（lV）的載氣以脈動形式進入0號板時，就將氣相中含有nm部分組分的載氣頂到1號板上，此時0號板液相（或固相）中ms部分組分及1號板氣相中的mm部分組分，將各自在兩相間重新分配。故0號板上所含組分總量為05，其中氣液（或氣固）兩相各為025而1號板上所含總量同樣為05氣液（或氣固）相亦各為025。以后每當一個新的板體積載氣以脈動式進入色譜柱時，上述過程就重復一次(見下表)。1 塔板理論

26、塔板理論柱分離效能指標柱分離效能指標* k=1 塔板號塔板號載氣塔板體積數載氣塔板體積數01234柱出口柱出口01234567891011121314151610.50.250.1250.0630.0320.0160.0080.0040.0020.00100000000.50.50.3750.250.1570.0950.0560.0320.0180.0100.0050.0020.001000000.250.3750.3750.3130.2350.1650.1110.0720.0450.0280.0160.0100.0050.0020.0010.000.1250.250.3130.3130.27

27、40.220.1660.0940.0700.0490.0330.0220.0140.00800000.0630.1570.2350.2740.2740.2470.2070.1510.1100.080.0570.0400.027000000.0320.0790.1180.1380.1380.1240.1040.0760.0560.0400.0280.020 按上述分配過程，對于n=5，k=1，m=1的體系，隨著脈動進入柱中板體積載氣的增加，組分分布在柱內任一板上的總量（氣液兩相中的總質量）見表：4-2由塔板理論可建流出曲線方程： m為組分質量，Vr為保留體積，n為理論塔板數。當V=Vr 時，C值

28、最大，即)1 (2exp22rrVVnVmnCrVmnC2max222/11654. 5 WtWtnrrnLH 理論塔板數理論塔板數理理論論塔塔板板高高度度色譜柱長度色譜柱長度當色譜柱長度一定時，塔板數當色譜柱長度一定時，塔板數 n 越大越大( (塔板高度塔板高度 H 越小越小) )，被測組分在柱內，被測組分在柱內被分配的次數越多，柱效能越高，所被分配的次數越多，柱效能越高，所得色譜峰越窄。得色譜峰越窄。由流出曲線方程可推出： 從上兩式可以看出，色譜峰W越小，n就越大，而H就越小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指標。 通常填充色譜柱的n103，H1mm。而毛細管柱 n=105-106，

29、H0.5mm 由于死時t0包括在tr中,而實際的t0不參與柱內分配,所計算的n值盡大,H很小,但與實際柱效能相差甚遠.所以,提出把t0扣除,采用有效理論塔板數neff和有效塔板高Heff評價柱效能。 222/11654. 5 WtWtnrreffeffeffnLH 不同物質在同一色譜柱上的分配系數不同，用有效塔板數和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標時，應指明測定物質。有效塔板數有效板高由分離度和塔板理論推出基本色譜分離方程式)(212112WWttRrr 對于難分離相鄰兩組分：W1W2WWttWttRrrrr1212 22162 Wtnreff反反映映柱柱效效，則則有有若若以以組組分分2221

30、22211616 RtttRnrrreffRttWrr12 22220222221 kktttttnnrrrreff 11422kknR 14 effnR分離度與分離度與k、n及及 的關系的關系 k從從1增加到增加到3，R增加到原來的增加到原來的1.5倍倍 (k: 2-7) n增加到原來的增加到原來的3倍倍，R增加到原來的增加到原來的1.7倍倍 從從1.01增加到增加到1.1，增加約增加約9，R增增 加到原來的加到原來的9倍倍 結論結論選擇合適的固定相選擇合適的固定相(流動相流動相)以增加以增加 是改善分離度最有效的方法是改善分離度最有效的方法 1) 各組分的分配系數必須不同。這一條件通過選擇

31、合適的固定相來實現。2) 區域擴寬的速度應小于區域分離的速度，即色譜柱的柱效要高。3) 在保證快速分離的前提條件下，色譜柱應足夠長。使試樣中的不同組分分離需要滿足的條件雙K與“五保”，塔板n/H。 1，沒有戲！R1.5, 全分離。 塔板理論用熱力學觀點形象地描述了溶質在色譜柱中的分配平衡和分離過程，導出流出曲線的數學模型，并成功地解釋了流出曲線的形狀及濃度極大值的位置，還提出了計算和評價柱效的參數。但由于它的某些基本假設并不完全符合柱內實際發生的分離過程，例如，縱向擴能解釋造成譜帶擴張的原因和影響板高的各種因素，也不能說明為什么在不同流速下可以測得不同的理論塔板數，這就限制了它的應用。 2 速

32、率理論影響柱效的因素CuuBAH 流動相流動相線速度線速度范弟姆特方程1) 渦流擴散項渦流擴散項ApdA 2 固定相顆粒越小，填充的越均勻固定相顆粒越小，填充的越均勻A越小，越小，H越小，柱效越高，色譜峰越窄。越小，柱效越高，色譜峰越窄。2) 分子擴散項分子擴散項B/u(縱向擴散項縱向擴散項)gDB 2 流動相流動相柱內譜帶構型柱內譜帶構型相應的響應信號相應的響應信號產生原因：產生原因：濃度梯度濃度梯度影響因素：影響因素：流動相流速；流動相流速；氣體擴散系數氣體擴散系數)1(載氣載氣MDg 3) 傳質阻力項傳質阻力項CuuCuCCulg gpgDdkkC222)1(01. 0 氣相傳質阻力氣相

33、傳質阻力固定相顆粒越小，載氣分子量越小固定相顆粒越小，載氣分子量越小氣相傳質阻力越小氣相傳質阻力越小lflDdkkC22)1(32 液相傳質阻力液相傳質阻力固定液粘度及液膜厚度越小固定液粘度及液膜厚度越小液相傳質阻力越小液相傳質阻力越小4) 流動相線速度對板高的影響流動相線速度對板高的影響CuuBAH 例1：已知一色譜柱在某溫度下的速率方程的A=0.08cm; B=0.65cm2/s; C=0.003s, 求最佳線速度u和最小塔板高H. 解: H=A+B/u+Cu欲求 u最佳和H最小,要對速率方程微分,即 dH/dud(A+B/u+Cu)/du-B/u2+C0最佳線速: u最佳(B/C)1/2

34、 (0.65/0.003)1/214.7cm/s最小板高: H最小A+2(BC)1/2 0.08+2(0.650.003)1/20.17cm例2：有一根 l m長的柱子，分離組分1和2得到如下色譜圖。圖中橫坐標l為記錄筆走紙距離。若欲得到 R=1.2的分離度，有效塔板數應為多少？色譜柱要加到多長？22116 Rneff需要需要解法解法1 11 . 154554912 rrtt R=1.2,)(278811 . 11 . 12 . 11622塊塊需要需要 effn1) 14 effnR2)需要需要原來原來需要需要原來原來LLnneffeff effeffHnL 原來原來需要需要原來原來需要需要e

35、ffeffnnLL )(1239545491616222塊塊原原來來 Wtneff)(25. 2123927881mL 需要需要8 . 054549 原原R解法解法2)(25. 28 . 02 . 112mL需需要要 需要需要原來原來需要需要原來原來需要需要原來原來LLRRnneffeff2 1) 同解法同解法12)22116 Rneff氣相色譜實驗技術氣相色譜實驗技術一一 氣相色譜儀氣相色譜儀GC工作過程工作過程載氣系統載氣系統進樣系統進樣系統分離系統分離系統檢測和檢測和記錄系統記錄系統溫控系統溫控系統（一）載氣系統（一）載氣系統常用載氣：常用載氣：氮氣、氦氣、氫氣及氬氣氮氣、氦氣、氫氣及氬

36、氣氣源氣源凈化干燥管凈化干燥管載氣流速控制裝置載氣流速控制裝置 載氣系統載氣系統載氣選擇依據載氣選擇依據檢測器檢測器柱效柱效 （二）進樣系統（二）進樣系統注射器注射器氣化室氣化室進樣系統進樣系統 進樣器進樣器氣化室氣化室溫度比柱溫高溫度比柱溫高出出1050取樣位置取樣位置 試樣導入色譜柱試樣導入色譜柱六通閥進樣器六通閥進樣器（三）分離系統（三）分離系統(色譜柱色譜柱)色譜柱色譜柱填充柱填充柱毛細管柱毛細管柱柱內徑柱內徑1-10 mm0.05-0.5 mm柱長度柱長度 0.5-10 m10-150 m總塔板數總塔板數103 106樣品容量樣品容量 10-1000 0.1-50g g 1 氣液色譜

37、固定相氣液色譜固定相 組成組成擔體擔體(載體載體)固定液固定液硅藻土硅藻土紅色紅色白色白色非硅藻土非硅藻土 1) 擔體擔體(載體載體)對載體的要求對載體的要求 具有多孔性，即比表面積大。具有多孔性，即比表面積大。 化學惰性，表面沒有活性，有較好的化學惰性，表面沒有活性，有較好的浸潤性。浸潤性。 熱穩定性好。熱穩定性好。 有一定的機械強度，使固定相在制備有一定的機械強度，使固定相在制備和填充過程中不易粉碎。和填充過程中不易粉碎。SiOHO SiOHSiCH3CH3ClCl+Si O SiSiCH3CH3OO+ HCl 擔體的表面處理擔體的表面處理a. 酸洗酸洗濃鹽酸浸泡，除去堿性作用基團濃鹽酸浸

38、泡，除去堿性作用基團b. 堿洗堿洗氫氧化鉀甲醇溶液浸泡，除去酸氫氧化鉀甲醇溶液浸泡，除去酸 性作用性作用基團基團c. 硅烷化硅烷化除去擔體表面的氫鍵作用力除去擔體表面的氫鍵作用力二甲基二甲基二氯硅二氯硅烷烷2) 固定液固定液高沸點的有機化合物高沸點的有機化合物 對固定液的要求對固定液的要求 熱穩定性好，在操作溫度下不發生聚合、分熱穩定性好，在操作溫度下不發生聚合、分解等反應；具有較低的蒸氣壓，以免流失。解等反應；具有較低的蒸氣壓，以免流失。 化學穩定性好，不與樣品或載氣發生不可逆化學穩定性好，不與樣品或載氣發生不可逆的化學反應。的化學反應。 粘度和凝固點低，以便在載體表面能均勻分粘度和凝固點低

39、，以便在載體表面能均勻分布。布。 對樣品中的各組分有適當的溶解度。對樣品中的各組分有適當的溶解度。(填充填充柱柱 ，毛細管柱，毛細管柱 )15. 1 08. 1 組分與固定液分子間的相互作用組分與固定液分子間的相互作用 靜電力極性分子之間的作用力靜電力極性分子之間的作用力 誘導力極性與非極性分子之間的作用力誘導力極性與非極性分子之間的作用力 色散力非極性分子之間的作用力色散力非極性分子之間的作用力 氫鍵力氫原子與電負性很大的原子氫鍵力氫原子與電負性很大的原子(如如F、O、N等等) 之間的作用力之間的作用力 固定液的相對極性固定液的相對極性P)()(lg)()(lg正丁烷正丁烷丁二烯丁二烯或或環

40、己烷環己烷苯苯rrrrttqttq 角鯊烷角鯊烷氧二丙腈氧二丙腈:2;, :1 )()(100100211qqqqPxx 固定液的選擇原則固定液的選擇原則“相似相溶相似相溶”a. 非極性物質非極性物質非極性固定液非極性固定液。 沸點沸點越低的組分越早出峰。越低的組分越早出峰。b. 極極性物質性物質極性固定液極性固定液。 極性極性越小的組分出越早出峰。越小的組分出越早出峰。c. 極極性與非極性混合物性與非極性混合物極性固定液極性固定液。 極性越小的組分出越早出峰。極性越小的組分出越早出峰。d. 易易形成氫鍵物質形成氫鍵物質極性或氫鍵型固定液。極性或氫鍵型固定液。 不易形成氫鍵的組分先出峰，易形成

41、氫鍵不易形成氫鍵的組分先出峰，易形成氫鍵的組分后出峰。的組分后出峰。e. 復雜難分離樣品復雜難分離樣品多種固定液混合多種固定液混合固定液固定液極性極性適用范圍適用范圍100二甲基聚硅二甲基聚硅氧烷氧烷非極性非極性脂肪烴化合物，脂肪烴化合物，石化產品石化產品(50三氟丙基三氟丙基)甲甲基聚硅氧烷基聚硅氧烷中等極性中等極性極性化合物，如極性化合物，如高級脂肪酸高級脂肪酸聚乙二醇聚乙二醇中強極性中強極性極性化合物，如極性化合物，如醇、羧酸酯等醇、羧酸酯等常用毛細管色譜柱固定液常用毛細管色譜柱固定液2 氣固色譜固定相氣固色譜固定相永久性氣體永久性氣體惰性氣體惰性氣體低沸點有機化合物低沸點有機化合物分離

42、對象分離對象分離測定有機物中的痕量水分離測定有機物中的痕量水高分子多孔微球高分子多孔微球硅膠強極性硅膠強極性氧化鋁弱極性氧化鋁弱極性活性炭非極性活性炭非極性分子篩分子篩強極性強極性高分子多孔微球高分子多孔微球(GDX)固體吸附劑固體吸附劑(四四) 檢測系統檢測系統1 熱導池檢測器熱導池檢測器 (TCD)參比參比測量測量R1R2ABR1*R參比參比=R2*R測量測量只有載氣通過時只有載氣通過時載氣載氣+組分組分R1*R參比參比R2*R測量測量利用載氣與組分熱導系數的差異進行測量利用載氣與組分熱導系數的差異進行測量載氣對載氣對熱導檢測器靈敏度的影響熱導檢測器靈敏度的影響某些氣體與蒸氣的熱導系數某些

43、氣體與蒸氣的熱導系數/10-4J(cms)-1氣體氣體熱導系數熱導系數氣體氣體熱導系數熱導系數氫氣氫氣22.4甲烷甲烷4.56氦氣氦氣17.41乙烷乙烷3.06氮氣氮氣3.14丙烷丙烷2.64氧氣氧氣3.18甲醇甲醇2.30空氣空氣3.14乙醇乙醇2.22氬氣氬氣2.18丙酮丙酮1.76影響熱導檢測器靈敏度的因素影響熱導檢測器靈敏度的因素載氣種類；載氣種類；熱絲工作電流；熱絲工作電流；熱絲與池體溫度差。熱絲與池體溫度差。適用范圍適用范圍 測量對象：通用測量對象：通用 色譜柱：填充柱色譜柱：填充柱 2 氫氫火焰離子化檢測器火焰離子化檢測器 (FID) CH6HC66裂裂解解 CHO6e6O3CH

44、62 OH6CO6OH6CHO632火焰離子化機理火焰離子化機理 適用范圍適用范圍 含碳有機化合物含碳有機化合物 影響檢測靈敏度的因素影響檢測靈敏度的因素氫氮比；空氣流量；極化電壓。氫氮比；空氣流量；極化電壓。3 電子捕獲檢測器電子捕獲檢測器 (ECD) eNN22 ABeABABNNAB22 電子電子捕獲機理捕獲機理 適用范圍適用范圍 鹵素及親電子物質鹵素及親電子物質飲用水中三鹵甲烷色譜圖飲用水中三鹵甲烷色譜圖水水氯氯氯仿氯仿二氯溴甲烷二氯溴甲烷二溴氯甲烷二溴氯甲烷溴仿溴仿4 火焰光度檢測器火焰光度檢測器 (FPD) 222SOCOO2RS S2OH4H4SO222 *2C390SSS )n

45、m394(hSSmax*2 )nm526(hHPOHPOmax* 響應機理響應機理 適用范圍適用范圍 含硫、磷化合物含硫、磷化合物含磷化合物含磷化合物含硫化合物含硫化合物三三九九一一一一乙乙拌拌磷磷地地亞亞農農倍倍硫硫磷磷對對硫硫磷磷丙丙硫硫磷磷乙乙硫硫磷磷乙乙丙丙硫硫磷磷谷谷硫硫磷磷壤壤蟲蟲磷磷豐豐索索磷磷蠅蠅毒毒磷磷馬馬拉拉硫硫磷磷一一0五九五九5 質譜檢測器質譜檢測器毛毛細細管管柱柱接口接口離子源離子源離子檢測器離子檢測器加加熱熱器器溫溫度度傳傳感感器器6 原子發射光譜檢測器原子發射光譜檢測器二二 色譜分離操作條件的選擇色譜分離操作條件的選擇1. 色譜色譜柱柱固定相；固定相；固定液液膜厚

46、度；固定液液膜厚度；柱長等柱長等檢測器檢測器載氣載氣柱柱效效u 較小時，選擇分子量較較小時，選擇分子量較大的載氣（大的載氣（N2，Ar）；）；u 較大時，選擇分子量較較大時，選擇分子量較小的載氣小的載氣(H2，He) u的選的選擇擇3. 的選擇的選擇改變柱溫產改變柱溫產生的影響生的影響柱柱效效增加柱溫可加快氣增加柱溫可加快氣相、液相的傳質速相、液相的傳質速率，有利于降低塔率，有利于降低塔板高度，改善柱效；板高度，改善柱效；但同時又會加劇縱但同時又會加劇縱向擴散，從而導致向擴散，從而導致柱效下降。柱效下降。 分離度分離度柱溫升高，柱溫升高， K 減小，分離度減小，分離度下降。下降。分析時間分析時

47、間降低柱溫，分析降低柱溫，分析時間增加時間增加 柱溫應控制在固定液的柱溫應控制在固定液的最高使用溫度最高使用溫度和和最低使用溫度范圍之內。最低使用溫度范圍之內。 使最難分離的組分有盡可能好的分離前使最難分離的組分有盡可能好的分離前提下，采取適當低的柱溫，但以保留時提下，采取適當低的柱溫，但以保留時間適宜，峰形不拖尾為度。間適宜，峰形不拖尾為度。 柱溫一般選擇在組分平均沸點左右。柱溫一般選擇在組分平均沸點左右。 組分復雜，沸程寬的試樣，采用程序升組分復雜，沸程寬的試樣，采用程序升溫。溫。選擇原則選擇原則程序升溫程序升溫50250，8/min恒溫恒溫150 正構烷烴恒溫和程序升溫色譜圖比較正構烷烴

48、恒溫和程序升溫色譜圖比較程序升溫不僅可以改善分離，而且可程序升溫不僅可以改善分離，而且可以縮短分析時間。以縮短分析時間。 4. 進樣量的選擇進樣量的選擇 進樣量進樣量柱柱效效進樣量過大，使色進樣量過大，使色譜柱超載，柱效急譜柱超載，柱效急劇下降，峰形變寬劇下降，峰形變寬檢測器檢測器 進樣量過大，峰高進樣量過大，峰高或峰面積與進樣量或峰面積與進樣量的線性關系被破壞的線性關系被破壞 進樣量應控制在柱容量允許范圍進樣量應控制在柱容量允許范圍及檢測器線性檢測范圍之內及檢測器線性檢測范圍之內氣相色譜分析方法及應用氣相色譜分析方法及應用一一 定性分析定性分析1 用已知純物質用已知純物質 對照定性對照定性保

49、留值定性保留值定性峰高增加法定峰高增加法定性性 (1) 經驗規律經驗規律碳數規碳數規律律在一定溫度下，在一定溫度下，的調整保留時間的的調整保留時間的對數與分子中碳數成線性關系對數與分子中碳數成線性關系)3(lg nCAntr如果知道兩種或更多同系物的調整保留時間，則如果知道兩種或更多同系物的調整保留時間，則可求出常數可求出常數A和和C。從色譜圖查出未知物的。從色譜圖查出未知物的 后，后，根據上式即可求出未知物的碳數。根據上式即可求出未知物的碳數。rt(2) 相對保留值相對保留值(3) 保留指數保留指數lglglglg100)()1()()(ZrZrZrxrxttttZI Z, Z+1:正構烷烴

50、的碳原子數正構烷烴的碳原子數進樣)(xrt)(Zrt)1( Zrt例：乙酸正丁酯在阿皮松例：乙酸正丁酯在阿皮松L柱上的流出曲線如下柱上的流出曲線如下圖所示。由圖中測得調整保留距離為：乙酸正圖所示。由圖中測得調整保留距離為：乙酸正丁酯丁酯310.0 mm，正庚烷，正庚烷174.0 mm，正辛烷，正辛烷373.4 mm。求乙酸正定酯的保留指數。求乙酸正定酯的保留指數。6 .7750 .174lg4 .373lg0 .174lg0 .310lg7100 xI在與文獻值對照時，一在與文獻值對照時，一定要重視文獻值的實驗定要重視文獻值的實驗條件，如固定液、柱溫條件，如固定液、柱溫等。而且要用幾個已知等。

51、而且要用幾個已知組分進行驗證。組分進行驗證。 聯機定性聯機定性GC/MS(氣相色譜氣相色譜- -質譜質譜) )例：川桂皮揮發油的化學成分分析例：川桂皮揮發油的化學成分分析色譜柱：色譜柱：SE54(30m0.25mm0.25m) 色譜操作條件色譜操作條件載氣：氦氣，流速載氣：氦氣，流速1mL/min柱溫：初溫柱溫：初溫60保持保持1min，8 /min升溫至升溫至150 ，6 /min升溫至升溫至190 ，8 /min升升溫至溫至250 ，保持，保持1min總離子流色譜圖總離子流色譜圖6號峰的質譜圖號峰的質譜圖GC/AES(氣相色譜原子發射光譜氣相色譜原子發射光譜)二甲基硒二甲基硒烯丙基甲基硒烯

52、丙基甲基硒甲基亞磺基硒酸甲酯甲基亞磺基硒酸甲酯二甲基二硒二甲基二硒2丙稀硫硒酸甲酯丙稀硫硒酸甲酯 1丙稀硫硒酸甲酯丙稀硫硒酸甲酯 雙雙(甲硫甲硫)硒硒烯丙基甲基烯丙基甲基硫硫二甲基二硫二甲基二硫二烯丙基硫二烯丙基硫烯丙基甲基二硫烯丙基甲基二硫二甲基三硫二甲基三硫二烯丙基二硫二烯丙基二硫烯丙基甲基三硫烯丙基甲基三硫二烯丙基三硫二烯丙基三硫GC-AES同時檢測大蒜中碳、硫、硒化合物同時檢測大蒜中碳、硫、硒化合物Se(196.1 nm)C(193.1 nm)S(180.7 nm)4 幾種方法聯合定性幾種方法聯合定性化合物化合物GC-MS色譜保留指數色譜保留指數質譜相似度質譜相似度 OV-101柱柱 PEG 20M