1、蛋白質工程（課程論文）題目名稱：蛋白質組學技術的研究進展及應用所在學院：生命科學與技術學院專業（班級）：生技131班學生姓名：梁健授課教師：韓曉菲蛋白質組學技術的研究進展及應用生技131班 梁健 13772025摘要：隨著人類基因組計劃全部測序的初步完成，研究重點轉到對基因功能的研究上。蛋白質作為基因功能 的主要體現者，對其表達模式和功能的研究成為熱點，出現了蛋白質組學。研究蛋白質組學有助于了解蛋白的結構、細胞的功能、生命的本質及活動規律，為疾病的診斷、治療、疫苗及新藥開發提供科學依據。關鍵詞：蛋白質組學；進展；應用蛋白質組學(proteomics)是產生于20世紀90年代中期的一門新興學科，

2、以細胞內全部蛋白質的存在及其活動方式為研究對象，是后基因組時代生命科學研究的核心內容。蛋白質組學的產生與發展經歷了一個漫長的過程，在這個過程中，研究者不斷修正蛋白質組學的發展方向和推進蛋白質組學相關支撐技術的快速發展，進而拓展蛋白質組學在整個生命科學和生物醫學研究中的應用，成為后基因組時代重要的研究新領域，并成功地應用到基礎研究及醫學研究等各個領域，推進其迅速發展。1 蛋白質組學的概念及研究內容1.1蛋白質組學的概念蛋白質組(proteome)源于protein和genome兩詞的雜合，最早是由澳大利亞的WILKINS等于1995年提出，其定義為“一種基因組所表達的全部蛋白質”。早期相對狹義的

3、蛋白質組的概念是指在某一特定的時間和空間條件下，1個細胞的基因組所表達的蛋白質數目的總和。隨著研究的深入，人們提出了廣義的蛋白質組的概念，用來描述1個細胞、組織、器官或1個物種的生命個體，在其不同的生存及發育條件下所表達的各種蛋白數目的總和。所以蛋白質組所含的蛋白數目及其表達量是隨著時間和空間的不同而不斷發生變化的。蛋白質組學最有價值的優勢是它可以觀察在特定的時間下一個完整的蛋白質組或蛋白亞型在某種生理或病理狀態中，發生的相應的變化。1.2 研究內容根據研究內容的不同，蛋白質組學可分為差異蛋白質組學(或稱表達蛋白質組學)、結構蛋白質組學和功能蛋白質組學，其中差異蛋白質組學在蛋白質組學研究中十分

4、常用且應用廣泛。差異蛋白質組學主要是研究比較在2種或多種不同條件下蛋白質組表達的差異變化。結構蛋白質組學主要是蛋白質表達模式的研究，包括蛋白質氨基酸序列分析及空間結構的解析。蛋白質表達模式的研究是蛋白質組學研究的基礎內容，主要研究特定條件下某一細胞或組織的所有蛋白質的表征問題。功能蛋白質組學主要是蛋白質功能模式的研究，包括蛋白質的功能和蛋白質間的相互作用。蛋白質的功能模式的研究是蛋白質組學研究的最終目標，目前主要集中于研究蛋白質相互作用和蛋白質結構與功能的關系，以及基因的結構與蛋白質的結構功能的關系。對蛋白質組成的分析鑒定是蛋白質組學中與基因組學相對應的主要部分，它要求對蛋白質進行表征即對所有

5、蛋白質進行分離、鑒定及圖譜化。蛋白質間的相互作用主要包括以下幾類：分子和亞基的聚合；分子雜交；分子識別；分子自組裝；多酶復合體。而分析一個蛋白質和已知功能的蛋白質相互作用是研究其功能的重要方法。2 蛋白質組學的研究進展蛋白質組學研究的首要任務是建立獲取和分析蛋白質的常規、可靠、有效的技術。為達到這一要求，就需要樣品準備、數據獲取標準化及自動化，也就是要有可重復的高通量的技術。蛋白質組研究的技術手段在不斷完善，其工作流程是多步驟進行，包括蛋白質樣本的制備、分離、定量及鑒定。由雙向凝膠電泳、質譜技術、酵母雙雜交系統、蛋白質微陣列技術、能進行大規模數據處理的計算機系統和軟件、軟電離技術及生物信息學技

6、術等構成了蛋白質組學研究的主要技術體系。2.1 雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳 2D-PAGE是比較蛋白質組中蛋白表達量變化最常用的蛋白分離技術。傳統的2D-PAGE最初是由OFarrell、Klose 及Scheele等于1975年分別建立起來的。此法可分離上千種蛋白，并可同時比較蛋白表達量的差異；可根據蛋白等電點(isoelectric point，pI)及分子質量的差別，有效地分離理化性質不同的蛋白，并可 同時進行定性和定量分析；可區分磷酸化及非磷酸化蛋白或某些經過翻譯后加工修飾的蛋白。2D-PAGE主要分為2步，第1步等點聚焦采用pH梯度膠根據蛋白等電點的不同進行電泳分離；第2步SDSPAGE

7、電泳則是根據蛋白分子質量的差異進行蛋白分離。2D-PAGE法的不足之處在于：仍主要依賴許多手工操作、費時、自動化程度不高；樣品上樣量有限，不易分析蛋白含量很低的臨床樣本；對某些高疏水性蛋白(如細胞膜蛋白)分離效果差；對表達量較低的蛋白(<1000拷貝數)、極酸性(pI<3) 或極堿性(pI<10)的蛋白檢測均不理想；某些蛋白斑點中可能含有等電點和分子質量極為接近的數種蛋白，會給數據分析帶來困難；還有一些蛋白由于分子質量太大(>150 ku)或太小(<10 ku）容易在分離過程中被丟失，會增大蛋白質組重復性分析的誤差。通過首先分離純化亞細胞器，然后富集其中的蛋白或蛋

8、白復合物可降低蛋白質組的復雜程度、提高蛋白檢測的靈敏度，并有助于了解蛋白在細胞內的定位分布等。采用免疫學方法去除樣本中的高豐度蛋白，也會有利于低豐度蛋白的檢出。盡管2D-PAGE法仍存在著一些局限，但由于其方法簡便、分辨率高，目前仍是分離蛋白質組的重要手段之一。為進一步提高2DPAGE的靈敏度、分辨率及重復性，Unlii等建立了雙向熒光差異凝膠電泳法(two-dimensional difference in-gel electropho- resis，2D-DIGE)。這種方法用不同的熒光染料標記所要比較的蛋白質組樣品，在同一塊電泳膠上分離，并定量比較表達量有差異的蛋白，具有重復性好、靈敏度

9、高及能與質譜聯用鑒定蛋白質等優點。但其缺點是難以對多個蛋白質組同時進行比較，而且由于試驗儀器、分析軟件、檢測試劑等相對昂貴，不利于普及。2.2 質譜質譜是鑒定蛋白的最常用技術。20世紀初期英國物理學家Thomson等的工作奠定了質譜分析的基礎，Thomson并因此獲得了1906年的諾貝爾物理學獎。最初的質譜僅能分析揮發性小分子物質，隨著離子化技術的出現，使質譜測定極性強、難揮發的生物蛋白大分子得以實現。質譜分析目前已成為鑒定蛋白最常用的核心技術，具有快速、靈敏、重復性好、自動化程度高等特點。值得指出的是質譜技術不是直接分析完整的、未經 裂解的蛋白分子，而主要是分析經特異的蛋白酶(如胰酶)水解后

10、得到的肽段混合物。質譜分析的主要步驟包括樣品氣化、分離、檢測 及數據處理等。其原理是將所要分析的樣品在離子化裝置內從分子形式轉化為氣態離子，然后根據不同離子間的質荷比(mass-to- chargeratio，m/z)差異來確定離子化分子的相對質量，從而獲得1個蛋白或多肽的分子質量。不同的蛋白分子有其固有的分子質量，每個蛋白分子的氨基酸組成、序列及翻譯后修飾方式的不同都可通過蛋白的分子質量反映出來。因此對組成蛋白的多肽或氨基酸的分子質量測定就是對蛋白的結構、性質及種類的分析與鑒定。質譜主要用于分析蛋白質組中蛋白的種類或蛋白復合物的組成、對蛋白進行定性定量、研究蛋白之間的相互作用、測定蛋白翻譯后

11、加工修飾的方式等。串聯質譜可用來測定蛋白肽段的氨基酸序列，主要是先用特異的蛋白內切酶水解蛋白樣品，對產生的特征性肽段的質量進行質譜測定后，再將某一特定質荷比的肽段離子化，并做進一步的質譜分析。通過將質譜測定結果與蛋白多肽數據庫中已知蛋白肽段的序列進行比較，就可判定被測肽段的序列對應的蛋白序列。因此，可以說完整、準確的蛋白生物信息數據庫是完成質譜鑒定蛋白分子全序列所必需 的。此外，MS/MS還可用來鑒定蛋白翻譯后的修飾位點，如磷酸化、糖基化、甲基化及乙酰化位點等。目前，傳統的Edman降解測序法已基本上被質譜法所取代，如今質譜法已成為大規模蛋白測序的主要工具。質譜除了可用于測定蛋白或肽段的序列，

12、還可進行蛋白定量分析，常用的方法有：同位素標記親和質譜、同位素標記相對及絕對定量質譜、細胞培養穩定同位素標記氨基酸質譜及絕對蛋白定量質譜等。質譜分析目前只能分離氣態化的離子，蛋白消化不完全或肽段離子化不充分均會導致質譜分析出現假陰性的結果。尤其是當2種蛋白的氨基酸序列差異很小時，質譜也很難準確地將它們區分鑒定。細胞膜蛋白的水溶性差，與胞漿蛋白相比其含有的胰酶裂解位點較少，酶解后產生的疏水性肽段不易分離，因此質譜分析通常只能鑒定出一部分膜蛋白，難以全面客觀地反映出某一蛋白質組中膜蛋白的真實數量。另外，細胞內不同蛋白之間表達量差異很大，而且目前蛋白質還不能像DNA分子那樣被擴增，因此高表達量的蛋白

13、易被檢出，而低豐度蛋白則易被漏檢，如采用質譜技術來系統地分析組織、血清或其他體液的蛋白質組仍有一 定的困難。因此如何完整精確地檢測出蛋白質組中的所有蛋白，是目前質譜分析所面臨的一個巨大挑戰。2.3酵母雙雜交系統酵母雙雜交系統是由Fields等(1989)首先報道，主要用于研究蛋白之間的相互作用。其工作原理是基于酵母基因的啟動子序列可被轉錄激活因子所識別，從而誘導位于啟動子下游的報告基因表達。真核細胞的許多轉錄激活因子含有2個功能區：一個是DNA結合區，能與啟動子序列結合；另一個是激活區，能活化啟動子。僅含有DNA結合區或啟動子激活區的蛋白均無法激活啟動子，所以位于啟動子下游報告基因的表達為陰性

14、。可構建表達DNA結合區與誘餌蛋白Y融合的載體，同時構建表達啟動子激活區與獵物蛋白Z 融合的載體，然后將它們同時引入含有特定啟動子和報告基因的酵母細胞中，使它們在一個細胞內同時表達以上2種融合蛋白。若蛋白Y與Z之間能相互作用，則啟動子會被激活，誘導其下游報告基因的表達，因此通過檢測報告基因是否表達，就可推斷蛋白Y與Z之間是否存在著相互作用的關系。2H系統可用來研究多種未知蛋白與一個已知蛋白間的相互作用。這一系統具有高通量、便于自動化等優點，可廣泛用于大規模研究細胞內蛋白之間的相互作用。其主要缺點是容易出現假陽性和假陰性，陽性結果常需要采用其他方法像pulldown免疫共沉淀來進一步驗證，而假陰

15、性結果則可能是由于人的某些蛋白在酵母細胞內易于降解或不能進行正常的折疊所致。另外傳統的Y2H系統只能檢測位于細胞核內的蛋白問的相互作用，難以研究膜蛋白或細胞漿內蛋白間的相互作用。為了克服其局限性，Snider等(2010)建立了膜酵母雙雜交系統(membraneY2H)來檢測膜蛋白與膜蛋白或膜蛋白與細胞漿蛋白之間的相互作用。2.4生物信息學蛋白質組數據庫是蛋白質組研究水平的標志和基礎。瑞士的SWISS-RPOT擁有目前世界七最大、種類最多的蛋白質組數據庫。生物信息學的發展已給蛋白質組研究提供了更方便、有效的計算機分析軟件；特別值得注意的是，蛋白質質譜鑒定軟件和算法發展迅速，如SWISSPROT

16、、Rockefeller大學、UCSF等都有自主的搜索軟件和數據管理系統。最近發展的質譜數據直接搜尋基因組數據庫使得質譜數據可直接進行基因注釋、判斷復雜的拼接方式。基因組學的迅速推進，會給蛋白質組研究提供更多更全的數據庫。另外，對肽序列標記的從頭測序軟件也十分引入注目。2.5 蛋白質微陣列技術 DNA微陣列技術并非蛋白質組技術的范疇，但是卻不失為大規模研究蛋白質功能的一種好方法。通常在轉錄中受到協同調控的基因將編碼同種功能的蛋白質，如果某一段DNA序列與已知功能的DNA序列在很大程度上相同，說明它們編碼的蛋白質的功能也可能相同，例如酵母細胞中與細胞分裂周期和芽孢形成相關的基因可能編碼功能相同的

17、蛋白質。蛋白質微陣列技術已經發展起來，蛋白質樣品以納升小滴共價吸附在玻璃、硅、塑料等載物片上，每一個載物片可以點10000個樣品，可用于鑒定一個生物有機體的全部修飾酶。例如：蛋白質微陣列技術已經檢測出酵母中近乎全套的蛋白激酶。微陣列正被廣泛利用調查包括植物生理時鐘、植物防衛及對環境的壓迫力反應、水果成熟、植物光敏色素的信號、種子發芽等生物學的爭議范圍。3 蛋白質組學的應用蛋白質組學可用于研究與生命科學有關的許多領域，如基礎醫學、臨床醫學、生物醫學及醫藥工業等。研究蛋白質組學有助于發現疾病的生物標志分子，在疾病的鑒別診斷、治療、疫苗研制、藥效分析及新藥開發等領域有著廣闊的發展前景。3.1蛋白質組

18、學在基因組學研究方面的應用 目前僅從DNA序列很難正確推斷出所有人類基因的結構及其編碼蛋白的能力，這主要是由于當今的生物信息學手段還不能準確無誤地預測所有人類基因的外顯子和內含子結構。盡管不少生物物種的全基因組序列已了解清楚，但目前的生物信息學軟件仍不能百分之百地準確預測真核細胞基因編碼的蛋白的開放閱讀框架(open reading frames，ORFs)，人類基因組中一些沒有明顯ORFs的區域仍可能有編碼蛋白的功能。如通過質譜分析鑒定出一些肽段定位于一個以前認為沒有蛋白編碼功能的區域，這些信息將會有助于幫助進一步分析位于此區域的特殊 的基因結構，通過研究蛋白質組的表達可驗證基因組中的某些O

19、RFs是否真正具有編碼蛋白的能力。利用蛋白質組學的信息反過來標注基因組中基因結構的研究方法被稱為蛋白質基因組學(proteo-genomics)。蛋白的表達可用來幫助驗證某一基因的存在，因此蛋白質組學能有助于分析確定基因組中具有編 碼蛋白功能的全部基因數目及與之對應的蛋白功能。發現新的蛋白有助于提出新的試驗假設及確立新的試驗方向。經蛋白質組學研究發現蛋白表達有差異后，一般還需要其他方法進一步確證。對感興趣的蛋白可通過 RNA干擾來降低基因的mRNA表達水平來進行功能分析。也可將編碼蛋白的基因從小鼠基因組中敲除，產生基因缺陷型小鼠，然后觀察編碼蛋白的基因缺失后對小鼠的影響。3.2 在疾病研究中的

20、應用 蛋白質組學在疾病研究中的應用主要是發現新的疾病標志物，鑒定疾病相關蛋白質作為早期臨床診斷的工具，以及探索人類疾病的發病機制與治療途徑。人類許多疾病如腫、神經系統疾病、心腦血管疾病、感染性疾病等均已從蛋白質組學角度展開了深入研究，并已取得了進展。目前對疾病特別是腫瘤的早期標志蛋白分子(Biomarker)的篩選已在世界范圍內形成熱潮。HUANG等人對動脈粥樣硬化大鼠左心室做雙向電泳分析，與正常對照相比，共檢測到38個蛋白質點發生變化，并鑒定出12種蛋白質，分別歸屬于肌凝蛋白、酶、細胞信號轉導蛋白、轉運蛋白以及其他類型。在神經系統疾病中，阿爾茨海默氏病(Alzheimer disease，A

21、D)是最常見的一種癡呆性疾病，嚴重危害老年人的健康。PASINETTI等人利用cDNA微陣列發現AD病人大腦皮質某些基因產物的表達發生改變，后來，他們進行的一系列平行的高通量蛋白質組研究證實了這一結果，并發現突觸活動中的蛋白質表達在AD早期也有改變。3.3 蛋白質組學在新藥研發方面的應用蛋白質組學還可用于研究與藥物相互作用的受體，大多數藥物作用的受體是蛋白分子，因此某些蛋白表達水平的改變與藥物作用存在著直接或間接的關系。比較藥物治療前后蛋白質組表達的差異可用來評估藥物的療效及副作用、篩選高活性的藥物組分。研究蛋白表達水平的變化還將有助于發現新的藥物靶位、闡明藥物的作用機制、建立新藥開發的基礎。

22、4 小結蛋白質組學的研究在后基因組時代的獨特作用已顯現，是大規模、高通量系統性研究細胞、組織及生物個體內蛋白質組的結構與功能不可缺少的一門新興學科。蛋白質組學的研究得益于基因組學的研究，也離不開蛋白分離鑒定技術及生物信息學的更新與發展。蛋白質組學與基因組學、轉錄組學、代謝組學和生物信息組學等領域的相互促進和滲透，將為進一步揭示生命現象的活動本質和規律提供堅實的科學基礎。深入研究蛋白質組學將有助于了解蛋白結構與功能的關系、蛋白之間相互作用的關系，而且對揭示疾病的發病機制、篩選疾病的分子標志物和藥物靶位，對疾病的早期診斷、治療及新藥和疫苗的開發均具有重要意義。參考文獻：1 王英超 , 黨源 , 李

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